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Biology

गैप junctional कहनेवाला संचार: एक कार्यात्मक Biomarker विषैले पदार्थ और विषाक्त पदार्थों के प्रतिकूल प्रभाव का आकलन करने के लिए, और स्वास्थ्य प्राकृतिक उत्पादों के लाभ

Published: December 25, 2016 doi: 10.3791/54281
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

Summary

इस प्रोटोकॉल एक छुरी लोड हो रहा है फ्लोरोसेंट डाई हस्तांतरण तकनीक है कि अंतर जंक्शन चैनलों के माध्यम से कहनेवाला संचार उपायों का वर्णन है। गैप junctional कहनेवाला संचार एक प्रमुख सेलुलर प्रक्रिया है जिसके द्वारा ऊतक homeostasis बनाए रखा है और इस सेल संकेतन के विघटन स्वास्थ्य के प्रतिकूल असर पड़ता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल एक छुरी लोड हो रहा है फ्लोरोसेंट डाई हस्तांतरण (SL-डीटी) तकनीक है कि अंतर जंक्शन चैनलों के माध्यम से कहनेवाला संचार, जो एक प्रमुख कहनेवाला प्रक्रिया है जिसके द्वारा ऊतक homeostasis बनाए रखा है उपायों का वर्णन है। खाई जंक्शनल कहनेवाला संचार (GJIC) विषैले पदार्थ, जहर, दवाओं, आदि द्वारा की रुकावट कई स्वास्थ्य के प्रतिकूल प्रभाव से जोड़ा गया है। कई आनुवंशिक आधारित मानव रोगों की खाई जंक्शन जीन में उत्परिवर्तन से जोड़ा गया है। SL-डीटी तकनीक कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में GJIC के एक साथ मूल्यांकन के लिए एक सरल कार्यात्मक परख है। परख संक्षेप में कोशिकाओं की आबादी के माध्यम से एक छुरी ब्लेड के साथ कोशिका झिल्ली perturbing द्वारा एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ पहले से लोड हो रहा है कोशिकाओं शामिल है। फ्लोरोसेंट रंजक तो एक निर्दिष्ट समय के लिए पड़ोसी कोशिकाओं को खाई जंक्शन चैनलों के माध्यम से पार करने के लिए अनुमति दी है। परख तो कोशिकाओं को formalin के अलावा द्वारा समाप्त होता है। Fluo के प्रसारकोशिकाओं की आबादी के माध्यम से rescent डाई एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ मूल्यांकन किया है और छवियों morphometric सॉफ्टवेयर संकुल है कि उपलब्ध हैं, सार्वजनिक डोमेन पर पाया मुफ्त सॉफ्टवेयर संकुल सहित के किसी भी संख्या के साथ विश्लेषण कर रहे हैं। यह परख भी vivo अध्ययन में इलाज जानवरों से विभिन्न अंगों से ऊतक स्लाइस का उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। कुल मिलाकर, SL-डीटी परख इन विट्रो औषधीय और विषाक्तता की जरूरत है की एक विस्तृत श्रृंखला की सेवा कर सकते हैं, और संभवतः एक कम समय में अधिक नमूनों को स्पष्ट करने के लिए स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और विश्लेषण के साथ उच्च throughput सेट-अप की व्यवस्था के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य यौगिकों के संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए एक सरल, व्यापक और अपेक्षाकृत सस्ती तकनीक प्रदान करना है। यह इन विट्रो दृष्टिकोण है कि कई सेल लाइनों में इस्तेमाल किया जा सकता है। स्टैंडर्ड कोशिका जीव विज्ञान epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित प्रयोगशालाओं इस परख का उपयोग कर अनुसंधान कर सकते हैं।

हमारे सेल कार्यों का बुनियादी ज्ञान में इन विट्रो bioassays पर अत्यधिक निर्भर हो गया है, और फार्मास्यूटिकल्स, पर्यावरण प्रदूषण, और भोजन का जन्म प्रदूषणों से विषाक्तता के मूल्यांकन में एक आवश्यक घटक बन गया है। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई भी इन विट्रो bioassay प्रणाली है कि व्यापक सभी विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए मांग को पूरा कर सकते हैं। इन विट्रो assays में कई बनाया गया है और मूल्यांकन करने के साथ ही एक विशिष्ट जैव रासायनिक या आणविक समापन बिंदु का आकलन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। ये अक्सर एक उच्च throughput एक की गड़बड़ी को प्रतिबिंबित करने के लिए स्थापित में संयुक्त रहे हैंऐसे एस्ट्रोजन रिसेप्टर संकेत 1 के रूप में कुछ संकेत पारगमन मार्ग,। यह रणनीति काफी सफल रहा है, लेकिन संकेत पारगमन जीन अभिव्यक्ति में शामिल रास्ते के व्यापक संख्या काफी जटिल आकलन करने के लिए एक विशिष्ट संकेतन मार्ग चुनने का काम करता है। उच्च के माध्यम से डाल प्रोटोकॉल वर्तमान में विकसित की है और एक साथ कई संकेत दे रास्ते, जो एक दृष्टिकोण एकल assays की सीमाओं से कुछ दूर करने के लिए किया गया है मापने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। हालांकि, सभी संकेत दे रास्ते सफलतापूर्वक अधिक व्यापक दृष्टिकोण में शामिल किया गया है, के साथ साथ नए संकेत दे रास्ते लगातार की खोज की जा रही हैं और आगे पेचीदा है कि इस आकलन की प्रक्रिया। विशेष रूप से उच्च के माध्यम से डाल प्रणाली, इन विट्रो दृष्टिकोण के व्यापक संख्या का उपयोग करना, के लिए व्यापक विषाक्तता आकलन भी बहुत महंगे हैं और सबसे एकल अन्वेषक के लिए अनुकूल नहीं हैं अनुसंधान परियोजनाओं का नेतृत्व किया।

GJIC एक प्रक्रिया है छूतhtly वोल्टेज में परिवर्तन, कैल्शियम एकाग्रता, पीएच, redox संतुलन, प्रमुख intracellular संकेत पारगमन मार्ग और झिल्ली और cytoskeleton प्रोटीन 2,3 के साथ बातचीत के द्वारा विनियमित द्वारा नियंत्रित किया। इस प्रकार, GJIC के निषेध सेलुलर तनाव के विभिन्न प्रकार, विभिन्न सेलुलर कार्यों के विघटन, या अलग अलग संकेत पारगमन मार्ग की perturbations प्रतिबिंबित कर सकते हैं। एक और दृष्टिकोण सीमित संकेत पारगमन bioassays के उपयोग से उबरने के लिए जैविक घटना का लाभ लेने के लिए है कि कई, नहीं तो सबसे अधिक है, संकेत पारगमन मार्ग आगे सहकारी कहनेवाला सिगनल सिस्टम के द्वारा की खाई जंक्शन चैनलों के माध्यम से 4-8 संग्राहक रहे हैं। हालांकि कहनेवाला सिगनल सिस्टम भी कई और कई मार्ग नियंत्रण में हैं, अंतर जंक्शन चैनलों के माध्यम से कहनेवाला संकेतन अंततः चैनलों के एक समारोह में खोला जा रहा है, आंशिक रूप से बंद या पूरी तरह से बंद है। यह एक समापन बिंदु है कि आसानी से विभिन्न उपयोग करके मापा जा सकता हैइन विट्रो bioassay सिस्टम 7 में। यह देखते हुए कि एक ऊतक के होमियोस्टैटिक सेट बिंदु खुला चैनलों की आवश्यकता है, अंतर junctional कहनेवाला संचार पर यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण (GJIC) यौगिकों 4,8 के संभावित विषाक्त प्रभाव का निर्धारण करने में एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण है। संक्षेप में, यह महत्वपूर्ण जैविक घटना है कि कई संकेत पारगमन घटनाओं जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के समन्वय में एक केंद्रीय भूमिका निभाता विषाक्त प्रभाव की एक व्यापक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, bioassays कि GJIC आकलन यौगिकों के जहरीले क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट शुरुआती बिंदु हैं।

सबसे व्यापक GJIC आकलन करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक एक फ्लोरोसेंट जांच के साथ कोशिकाओं preloading और फिर लोड सेल या सन्निकट कक्षों के लिए कोशिकाओं से डाई के पलायन की निगरानी पर आधारित हैं। डाई प्रीलोड करने के लिए तकनीक microinjection 9 शामिल किया गया है, परिमार्जन जांच 11 की लोडिंग 10, और मिथाइल एस्टर 10 द्वारा विकसित हस्तांतरण परख डाई। बल्कि और अधिक आक्रामक परिमार्जन की तुलना में, इस रिपोर्ट की छुरी लोडिंग विधि कोशिकाओं है कि आक्रामक नुकसान को कम (चित्रा 1) की एक monolayer के माध्यम से एक दौर ब्लेड के साथ एक छुरी के एक सज्जन रोल करना शामिल है। इस तकनीक के फायदे microinjection परख के एकल कक्षों के बजाय कोशिकाओं की आबादी की विषाक्तता मूल्यांकन कर रहे हैं। इसके अलावा, इस परख की सादगी जबकि Microinjection तकनीक और तकनीकों है कि फ्लोरोसेंट जांच की मिथाइल एस्टर का उपयोग का उपयोग तरीकों में काफी अधिक समय लगता है और काफी उच्च स्तर के कौशल की आवश्यकता होती है एक कम समय में कई प्लेटों के तेजी से पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

हालांकि GJIC का अध्ययन करने की सभी जरूरतों को पूरा करने के लिए कोई भी विधि है; SL-डीटी परख एक सरल, काफी सस्ती और बहुमुखी परख है कि कर सकते हैंविभिन्न यौगिकों की विषाक्तता के प्रारंभिक आकलन के लिए जरूरत के कई मिलते हैं। प्रमुख लाभ में शामिल हैं: सादगी, कि photobleaching (FRAP) परख और आणविक फ्लोरोसेंट जांच assays, एक बड़े में GJIC की एक तेजी से और एक साथ मूल्यांकन के स्थानीय सक्रियता के बाद इस तरह के microinjection, फ्लोरोसेंट वसूली के रूप में अन्य तरीकों के लिए आवश्यक हैं उपकरण या कौशल के लिए कोई विशेष जरूरत कोशिकाओं की संख्या, एक उच्च throughput में विवो के अध्ययन के लिए स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और विश्लेषण, साथ ही इसकी अनुकूलन क्षमता के साथ सेट-अप के लिए अनुकूल।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल पशु की देखभाल और जापान के स्वास्थ्य विज्ञान, जो जहां इन विवो प्रयोगों किया गया था, के राष्ट्रीय संस्थानों के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था विश्वास दिलाता हूं कि चूहों नम्रता और पीड़ा के उन्मूलन के लिए सम्मान के साथ इलाज किया गया।

1. SL-डीटी Bioassay

  1. बीज 3 एक्स 10 5 WB-F344 चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं पर 35 मिमी व्यास संस्कृति ईगल्स युक्त प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस, 100% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच), 5% से कम एक मशीन में मध्यम प्लस 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, और संस्कृति की कोशिकाओं को संशोधित सीओ 2।
  2. संस्कृति कोशिकाओं जब तक वे 100% संगम (आमतौर पर, 2 दिन) तक पहुँचने और नीचे के रूप में वर्णित कोशिकाओं के वांछित प्रयोगात्मक उपचार आचरण।
    1. आचरण खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों
      1. 10 μl और 100% acetonitrile और 4 μl, 6 μl में phenanthrene की एक 2 मिमी स्टॉक समाधान के 20 μl, और phenan की एक 20 मिमी शेयर समाधान के 8 μl जोड़ेशेयर समाधान के प्रत्येक जोड़ा मात्रा के लिए मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर युक्त कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile में threne।
      2. 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl, और acetonitrile समाधान के प्रत्येक जोड़ा मात्रा वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए विकास के माध्यम से 2 मिलीग्राम से युक्त कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए acetonitrile की एक 100% समाधान के 20 μl जोड़ें।
      3. एक मशीन 37 डिग्री सेल्सियस, 100% आरएच और 5% सीओ 2 पर सेट में 15 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं।
      4. कदम के लिए 1.3 से आगे बढ़ें।
    2. आचार समय प्रतिक्रिया प्रयोगों
      1. हर समय बिंदु (यानी, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 मिनट) के लिए विकास के माध्यम से 2 मिलीग्राम से युक्त कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile में phenanthrene की एक 20 मिमी शेयर समाधान के 7 μl जोड़ें।
      2. मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर युक्त हर समय बिंदु वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile के 7 μl जोड़ें।
      3. प्रत्येक निर्दिष्ट समय पी के लिए प्लेटें सेते37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में oint, 100% आरएच और 5% सीओ 2।
      4. कदम के लिए 1.3 से आगे बढ़ें।
    3. आचरण समय वसूली प्रयोगों
      1. 15 मिनट के लिए मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर युक्त कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile में phenanthrene की एक 20 मिमी शेयर समाधान के 7 μl जोड़ें।
      2. 15 मिनट के लिए मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर युक्त वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile के 7 μl जोड़ें।
      3. या तो phenanthrene या acetonitrile युक्त मध्यम छानना और (पीबीएस) फॉस्फेट बफर खारा के 3 मिलीलीटर के साथ 3x प्रत्येक कुल्ला।
      4. वांछित वसूली बार (यानी, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 मिनट) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में, 100 के लिए एक थाली के लिए ताजा मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर जोड़ें और सेते % आरएच और 5% सीओ 2।
      5. कदम के लिए 1.3 से आगे बढ़ें।
    4. आचार तंत्र प्रयोगों
      1. संकेत पारगमन अवरोध जोड़ें, यानी
      2. 15 मिनट के लिए मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर युक्त वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile के 5 μl जोड़ें।
      3. एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए मध्यम विकास के साथ साथ D609 के 2 मिलीलीटर युक्त कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile में phenanthrene की एक 20 मिमी शेयर समाधान के 7 μl जोड़ें।
      4. एक अतिरिक्त 15 वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए मिनट के लिए मध्यम विकास के साथ साथ 100% acetonitrile के 2 मिलीलीटर युक्त कोशिकाओं के तीन प्लेटों के लिए 100% acetonitrile के 7 μl जोड़ें।
      5. कदम के लिए 1.3 से आगे बढ़ें।
  3. या तो धीरे मध्यम बंद गिरने से या वैक्यूम सक्शन द्वारा संस्कृति के माध्यम से त्यागें।
    नोट: उचित रूप से खतरनाक अपशिष्ट युक्त संस्कृति के माध्यम फेकें।
  4. कोशिकाओं पीबीएस के 3 मिलीलीटर और या तो छानना या महाप्राण betwee के साथ प्रत्येक तीन बार कुल्लाn rinses।
  5. पिपेट 1 1 मिलीग्राम की मिलीग्राम / लूसिफ़ेर पीला डाई प्रत्येक कोशिका की थाली में पीबीएस (LY) में भंग मिलीलीटर।
  6. धीरे थाली के तीन अलग-अलग क्षेत्रों में कोशिकाओं की आबादी के माध्यम से एक गोल की बढ़त के साथ एक # 20 सर्जिकल इस्पात ब्लेड रोलिंग द्वारा कोशिकाओं में डाई प्रीलोड करें।
    1. सीधा छुरी (90 डिग्री कोण) और संस्कृति की थाली के किनारे से 5 मिमी रखकर शुरू, और फिर 15 डिग्री (चित्रा 1 देखें) का एक कोण के बारे में यह सीधा कोण से छुरी रोल।
      नोट: यह तर्जनी और अंगूठे के बीच छुरी pinching द्वारा हासिल की है। गुरुत्वाकर्षण का प्रयोग करें (के रूप में गोल ब्लेड बस कोशिकाओं पर रोल) छुरी धीरे 15 डिग्री की स्थिति में 90 डिग्री से जाने के लिए अनुमति देने के लिए। इस प्रस्ताव एक नेत्रहीन ध्यान देने योग्य खरोज लाइन छोड़ देंगे।
  7. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए भंडारण समाधान के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  8. छानना या भंडारण aspirate और पीबीएस के 3 मिलीलीटर सभी extrace को दूर करने के साथ तीन बार कुल्लाllular बाह्य पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति समाप्त करने के लिए डाई।
  9. 10% फॉस्फेट बफर formalin समाधान के 0.5 मिलीलीटर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए जोड़ें।
    नोट: formalin में फिक्सिंग के बाद, हवा कोशिकाओं सूखी और भंडारण डाई की न्यूनतम photobleaching के साथ अप करने के लिए दो साल के लिए अंधेरे में दुकान। जब आवश्यक है, फ्लोरोसेंट डाई सामने कल्पना करने के लिए 10% formalin समाधान के साथ rehydrate।
  10. एक epifluorescence 200X के एक बढ़ाई 428/536 एनएम / उत्तेजना उत्सर्जन चोटियों के लिए एक dichroic घन के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग तय कोशिकाओं देखें। सभी प्लेटों संरेखित इतना है कि खरोज लाइन दृष्टि की क्षैतिज क्षेत्र के समानांतर है।
    नोट: एक FITC dichroic घन अच्छी तरह से काम करता है।
    1. एक सीसीडी कैमरा और समर्थन सॉफ्टवेयर के साथ छवि पर कब्जा है।
      1. सीसीडी कैमरे के लिए समर्थन सॉफ्टवेयर खोलें और ऑटो जोखिम के लिए सेटिंग्स का उपयोग करें। डिजिटल छवि प्राप्त करने के लिए "कब्जा" बटन का प्रयोग करें। "सहेजें" बटन का उपयोग करके फ़ाइलें .tif के रूप में छवि को बचाने।

    जिगर ऊतक के लिए SL-डीटी परख का अनुकूलन 2.

    1. लगभग एक 5 सप्ताह पुरानी, विच्छेदन कैंची पुरुष फिशर 344 चूहे का उपयोग करने से एक जिगर के बाईं पालि से एक 2 x 2 सेमी टुकड़ा निकालें और एक प्लास्टिक की प्लेट पर जगह गीला धुंध 12 के साथ कवर तौलना।
    2. पिपेट 0.5 से 1 मिलीग्राम से युक्त एक पीबीएस समाधान के मिलीग्राम / मिलीलीटर लूसिफ़ेर पीले और rhodamine-dextran (आरडी) प्लास्टिक में जिगर का टुकड़ा की सतह पर तौलना थाली में से प्रत्येक।
      नोट: आरडी एक डाई कि अंतर जंक्शन चैनलों को पार नहीं कर सकते हैं और कोशिकाओं है कि भरी हुई थी प्रतीक होगा है।
    3. तीन से पांच चीरों लगभग 1 सेमी जिगर का टुकड़ा एक तेज ब्लेड के साथ तौलना थाली में डाई समाधान है कि की सतह पर लंबे समय तक और फिर अतिरिक्त डाई चीरों को भरने के लिए पर्याप्त जोड़ें।
    4. प्लास्टिक की प्लेट का वजन पर कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ऊतक सेते हैं।
    5. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ तीन बार कुल्ला।
    6. ऊतक ove फिक्सकमरे के तापमान पर अंधेरे में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10% फॉस्फेट बफर formalin के 30 मिलीलीटर में rnight।
    7. अगले दिन, पानी से धो स्लाइस 1 एक्स 1 एक्स 0.5 सेमी 3 स्ट्रिप्स में कैंची विदारक साथ चीरा के आसपास ऊतक ट्रिम और फिर आयल 13 में स्लाइस एम्बेड करने के लिए मानक तकनीक का उपयोग करें।
    8. धारा 5 माइक्रोन की मोटाई के लिए चीरा रेखा को सीधा स्लाइस और तैयार है जब तक अंधेरे में नमूने की दुकान एक microtome 13 के साथ मानक सेक्शनिंग तकनीक का उपयोग imaged किया जाना है।
    9. एक epifluorescence खंड 1.10 7 के अनुसार कल्पना और फ्लोरोसेंट रंजक मोर्चों की छवियों पर कब्जा करने के लिए एक सीसीडी डिजिटल कैमरे से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

    3. बढ़ाता GJIC

    1. उपाय फ्लोरोसेंट डाई प्रसार एक morphometric सॉफ्टवेयर पैकेज (जैसे, ImageJ) का उपयोग।
      1. "फाइल" टैब पर क्लिक करें और फिर क्लिक करें खोलने के लिए "खुले"बचाया छवि।
      2. "नि: शुल्क हाथ उपकरण" उपकरण पट्टी टैब पर क्लिक करें में डाई सामने की रूपरेखा का पता लगाने के लिए।
      3. "विश्लेषण" टैब पर क्लिक करें और फिर क्लिक करें "उपाय"।
        नोट: यह एक फैल शीट, अगर वांछित है जो अन्य फैल शीट कार्यक्रमों में कॉपी किया जा सकता है में एक क्षेत्र मूल्य उत्पन्न होगा।
    2. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करना, नियंत्रण (एफ ओ सी) के अंश की गणना क्षेत्र डाई नियंत्रण की थाली में कूच निम्न समीकरण का उपयोग करके प्रयोगात्मक प्लेट में डाई प्रसार के क्षेत्र को विभाजित करके:
      Equation1
      एक ई = इस तरह के एक विशिष्ट खुराक या समय पर एक रसायन के साथ इलाज किया कोशिकाओं के रूप में एक प्रयोगात्मक चर के संपर्क में कोशिकाओं में डाई प्रसार के क्षेत्र
      एक सी = नियंत्रण में डाई प्रसार, जो ब्याज की रासायनिक भंग करने के लिए प्रयुक्त वाहन के साथ इलाज किया कोशिकाओं रहे हैं के क्षेत्र
      नोट: वाहन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए,एक ई वाहन द्वारा इलाज कोशिकाओं में डाई प्रसार के क्षेत्र होगा और एक सी वाहन से इलाज नहीं कोशिकाओं में डाई प्रसार के क्षेत्र होगा। वाहन के प्रभाव अधिमानतः 10% से कम होना चाहिए।

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Representative Results

GJIC की रुकावट बड़े पैमाने पर जीन नियंत्रण है कि स्वास्थ्य के प्रतिकूल प्रभावों को 14 लाती की nongenotoxic, epigenetic स्तर पर विषाक्त यौगिकों की पहचान के लिए एक बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, पॉलीसाइक्लिक सुरभित हाइड्रोकार्बन (PAHS) पर्यावरण के दूषित पदार्थों को सर्वव्यापी हैं, लेकिन उनके आणविक संरचना 15 के एक समारोह के रूप में उनके epigenetic विषाक्तता में भिन्नता है। कम आणविक वजन PAHs आम तौर पर सिगरेट का धुआँ 15,16 की है कि दूषित नदी तलछट के रूप में कई विविध वातावरण में उच्च आणविक भार PAHs की तुलना में अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता में पाए जाते हैं। Phenanthrene एक कम आणविक भार पीएएच है कि खाड़ी क्षेत्र कहा जाता है एक कोणीय जेब के साथ तीन बेंजीन के छल्ले के अधिकारी का एक उदाहरण है। चित्रा 2 WB-F344 चूहा जिगर उपकला phenanthrene की खुराक में वृद्धि के साथ इलाज किया कोशिकाओं के SL-डीटी छवियों की एक श्रृंखला है। नोट प्रवास ओ में कमीफ्लोरोसेंट रंजक, लूसिफ़ेर पीला, खुराक में वृद्धि के साथ एफ। स्कैन छवियों के क्षेत्रों नियंत्रण (एफ ओ सी) के एक अंश के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 2 के लिए नियंत्रण कक्षों विलायक के साथ व्यवहार कर रहे हैं कि पीएएच में भंग कर दिया गया है, अर्थात् acetonitrile। आमतौर पर SL-डीटी प्रयोगों प्रत्येक प्रयोगात्मक पैरामीटर के लिए तीन स्वतंत्र परीक्षणों की एक न्यूनतम है, जो इस प्रयोग में एक खुराक हो जाएगा के साथ प्रत्येक परीक्षण के लिए डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में किया जाता है। एफ ओ सी मूल्यों फिर औसत जा सकता है, सांख्यिकीय विश्लेषण किया है, और फिर रेखांकन (चित्रा 3 देखें)।

इसी तरह के प्रयोगों को भी नियमित GJIC का विषैला प्रेरित निषेध, और समय की अवधि GJIC के इस विषैला प्रेरित निषेध से उबरने के बाद कोशिकाओं को विषैला मुक्त मध्यम करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं की जरूरत के लिए समय की स्थापना के लिए आयोजित की जाती हैं। चित्रा 4 दोनों समय प्रतिक्रिया और निषेध से वसूली phenanthrene द्वारा (पता चलता हैपीएचई)। SL-डीटी परख भी अंतर्निहित तंत्र निर्धारित करने के लिए जो विषैला और विषाक्त पदार्थों से GJIC 4,16 dysregulate इस्तेमाल किया जा सकता है। यह विषैला या विष कि GJIC dysregulates के अलावा पहले एक चयनित संकेतन मार्ग की एक दवा अवरोध के साथ पूर्व incubating कोशिकाओं द्वारा किया जाता है। विषैला या विष नहीं रह गया है एक चयनित दवा है कि ब्लॉक एक संकेतन मार्ग है, तो इस मार्ग GJIC की एक नियामक मार्ग होने के लिए, चुना गया है, जबकि इस तरह के रास्ते की संभावना से इनकार किया जा सकता है, तो विषैला GJIC dysregulate करने के लिए जारी की उपस्थिति में GJIC dysregulates है। चित्रा 5 इस प्रमुख को दर्शाता है, जिसमें 1-methylanthracene (1-विदेश मंत्रालय), एक और तीन चक्राकार पीएएच कि GJIC रोकता है, लेकिन D609 की उपस्थिति है, जो phosphatidylcholine विशिष्ट phospholipase सी (पीसी-पीएलसी) के एक काफी विशिष्ट अवरोध करनेवाला है में नहीं है। इस प्रकार, पीसी-पीएलसी एक उम्मीदवार संकेत GJIC का 1-विदेश मंत्रालय प्रेरित निषेध में शामिल एंजाइम के रूप में शासन किया है। पीसी-पीएलसी की भूमिका च के साथ मान्य किया गया हैurther प्रयोग 4,16। कुल मिलाकर, SL-डीटी assays काफी मानचित्रण संकेतन कैसे विषैले पदार्थ और विषाक्त पदार्थों को बाधित (dysregulate) GJIC के तंत्र में शामिल नेटवर्क की प्रक्रिया शुरू करने के लिए अनुकूल हैं। यह दृष्टिकोण भी प्राकृतिक उत्पाद है कि GJIC dysregulating से एक विषैला या विष ब्लॉक कर सकते हैं के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, resveratrol के लिए, एक एंटीऑक्सीडेंट रेड वाइन और मूंगफली उत्पादों में उच्च सांद्रता में पाया GJIC (चित्रा 6) बाधा से 1-विदेश मंत्रालय को रोका जा सकता।

SL-डीटी परख जानवरों से ऊतक स्लाइस के लिए अनुकूलित किया गया है, विशेष रूप से जिगर 17 में। Perfluorooctanoic एसिड (PFOA) एक 8 कार्बन fluorinated फैटी एसिड एक लगातार पर्यावरण जिगर के कैंसर 12,17 प्रेरित करने के लिए जाना जाता है प्रदूषक है। SL-डीटी तकनीक का उपयोग करना PFOA इन विट्रो WB-F344rat जिगर मॉडल प्रणाली 18 में GJIC को बाधित करने के लिए दिखाया गया था। एक Vivo में अनुवर्ती अध्ययन Determined कि PFOA भी PFOA के साथ इलाज किया F344 चूहों के यकृत में GJIC हिचकते हैं, इस प्रकार इन विट्रो मॉडल प्रणाली 12,17 मान्य। चित्रा 7 वाहन और PFOA के साथ इलाज चूहों के जिगर के ऊतकों में डाई प्रसार दिखा इस अनुवर्ती प्रयोग से फ्लोरोसेंट छवियाँ हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: छुरी डाई लोड कदम के कार्टून छवि। दिखा रहा है कि छुरी लोड करने की प्रक्रिया क्षैतिज कोशिकाओं के माध्यम से टुकड़ा करने की क्रिया के रूप में सेल नुकसान को कम करने के लिए की तुलना में ब्लेड रोलिंग शामिल है बल्कि एक चित्रण।

चित्र 2
चित्रा 2: डाई के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट सूक्ष्म छवियों अंतराल जंक्शनों के माध्यम से फैल गया। WB-F344 चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं के साथ 15 मिनट के लिए इलाज किया गयाphenanthrene की खुराक बढ़ती है, एक प्रचलित पीएएच वातावरण में पाया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: phenanthrene इलाज WB-F344 चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं की खुराक प्रतिक्रिया वक्र। SL-डीटी छवियों के क्षेत्रों में गणना कर रहे थे और उसके बाद नियंत्रण है, जो वाहन (acetonitrile) के साथ इलाज कोशिकाओं थे के एक अंश के रूप में सूचना दी। प्रत्येक डेटा बिंदु तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एक औसत है और त्रुटि सलाखों के एक 15 मिनट जोखिम समय के बाद प्रत्येक खुराक के लिए 95% आत्मविश्वास सीमा पर मानक विचलन कर रहे हैं। एक चार पैरामीटर रसद समारोह डेटा बिंदुओं के माध्यम से लाइन फिट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सीएलआई कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ सी.के.।

चित्रा 4
चित्रा 4: phenanthrene इलाज WB-F344 चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं के समय और समय वसूली प्रतिक्रिया वक्र। जोखिम के 10 मिनट के बाद GJIC की पूरी निषेध के बाद, मध्यम युक्त phenanthrene (पीएचई) पीएचई मुक्त करने के लिए मध्यम बंद किया गया था और उसके बाद कोशिकाओं निषेध से वसूली के लिए निगरानी की गई। SL-डीटी छवियों के क्षेत्रों में गणना कर रहे थे और उसके बाद नियंत्रण है, जो वाहन (acetonitrile) के साथ इलाज कोशिकाओं थे के एक अंश के रूप में सूचना दी। प्रत्येक डेटा बिंदु तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एक औसत है और त्रुटि सलाखों के 95% विश्वास सीमा पर मानक विचलन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

her.within-पेज = "1"> चित्रा 5
चित्रा 5: GJIC का निषेध 1-methylanthracene द्वारा phosphatidylcholine विशिष्ट phospholipase सी 1-methylanthracene (1-एमईए) पर निर्भर है एक प्रचलित पीएएच वातावरण में पाया जाता है। बाएं पैनल वाहन के साथ इलाज किया कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं (acetonitrile, 0.35% वी / वी)। मध्यम पैनल WB-F344 चूहा जिगर उपकला 70 सुक्ष्ममापी 1-विदेश मंत्रालय के साथ 15 मिनट के लिए इलाज किया कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। सही पैनल 50 माइक्रोन के D609, एक phosphatidylcholine विशिष्ट phospholipase सी अवरोध करनेवाला के साथ 20 मिनट के लिए पहले pretreated कोशिकाओं, एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए 70 माइक्रोन के 1-विदेश मंत्रालय के अलावा द्वारा पीछा प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6: Resveratrol 1-methylanthracene द्वारा GJIC के निषेध को रोका। बाएं पैनल वाहन के साथ इलाज किया कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं (acetonitrile, 0.35% वी / वी)। Resveratrol एक एंटीऑक्सीडेंट रेड वाइन और मूंगफली उत्पादों में पाया जाता है। मध्यम पैनल 70 सुक्ष्ममापी 1-विदेश मंत्रालय के साथ 15 मिनट के लिए इलाज किया कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। सही पैनल पहले 50 सुक्ष्ममापी resveratrol एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए 70 माइक्रोन के 1-विदेश मंत्रालय के अलावा द्वारा पीछा के साथ 20 मिनट के लिए pretreated कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: नर एफ 344 चूहों से जिगर स्लाइस में GJIC के पूर्व vivo SL-डीटी assays। बाएं पैनल जिगर Tiss का एक टुकड़ा का प्रतिनिधित्व करता हैएक चूहे वाहन पर नियंत्रण, डाइमिथाइल sulfoxide, 24 घंटे के लिए के साथ इलाज से UE। सही पैनल 100 मिलीग्राम की intraperitoneal प्रशासन के बाद एक चूहे से जिगर ऊतक का एक टुकड़ा का प्रतिनिधित्व करता है / 24 घंटे के बाद perfluorooctanoic एसिड (PFOA) किलो। PFOA, एक प्रचलित पर्यावरण दूषित पदार्थों को, एक ट्यूमर को बढ़ावा देने peroxisome proliferator कि हिपेटोमिगेली लाती है और इन विट्रो मॉडल का उपयोग अंतराल जंक्शनों ब्लॉक करने के लिए प्रदर्शन किया है। चीरा लोड डाई वाहन और PFOA इलाज जानवरों से जिगर स्लाइस, जो तब, तय किया गया छंटनी और sectioned पर किया गया था। पर्यावरणीय स्वास्थ्य परिप्रेक्ष्य 12 से reproduced। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

SL-डीटी परख GJIC को मापने में एक सरल और बहुमुखी तकनीक है, लेकिन वहाँ कई महत्वपूर्ण चिंता है कि उचित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल डिजाइन करने में लिए जिम्मेदार होना चाहिए रहे हैं। GJIC के मजबूत माप SL-डीटी परख का उपयोग के लिए वहाँ कोशिकाओं के अंतराल जंक्शनों के माध्यम से भंडारण का एक अच्छा डाई प्रसार होना चाहिए। कम से कम, एक पर्याप्त समय विश्वास दिलाता हूं कि डाई दोनों दिशाओं में छुरी भरी हुई कोशिकाओं से कोशिकाओं के आठ या उससे अधिक पंक्तियों के माध्यम से फैलता है चुना जाना चाहिए। इसके अलावा, दूरी है कि डाई छुरी भरी हुई कोशिकाओं से पलायन की माप की आसानी के लिए, एक बढ़ाई कारक है कि आश्वासन दिया नियंत्रण प्लेटों की डाई प्रसार भरता दर्शन के क्षेत्र के 70 से 90% का चयन करें। WB-F344 चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं के लिए, भंडारण समाधान के साथ तीन मिनट ऊष्मायन डाई सामने चार सेल पंक्तियों से परे ले जाने के लिए पर्याप्त है, और 200X के एक बढ़ाई इष्टतम है। कोशिकाओं जो काफी Loadi को संशोधनीय है, 35 मिमी व्यास प्लेटों पर हो रहे हैंएक छुरी के साथ कोशिकाओं में डाई एनजी। हालांकि, कोशिकाओं छोटे कुओं में उगाया जा सकता है, लेकिन एक छुरी का उपयोग संभव नहीं है, विशेष रूप से 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में। छोटे कुओं के लिए, एक छोटे से दौर इत्तला दे दी काटने बढ़त है कि अच्छी तरह से में फिट कर सकते हैं, और फिर, एक रोलिंग कार्रवाई का उपयोग करें। यह रोलिंग कार्रवाई एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह न्यूनतम इनवेसिव है और कहा कि फटे और एक बड़ी सेल मुक्त खाई मूल scraping विधि के विशिष्ट बनाने जा रहा से कोशिकाओं को रोकता लोडिंग के एक बहुत साफ रेखा प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, एक एक्यूपंक्चर सुई जिसमें सुई का एक छोटा सा मोड़ कोशिकाओं में लोडिंग डाई का एक अच्छा काम करता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अन्य सेल प्रकार इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कक्षों के चयन और एक विशेष सेल प्रकार में GJIC की भूमिका को समझने उचित परिकल्पना और प्रयोगों के डिजाइन तैयार करने में महत्वपूर्ण है। पहली और सबसे स्पष्ट कदम सेल संस्कृति शर्तों, जिसमें कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों एक्सप्रेशंस हैं विकसित करने के लिए हैएसईडी। अच्छी तरह से भेदभाव प्रकार की कोशिकाओं, जो विशिष्ट चयापचय कार्यों प्रदर्शन में अंतराल जंक्शनों आम तौर पर सन्निहित कोशिकाओं के बीच समन्वय चयापचय मार्ग में एक भूमिका निभाते हैं। अच्छी तरह से विभेदित सेल प्रकार, सीमित है यदि कोई हो, proliferative क्षमता और चैनलों शायद एक ऊतक विशिष्ट चयापचय भूमिका है कि अक्सर आकृति विज्ञान और कोशिकाओं की विशिष्ट व्यवस्था पर निर्भर करता है खेलते हैं। उदाहरण के लिए, हृदय myocytes लम्बी कोशिकाओं जहां अंतराल जंक्शनों मुख्य रूप से intercalated डिस्क पर गठबंधन कर रहे हैं, इस प्रकार SL-डीटी विधि का उपयोग कोशिकाओं है, जो एक अंडाकार थाली में किया जा सकता है aligning की आवश्यकता होगी रहे हैं। इस प्रकार, सावधान विचार प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए किया जाना चाहिए। neuronal सेल संस्कृतियों के साथ अध्ययन आम तौर पर मिला हुआ नहीं कर रहे हैं और भी है जो इस्तेमाल किया जाना चाहिए SL-डीटी अनुचित और वैकल्पिक GJIC assays का उपयोग करता है विशिष्ट संपर्क अंक की आवश्यकता होती है।

ऐसी स्टेम और जल्दी पूर्वज कोशिकाओं के रूप में proliferative प्रकार की कोशिकाओं में, GJIC एक और महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैसमन्वय में सेल की घटनाओं है कि जीन अभिव्यक्ति mitogenic घटनाओं के विनियमन को नियंत्रित संकेत है। WB-F344 चूहा जिगर उपकला इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कोशिकाओं को इस श्रेणी में आता है। गैप जंक्शन जीन ऊतक विकास और रखरखाव 19-21 के दौरान महत्वपूर्ण हैं। हालांकि खाई जंक्शन चैनलों व्यक्त की और सभी सेल प्लाज्मा झिल्ली सतहों पर बनते हैं, proliferative कोशिकाओं के विकास के कारक है, जो GJIC को बाधित करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं। proliferative सेल प्रकार के लिए महत्वपूर्ण विचार आमतौर पर मीडिया की रचना करने के लिए और अधिक उन्मुख होते हैं। विकास के कारकों को विशेष रूप से अपरिभाषित भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम में, अतिरिक्त में अक्सर होते हैं, और 'कोशिकाओं अंतराल जंक्शनों एक बंद राज्य में हो सकता है। इन कोशिकाओं में GJIC स्थापित करने के लिए सबसे आसान तरीका कम करने या प्रयोग से पहले 4 24 घंटा के लिए सीरम का स्तर दूर करने के लिए है, हालांकि 24 घंटा कोई सीरम के साथ कोशिकाओं के लिए भी लंबे समय के रूप में वे apoptose होगा है। WB-F344 जिगर उपकला प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं टी में प्रस्तुतअपने पत्र पीढ़ी सीरम के स्तर को कम करने की कोई जरूरत के साथ सीरम के प्रति संवेदनशील नहीं हैं। इसके विपरीत, एक C10 माउस सेल लाइन का उपयोग कर प्रयोगों पहले सीरम GJIC 22 की स्थापना के लिए वंचित होना चाहिए। सीरम का स्तर दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच भिन्न हालांकि, दिलचस्प है, सी -10 कोशिकाओं को बहुत इसी तरह anthracene 22,23 के मिथाइल isomers को जवाब दिया।

गुणवत्ता के परिणामों के लिए अन्य कारणों से गैर साइटोटोक्सिक मात्रा में प्रयोगों का आयोजन शामिल हैं। कोशिकाओं को स्वस्थ रूपात्मक सेल प्रकार की उम्मीद से पहले और बाद में इलाज सुविधाओं का निर्धारण करने के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की जानी चाहिए। उस अंतराल जंक्शन समारोह पर एक यौगिक के प्रभाव का एक सामान्य साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया के कारण नहीं है आश्वस्त करने के लिए, प्रत्येक परिसर के लिए cytotoxicity assays के एक ही समय में किया जाना चाहिए और SL-डीटी परख में इस्तेमाल किया खुराक। प्रयोगों का आयोजन निर्धारित करने के लिए यदि GJIC पर एक परिसर के एक निरोधात्मक प्रभाव प्रतिवर्ती भी कम से कम दो कारणों के लिए एक अच्छा प्रयोग है। मोreversibly का परीक्षण सेंट यौगिकों को बाधित GJIC, लेकिन अगर वहाँ GJIC का कोई वसूली है, तो cytotoxicity हो सकता है एक कारक है और आगे की जांच के लिए आवश्यक होगा। हालांकि, अगर GJIC तो खुराक बहाल कर रहा है और जांच की समय थे शायद साइटोटोक्सिक नहीं। वहाँ GJIC की प्रतिवर्ती निषेध के लिए जैविक निहितार्थ हैं। कई पर्यावरण और खाद्य जनित विषैले पदार्थ और विषाक्त पदार्थों के स्वास्थ्य के प्रतिकूल प्रभाव एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है। इसलिए आणविक स्तर पर इस उलटने को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अज्ञात यौगिक reversibly GJIC को बाधित नहीं करता है, तो एक जीव के स्वास्थ्य के लिए निहितार्थ सबसे अन्य एजेंटों से काफी अलग हो सकता है और जोखिम की गणना का हिस्सा बनने की जरूरत सकता है।

खुराक और समय GJIC के निषेध में शामिल निर्धारण चलने का एक प्रक्रिया है। संस्कृति की आपूर्ति के लिए समय और पैसा बचाने के लिए, सबसे अच्छा तरीका एक उच्च खुराक है, जो, घुलनशीलता और समय (आमतौर पर एक घंटे पर निर्भर करता है सबसे निषेध के रूप में शुरू करने के लिए हैकम से कम 15 मिनट में होता है), और फिर एक कदम बुद्धिमान प्रक्रिया में आधे से समय और खुराक को कम जब तक वहाँ कोई प्रभाव नहीं है। अगर एक घंटे में एक उच्च खुराक में कोई अवरोध है, तो एक कदम बुद्धिमान प्रक्रिया में समय अवधि दोगुना है। प्रारंभिक प्रयोगों एक ही थाली पर किया जा सकता है। एक बार सामान्य समय का अनुमान है और खुराक की स्थापना कर रहे हैं, तो अधिक गहन अध्ययन से पता कुशलता सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उचित नमूना आकार के साथ बनाया जा सकता है। एक प्रयोगात्मक डिजाइन सुविधा खुराक और समय है कि 75 के लिए 100% निषेध तक पहुंचने का उपयोग करने के लिए किया जाएगा। जाहिर है, परिणाम के अंतिम व्याख्याओं से ऊपर मानकों का एक कारक हो जाएगा। हालांकि, पहले एक जैविक प्रभाव का निर्धारण करने, भले ही खुराक और समय विवो में प्रासंगिक नहीं हो सकता है, द्वारा स्थापित खुराक व्यावसायिक जोखिम की स्थितियों में एक भूमिका निभा सकते हैं, या अन्य कारकों के संपर्क में सामान्य आबादी के लिए भी संभावित additive के साथ GJIC प्रभावित या synergistic प्रभाव।

जी का निषेधJIC सबसे यौगिकों द्वारा आम तौर पर अत्यधिक चर नहीं है और दो तीन प्रतिकृति (प्रत्येक को दोहराने के लिए एक संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से हो सकता है या) खुराक और समय प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, अगर परिवर्तनशीलता उच्च है तो और अधिक प्रतिकृति के एक स्वतंत्र परीक्षण का एक दिया निर्भर चर के लिए एक सही मूल्य प्राप्त करने की जरूरत होगी। बेशक, कम से कम तीन स्वतंत्र परीक्षणों के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए।

इस परख और महत्वपूर्ण सेल की आबादी के आकार के आकलन की सादगी कई अनुप्रयोगों के लिए एक फायदा है। यह कई विषाक्तता के मूल्यांकन में विशेष रूप से उपयोगी है। हालांकि, वहाँ SL-डीटी assays है, जो कई कारकों पर निर्भर कर सकते हैं की सीमाएं हैं। एक इस तकनीक उचित है कि क्या करने के लिए कोशिकाओं का अध्ययन किया जा रहा है। इस परख कोशिकाओं है कि संस्कृति की थाली या अच्छी तरह से भर छिटपुट संपर्कों के साथ उच्च confluency तक पहुँच नहीं है के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करेगा। ऐसे microinjection के रूप में वैकल्पिक तकनीकों, सह जाना चाहिएnsidered। वैकल्पिक रूप से, SL-डीटी परख संशोधित किया जा सकता है। लोड हो रहा है एकल कक्षों में सफलता एक एक्यूपंक्चर सुई है, जो एक मामूली घुमा कार्रवाई जब डाई 7 लोड की आवश्यकता के साथ हासिल किया गया है। डाई के प्रसार को और अधिक मिला हुआ स्थितियों में रेडियल या छिटपुट सेल संपर्कों के साथ सेल संस्कृति के माध्यम से अनाकार होगा। भंडारण डाई समाधान करने के लिए rhodamine dextran (आरडी, 1 मिलीग्राम / एमएल) के अलावा प्रयोगों जहां भरी हुई कोशिकाओं की पहचान (जैसे आरडी के रूप में) एक मार्कर के बिना मुश्किल हो जाएगा के लिए सिफारिश की है। आरडी, खाई जंक्शन चैनलों पार करने के लिए बहुत बड़ी है, इस प्रकार की पहचान है जो कोशिकाओं भरी हुई थी। आरडी भी सभी SL-डीटी परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन छुरी जहां कोशिकाओं को लोड कर रहे हैं की पहचान डिश के तल पर एक खरोज छोड़ देता है। SL-डीटी परख भी डाई लोड प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेदभाव नहीं होगा के रूप में सेल के विभिन्न प्रकार के बीच GJIC में बदलाव को मापने के लिए अनुकूल नहीं है। फिर microinjection पसंद की विधि, लेकिन एक्यूपंक्चर सुई विधि मिग हैभी अगर एक एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक विशेष सेल लक्षित कर सकते हैं काम एचटी।

चयापचय सहयोग परख GJIC को मापने के लिए एक और तरीका है। इस विधि GJIC 24 के लिए पहली मानकीकृत bioassay में से एक था। इस परख में, जंगली प्रकार चीनी हैम्स्टर V79 कोशिकाओं (6 thioguanine के प्रति संवेदनशील) और 6-thioguanine प्रतिरोधी कोशिकाओं उच्च घनत्व, जिसमें 6-thioguanine (6-टीजी) प्रतिरोधी कोशिकाओं metabolize नहीं है 6-टीजी में सह-सुसंस्कृत थे एक जहरीले मेटाबोलाइट करने के लिए, इस प्रकार प्रतिरोध प्रदान। कोशिका मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप अंतराल जंक्शनों के माध्यम से विषाक्त मेटाबोलाइट के हस्तांतरण में 6 टीजी संवेदनशील कोशिकाओं परिणामों के साथ सह संस्कृति जहां विषाक्त 6-टीजी मेटाबोलाइट के हस्तांतरण को रोकने के द्वारा 6-टीजी प्रतिरोधी कोशिकाओं के बचाव में GJIC परिणामों के निषेध 6-टीजी संवेदनशील कोशिकाओं से। हालांकि इस परख का एक फायदा यह है कि यह न्यूनतम इनवेसिव है, एक बड़ा नुकसान यह है कि यह पूरा होने की है, जो व्यापक खुराक और समय toxi के आश्रित आकलन करता है के लिए एक सप्ताह की आवश्यकता हैcants के साथ ही यंत्रवत अध्ययन, आदि कई रसायनों का आकलन करने के लिए अव्यावहारिक।

SL-डीटी परख यंत्रवत अध्ययनों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के माध्यम से रंगों के पलायन का पता लगाने की जरूरत है, जिसमें microinjection पसंदीदा तरीका है करने के लिए अनुकूल नहीं है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रंगों के मिथाइल एस्टर के साथ पहले से लोड किया जा सकता है। डाई की लोडिंग intracellular मिथाइल esterases कि इसकी अधिक हाइड्रोफिलिक रूप में lipophilic डाई hydrolyze, इस प्रकार की कोशिकाओं में डाई फँसाने का एक समारोह है। यह फ्लोरोसेंट जांच प्रीलोड के लिए एक कम आक्रामक तरीका है, लेकिन सबसे आम तरीका कहनेवाला संचार को मापने के लिए जहां सभी कोशिकाओं को इस विधि द्वारा पहले से लोड कर रहे है FRAP परख 11 है। FRAP का लाभ फिर से एकल कक्षों में अंतराल जंक्शनों आकलन करने की क्षमता है, जो यंत्रवत अध्ययन के लिए उत्कृष्ट है। हालांकि FRAP का नुकसान में निहित है: विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए कोशिकाओं की आबादी को मापने के लिए अक्षमता,परिष्कृत और बहुत महंगा सूक्ष्मदर्शी / लेजर cytometers लिए की जरूरत है, अत्यधिक कुशल तकनीकी विशेषज्ञता के लिए की जरूरत है, लेजर द्वारा उत्पादित मुक्त कण से मामूली आक्रामक, और उच्च throughput के लिए अनुकूल नहीं है।

अभी हाल ही में एक और तकनीक विकसित की गई है; आणविक फ्लोरोसेंट जांच (दीपक) विधि 25 है, जो बंदी कूमेरिन-तरह fluorophores की एक नई पीढ़ी पर आधारित है की स्थानीय सक्रियण। FRAP परख करने के लिए भी इसी तरह, सभी कोशिकाओं रंगों एक मिथाइल एस्टर युक्त के साथ पहले से लोड कर रहे हैं, हालांकि, इन रंगों पराबैंगनी प्रकाश की एक छोटी खुराक है, जो शायद FRAP तुलना में काफी कम आरओएस उत्पादन के साथ लेसरों द्वारा बाद में स्थानीय रोशनी पर फ्लोरोसेंट हो जाते हैं। फिर, यह परख FRAP परख का एक ही सीमाएँ हैं। GJIC को मापने के लिए अन्य हाल ही में प्रगति preloading और पैराशूट तकनीक है, जो भी मिथाइल एस्टर फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल को शामिल कर रहे हैं। preloading तकनीक निलंबित शामिलकोशिकाओं को उतार दिया समकक्षों के साथ एक साथ फ्लोरोसेंट जांच के साथ पहले से लोड और फिर चढ़ाया और एक मिला हुआ monolayer फार्म करने की अनुमति है। डाई के प्रसार तो एक epifluorescence माइक्रोस्कोप 26 के साथ मनाया जा सकता है। पैराशूट परख में, कोशिकाओं फ्लोरोसेंट जांच के साथ पहले से लोड उतार कोशिकाओं की एक monolayer पर मढ़ा जाता है, और डाई के प्रसार को एक epifluorescence माइक्रोस्कोप 27 के साथ मनाया जाता है। फिर, ऊपर तकनीक तकनीकी रूप से अधिक चुनौती दे रहे हैं उच्च throughput विश्लेषण के लिए, और तुरंत पास संगम पर चढ़ाया जाना चाहिए और कोशिकाओं की reattachment के लिए एक समय अंतराल की आवश्यकता है।

कुल मिलाकर, SL-डीटी परख एक अपेक्षाकृत सस्ती, सरल और बहुमुखी तकनीक ऐसे सीओ 2 सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों, जैव सुरक्षा अलमारियाँ और epifluorescence माइक्रोस्कोप, आमतौर पर सबसे अधिक सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं में पाया के रूप में उपकरण का उपयोग करता है, है। कम से कम अनुभव के साथ कई प्लेटें एक दिन है, जो एफ लिए अनुकूल है में कार्रवाई की जा सकतीया विषाक्तता के लिए के रूप में अच्छी तरह से प्राकृतिक उत्पाद है कि रोकने के लिए या विषैले पदार्थ और विषाक्त पदार्थों के प्रभाव को रिवर्स लिए यौगिकों स्क्रीनिंग। इसके अलावा, उच्च throughput के लिए इस परख आदत डाल रोबोटिक्स का उपयोग कर, स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली के साथ संभावित विषैले पदार्थ और विषाक्त पदार्थों की बड़ी संख्या स्क्रीन करने के लिए होगा का विश्लेषण करती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
WB-F344 rat liver epithelial cells From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) none Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
35 mm Culture Plates Corning 430165
25 cm2 culture flasks Corning 430639
75 cm2 culture flasks Corning 430641
D-medium, an Eagles modified medium  ThermoFisher/GIBCO  Formula No. 78-5470EF
fetal bovine serum ThermoFisher/GIBCO  10437
0.25% trypsin-EDTA  ThermoFisher/GIBCO  15050
phosphate buffered saline homemade see below for ingredient cat#'s 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl JT Baker - Mallinckrodt  3040-01
NaCl JT Baker - Mallinckrodt  3624-05
Na2HPO4 JT Baker - Mallinckrodt  3819--01
KH2PO4 JT Baker - Mallinckrodt  3246-01
Lucifer Yellow CH, lithium salt Sigma-Aldrich Chemical L0259
rhodamine-dextran Sigma-Aldrich Chemical R9379
1-methylanthracene Sigma-Aldrich Chemical
phenanthrene Sigma-Aldrich Chemical P11409
resveratrol Sigma-Aldrich Chemical R5010
D609 Tocris Bioscience  1437
acetonitril EMD AX0145-1
37% solution formaldehyde JT Baker - Mallinckrodt  2106-01
#20 surgical blade Fine Science Tools Inc.  10317-14
50 ml conical sterile tubes Thermo scientific  339652
Nikon epifluorescence microscope  Nikon -Mager Scientific Eclipse TE300
Nikon FITC dichroic cube Nikon -Mager Scientific 96107
CCD camera Nikon -Mager Scientific Nikon Cool Snap EZ CCD
imaging system Nikon -Mager Scientific Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system.
ImageJ National Institute of Health http://imagej.nih.gov/ij/

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 118 अंतर junctional कहनेवाला संचार छुरी लोड फ्लोरोसेंट डाई हस्तांतरण, बायोमार्कर सेल संकेतन संकेत पारगमन कैंसर chemoprevention
गैप junctional कहनेवाला संचार: एक कार्यात्मक Biomarker विषैले पदार्थ और विषाक्त पदार्थों के प्रतिकूल प्रभाव का आकलन करने के लिए, और स्वास्थ्य प्राकृतिक उत्पादों के लाभ
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Upham, B. L., Sovadinová, I.,… More

Upham, B. L., Sovadinová, I., Babica, P. Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products. J. Vis. Exp. (118), e54281, doi:10.3791/54281 (2016).

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