Summary
Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.
Abstract
Dit protocol beschrijft een scalpel loading fluorescerende kleurstofoverdracht (SL-DT) techniek die intercellulaire communicatie via gap junction kanalen, die een belangrijke intracellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt gehandhaafd meet. Onderbreking van spleetovergangen intercellulaire communicatie (GJIC) van gifstoffen, toxines, geneesmiddelen, enz. Is gekoppeld aan talrijke nadelige gezondheidseffecten. Veel genetisch bepaalde menselijke ziekten zijn verbonden met mutaties in gap junction genen. De SL-DT techniek is een eenvoudige functionele test voor de gelijktijdige beoordeling van GJIC in een grote populatie van cellen. De bepaling omvat voorspaninrichting cellen met een fluorescente kleurstof door kort verstoren de celmembraan met een scalpel door een populatie cellen. De fluorescerende kleurstof wordt vervolgens door mogen steken gap junction kanalen naar naburige cellen gedurende een bepaalde tijd. De assay wordt vervolgens beëindigd door de toevoeging van formaline aan de cellen. De verspreiding van de fluorescent kleurstof door middel van een populatie van cellen wordt beoordeeld met een epifluorescentiemicroscoop en de beelden worden geanalyseerd met een aantal morfometrische software pakketten die beschikbaar zijn, zoals gratis software pakketten te vinden op het publieke domein. Deze test is ook aangepast voor in vivo studies met weefselcoupes van verschillende organen van de behandelde dieren. Globaal kan de SL-DT assay een groot aantal in vitro farmacologische en toxicologische behoeften te dienen, en kan eventueel aangepast worden voor high throughput opzet systemen met geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse om meer monsters te ontrafelen in een kortere tijd.
Introduction
Het algemene doel van deze werkwijze is een eenvoudig uitgebreid en relatief goedkope techniek om de potentiële toxiciteit van verbindingen te beoordelen. Dit is een in vitro benadering die kan worden gebruikt op diverse cellijnen. Standard celbiologie labs uitgerust met epifluorescentie microscopen kunnen onderzoeken met behulp van deze test.
Onze basiskennis van celfuncties is sterk afhankelijk van de in vitro bioassays geweest, en is een essentieel onderdeel in de toxicologische beoordeling van geneesmiddelen, milieuverontreinigende stoffen, en voedsel geboren verontreinigingen worden. Helaas is er geen enkele in vitro bioassay systeem dat volledig kan voldoen aan de eisen voor alle toxicologische evaluaties. Veel in vitro assays zijn ontworpen voor optimale en evaluatie uitgevoerd van een specifieke biochemische of moleculaire eindpunt. Deze worden vaak gecombineerd in een high throughput opgezet om een verstoring van een weerspiegelingbepaalde signaaltransductieroute, zoals oestrogeen-receptor signalering 1. Deze strategie is zeer succesvol geweest, maar het grote aantal signaaltransductie routes betrokken bij genexpressie maakt de taak van het kiezen van een specifieke signaleringsroute vrij complex te beoordelen. Hoge doorzet protocollen worden momenteel ontwikkeld en gebruikt voor het gelijktijdig meten tal signaalwegen, welke benadering aantal beperkingen van enkele assays overwinnen is. Echter, niet alle signaalwegen zijn met succes geïntegreerd in meer omvattende aanpak, plus nieuwe signaalwegen worden voortdurend ontdekt dat verder compliceert dit evaluatieproces. Met behulp van uitgebreide aantallen in vitro benaderingen, met name high-throughput systemen, voor een uitgebreide toxicologische evaluaties zijn ook erg duur en zijn niet bevorderlijk voor de meeste alleenstaande onderzoeker leidde onderzoeksprojecten.
GJIC is een proces tigHTLV gecontroleerd door veranderingen in spanning, calciumconcentratie, pH, redox balans, gereguleerd door de grote intracellulaire signaaltransductie en interacties met membraan en cytoskelet eiwitten 2,3. Aldus kan remming van GJIC tijdens verschillende soorten cellulaire stress, verstoring van verschillende cellulaire functies of verstoringen verschillende signaaltransductiewegen. Een andere benadering voor het gebruik van beperkte signaaltransductie bioassays overwinnen is om te profiteren van de biologische verschijnselen dat vele, zo niet de meeste, signaaltransductiewegen worden verder door coöperatieve intercellulaire signaleringssystemen gemoduleerde doorgangsgat junction kanalen 4-8. Hoewel intercellulaire signalering systemen zijn ook talrijk en onder meervoudige traject controle, de intercellulaire signalering doorgangsgat junction kanalen is uiteindelijk afhankelijk van de kanalen worden geopend, gedeeltelijk gesloten of volledig gesloten. Dit verschaft een eindpunt dat gemakkelijk kan worden gemeten met verschillendein vitro bioassay systemen 7. Gezien het feit dat de homeostatic setpunt van een weefsel vereist open kanalen, het bepalen van het effect van verbindingen op spleetovergangen intercellulaire communicatie (GJIC) is een meer integrale aanpak bij het vaststellen van mogelijke toxische effecten van verbindingen 4,8. In wezen is dit kritieke biologische verschijnsel dat coördineert de verschillende signaaltransductie gebeurtenissen genexpressie controleren speelt maakt een brede beoordeling van toxische effecten. Zo bioassays dat GJIC beoordelen zijn een uitstekend uitgangspunt om de toxische potentieel van verbindingen te evalueren.
De meest uitgebreide technieken om GJIC beoordelen op basis voorladen cellen met een fluorescerende probe en bewaken van de migratie van de kleurstof uit de geladen cel of cellen aan aangrenzende cellen. Technieken om de kleurstof voorspanning betrokken microinjectie 9, schrapen laden 10 en methylesters van de sondes 11 10. Plaats van de meer invasieve schrapen, het scalpel laadmethode van dit rapport omvat een zachte rol van een scalpel met een rond mes door een monolaag van cellen die invasieve schade te beperken (Figuur 1). De voordelen van deze techniek zijn de toxicologische beoordeling van een populatie van cellen in plaats van enkele cellen van de micro-injectie assay. Bovendien is de eenvoud van deze test zorgt voor een snelle detectie van meerdere platen in een korte tijd dat de methodes behulp van micro-injectie technieken en technieken die methylesters van fluorescerende probes zijn aanzienlijk tijdrovend en vereisen veel hoger niveau.
Hoewel er geen enkele methode om aan alle behoeften van het bestuderen van GJIC te voldoen; de SL-DT test is een eenvoudige, relatief goedkoop en veelzijdig test die kanvoldoen aan veel van de behoeften aan initiële beoordeling van de toxiciteit van verschillende verbindingen. Belangrijkste voordelen zijn: eenvoud, geen bijzondere noodzaak voor apparatuur of vaardigheden die vereist zijn voor andere werkwijzen zoals microinjectie, fluorescent herstel na fotobleken (FRAP) test en lokale activering van moleculaire fluorescente probe assays, snelle en simultane evaluatie van GJIC in een grote aantal cellen, bevorderlijk voor een hoge doorvoer opstelling met geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse, en de aanpasbaarheid voor in vivo studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol van deze studie werd goedgekeurd door de Animal Care en Utilization Comité van de National Institutes of Health Sciences van Japan, waar het in vivo experimenten werden uitgevoerd, om te verzekeren dat de ratten humaan en rekening houdend met verlichting van lijden behandeld.
1. SL-DT Bioassay
- Seed 3 x 10 5 WB-F344 rat lever epitheelcellen op 35 mm diameter cultuur platen met Eagles gemodificeerd medium plus 5% foetaal runderserum, en de cultuur van de cellen in een incubator bij 37 ° C, 100% relatieve vochtigheid (RH), 5% CO 2.
- De cellen te kweken totdat ze 100% confluentie (typisch 2 dagen) en leidt de gewenste experimentele behandeling van de cellen, zoals hieronder beschreven.
- Gedrag dosis-respons experimenten
- Voeg 10 ul en 20 ul van een 2 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril en 4 pl, 6 ul en 8 pl van een 20 mM voorraadoplossing van phenantype threen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elke toegevoegde hoeveelheid voorraadoplossing.
- Voeg 4 pi, pi 6, 8 ul, 10 ul en 20 ul van een 100% 's oplossing van acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elk toegevoegd volume acetonitril-oplossing om te dienen als controle voertuig.
- Incubeer de platen gedurende 15 minuten in een incubator ingesteld op 37 ° C, 100% relatieve vochtigheid en 5% CO2.
- Ga verder met stap 1.3.
- Conduct Time Response Experimenten
- Voeg 7 pl van een 20 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elk tijdstip (dat wil zeggen, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- Voeg 7 pl 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elk tijdstip te dienen als dragercontrole.
- Incubeer de platen voor elke aangewezen tijd pGemengd in een incubator bij 37 ° C, 100% relatieve vochtigheid en 5% CO2.
- Ga verder met stap 1.3.
- Gedrag Time Recovery Experimenten
- Voeg 7 pl van een 20 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor 15 min.
- Voeg 7 pl 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium gedurende 15 min om te dienen als controle voertuig.
- Decanteren het medium dat hetzij de fenantreen of acetonitril en spoel 3x met elk 3 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 2 ml vers kweekmedium aan elke plaat en incubeer de gewenste hersteltijden (bijvoorbeeld 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in een incubator bij 37 ° C, 100 % RH en 5% CO2.
- Ga verder met stap 1.3.
- Conduct Mechanism Experimenten
- Voeg de signaaltransductie remmer, namelijk
- Voeg 5 ul 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium gedurende 15 min om te dienen als controle voertuig.
- Voeg 7 pl van een 20 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium plus de D609 gedurende nog 15 min.
- Voeg 7 pl 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium plus 100% acetonitril gedurende nog 15 min om te dienen als controle voertuig.
- Ga verder met stap 1.3.
- Gedrag dosis-respons experimenten
- Gooi het kweekmedium door een van beide voorzichtig afgieten van het medium of door middel van vacuüm zuigen.
Opmerking: Gooi kweekmedium dat gevaarlijk afval op de juiste wijze. - Spoel de cellen drie keer met elk 3 ml PBS en ofwel decant of aspireren between spoelt.
- Pipetteer 1 ml van 1 mg / ml Lucifer Yellow kleurstof opgelost in PBS (LY) in elke cel plaat.
- Voorspanning de kleurstof in de cellen door glooiende een # 20 chirurgisch lemmet met een afgeronde rand door een populatie van cellen in drie verschillende gebieden van de plaat.
- Begin met het plaatsen van de scalpel loodrecht (90 °) en 5 mm van de rand van de kweekplaat, en draai de scalpel van deze loodrechte hoek over een hoek van 15 ° (zie figuur 1).
Let op: Dit wordt bereikt door het afklemmen van de scalpel tussen de wijsvinger en duim. Gebruik de zwaartekracht om de scalpel zachtjes gaan van 90 ° tot 15 ° positie (de ronde blad gewoon rolt over de cellen). Deze beweging zal een visueel waarneembaar inspringen lijn te verlaten.
- Begin met het plaatsen van de scalpel loodrecht (90 °) en 5 mm van de rand van de kweekplaat, en draai de scalpel van deze loodrechte hoek over een hoek van 15 ° (zie figuur 1).
- Incubeer de cellen met de LY oplossing gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteren of zuig het LY en spoel drie keer met 3 ml PBS om alle extrace verwijderenllular verven om extracellulaire achtergrondfluorescentie elimineren.
- Voeg 0,5 ml van 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing om de cellen te repareren.
Opmerking: Na de vaststelling in formaline, de lucht drogen de cellen en op te slaan in het donker voor maximaal twee jaar met een minimale fotobleken van de LY kleurstof. Indien vereist, hydrateren met 10% formaline oplossing voor de fluorescente kleurstof voorkant visualiseren. - Bekijk de gefixeerde cellen met een epifluorescentie microscoop voorzien van een dichroïsche kubus voor excitatie / emissie pieken van 428/536 nm bij een vergroting van 200X. Lijn alle platen zodat de inkeping evenwijdig aan het horizontale gezichtsveld.
Opmerking: Een FITC dichroïsche kubus werkt goed.- Leg het beeld met een CCD-camera en ondersteunende software.
- Open de ondersteunende software voor de CCD-camera en de instellingen voor automatische belichting. Gebruik de "capture" knop om het beeld digitaal te verwerven. Sla de afbeelding als .tif-bestanden met de knop "Opslaan".
2. Aanpassing van de SL-DT Assay aan leverweefsel
- Verwijder ongeveer een cm slice 2 x 2 van de linker kwab van een lever van een 5 weken oude, mannelijke Fischer 344 rat met behulp van dissectie schaar en plaats het op een plastic weeg plaat bedekt met natte gaas 12.
- Pipetteer 0,5 ml van een PBS oplossing bevattende 1 mg / ml van zowel lucifer geel en rhodamine-dextran (RD) op het oppervlak van het deel lever in de kunststof plaat te wegen.
Opmerking: De RD is een kleurstof die niet kan verplaatsen gap junction kanalen en de cellen die waren geplaatst markering. - Voeg 4:57 insnijdingen ongeveer 1 cm op het oppervlak van de lever segment dat de kleurstofoplossing in de weging plaat met een scherp mes heeft en voeg extra kleurstof voldoende om de insnijdingen vullen.
- Incubeer het weefsel gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op de kunststof plaat weegt.
- Spoel driemaal met 5 ml PBS.
- Bevestig het weefsel overnight in 30 ml 10% fosfaatgebufferde formaline in een 50 ml conische centrifugebuis in het donker bij kamertemperatuur.
- De volgende dag was de plakjes met water, versiering weefsel rond de incisie met dissectie scharen in 1 x 1 x 0,5 cm 3 opgehaald en standaardtechnieken gebruiken om de segmenten te bedden in paraffine 13.
- Section de plakken loodrecht op de incisie lijn dikte van 5 pm en de monsters op te slaan in het donker totdat klaar om te worden afgebeeld met behulp van standaard technieken snijden met een microtoom 13.
- Gebruik een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD camera te visualiseren en vastleggen van de beelden van de fluorescerende kleurstof fronten volgens paragraaf 7 1,10.
3. kwantificeren GJIC
- Meet de fluorescerende kleurstof spread met behulp van een morfometrische softwarepakket (bijvoorbeeld ImageJ).
- Klik op het tabblad "File" en vervolgens op "open" om het te openenopgeslagen beeld.
- Klik op de "Free Hand Tool" in de werkbalk Tab om de omtrek van de kleurstof voorkant traceren.
- Klik op het tabblad "Analyseren" en vervolgens op "Measure".
Opmerking: Dit zal een gebied waarde in een spread sheet, die desgewenst kan worden gekopieerd naar andere spreadsheet programma's te genereren.
- Met behulp van een spreadsheetprogramma, berekenen de fractie van de controle (FOC) van het gebied van de kleurstof verspreid in de experimentele plaat door het oppervlak de kleurstof gereisd in de stuurplaat met de volgende formule te delen:
Een e = oppervlakte van de kleurstof spreiding in cellen blootgesteld aan een experimentele variabele, zoals cellen behandeld met een chemisch op een specifieke dosis of tijd
A c = oppervlakte van de kleurstof verspreid in de controle, die cellen die met het voertuiginterieur de chemische ontbinding plaats zijn
Opmerking: Om het effect van het voertuig te bepalen,Een e zou het gebied van de kleurstof spreiding in cellen behandeld door het voertuig en A c zou het gebied van de kleurstof spreiding in cellen die niet behandeld door het voertuig. Het effect van het voertuig bij voorkeur minder dan 10% bedragen.
- Leg het beeld met een CCD-camera en ondersteunende software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onderbreking van GJIC wordt veelvuldig gebruikt als een biomarker voor het identificeren van giftige stoffen in de niet genotoxische, epigenetische niveau van gen-controle die nadelige gevolgen 14 gezondheid veroorzaakt. Bijvoorbeeld polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) zijn alom verontreinigingen van het milieu, maar variëren in hun epigenetische toxiciteit als functie van hun moleculaire structuren 15. Het lagere moleculair gewicht PAK's zijn meestal te vinden op relatief hogere concentraties dan het hogere gewicht PAK moleculair in vele verschillende omgevingen zoals vervuilde rivier sedimenten aan die van sigarettenrook 15,16. Fenantreen is een voorbeeld van een laag gewicht PAK moleculair dat drie benzeenringen bezitten met een hoekige pocket genaamd de baai regio. Figuur 2 is een reeks SL-DT afbeeldingen WB-F344 rattenleverepitheliale cellen behandeld met toenemende dosissen fenantreen. Let op de afname van de migratie of de fluorescerende kleurstof Lucifer Yellow, met toenemende doses. De gebieden van de gescande afbeeldingen kan worden bepaald als een fractie van de controle (FOC). De bediening van figuur 2 worden cellen behandeld met het oplosmiddel dat de PAH werd opgelost in, namelijk acetonitril. Typisch SL-DT experimenten worden uitgevoerd in duplo of triplo voor elke proef met een minimum van drie onafhankelijke experimenten voor elke experimentele parameter, die een dosis van dit experiment zou zijn. De FOC waarden kunnen dan worden gemiddeld statistisch geanalyseerd, en grafisch voorgesteld (zie figuur 3).
Soortgelijke experimenten worden ook routinematig uitgevoerd om de tijd en vergif geïnduceerde remming van GJIC en de tijdsperiode nodig om te herstellen van het vergif geïnduceerde remming van GJIC nadat de cellen worden overgebracht naar giftige stof-vrij medium vast. Figuur 4 toont zowel de tijd respons en herstel van remming door fenantreen (Phe). De SL-DT test kan ook worden gebruikt om de onderliggende mechanismen bepalen door welke giftige stof en giftige stoffen dysregulate GJIC 4,16. Dit gebeurt door pre-incuberen van cellen met een farmaceutische remmer van een geselecteerde signaalweg voor de toevoeging van de giftige stof of toxine dat GJIC dysregulates. Indien de vergif of toxine dysregulates niet meer GJIC in aanwezigheid van een gekozen geneesmiddel dat blokkeert een signaleringsroute, dan is deze route wordt voor een regulerende route van GJIC, terwijl deze trajecten kunnen worden uitgesloten als de giftige stof blijft dysregulate GJIC. Figuur 5 toont dit principal waarbij 1-methylantraceen (1-MEA), nog drie ringen PAH dat GJIC remt, maar niet in aanwezigheid van D609, wat een tamelijk specifieke remmer van fosfatidylcholine specifiek fosfolipase C (PC-PLC). Zo, PC-PLC wordt geregeerd in als kandidaat signalering enzym betrokken bij 1 MEA-geïnduceerde remming van GJIC. De rol van de PC-PLC is gevalideerd met ferdere experimenteren 4,16. Kortom, de SL-DT assays zijn zeer bevorderlijk voor de werkwijze mapping signaalnetwerken betrokken bij de mechanismen hoe toxische stoffen en toxines remmen (dysregulate) GJIC beginnen. Deze benadering kan ook worden gebruikt om te screenen op natuurlijke producten die een schadelijke stof of toxine van dysregulating GJIC kan blokkeren. Bijvoorbeeld, resveratrol, een antioxidant in hoge concentraties in rode wijn en pindaproducten kan voorkomen 1-MeA inhibeert GJIC (figuur 6).
De SL-DT assay is aangepast om weefsel segmenten van dieren, met name in de lever 17. Perfluoroctaanzuur (PFOA) is een 8-carbon gefluoreerde vetzuur dat is een hardnekkige milieuproblemen verontreinigende stof waarvan bekend is dat leverkanker 12,17 induceren. De SL-DT techniek PFOA bleek GJIC remt in een in vitro-WB F344rat lever modelsysteem 18. Een in vivo follow-up studie detmet hermelijn getooid dat PFOA ook geremd GJIC in de levers van F344 ratten behandeld met PFOA, waardoor het valideren van de in vitro modelsysteem 12,17. Figuur 7 zijn fluorescerende beelden van deze follow-up experiment met de kleurstof verspreid in de lever weefsels van ratten behandeld met het voertuig en PFOA.
Figuur 1: Het beeld van het beeldverhaal van de scalpel kleurstof laden stap. Een illustratie waaruit blijkt dat de scalpel laad- proces omvat het rollen het blad in plaats van horizontaal snijden door de cellen als naar cel schade te minimaliseren.
Figuur 2: Representatieve fluorescente microscopische beelden van de kleurstof verspreid via gap junctions. WB-F344 rattenleverepitheliale cellen werden gedurende 15 min met inkreuken doses fenantreen, een overwegend PAK in het milieu. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dosis-responscurve van fenantreen behandelde WB-F344 rattenleverepitheliale cellen. Gebieden van SL-DT afbeeldingen berekend en gerapporteerd als een fractie van de controle, welke cellen behandeld met de drager (acetonitril). Elk gegevenspunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten en de foutenbalken de standaard afwijkingen in het 95% betrouwbaarheidsinterval voor elke dosis na 15 min belichtingstijd. Een vier parameter logistische functie werd gebruikt om de lijn door de datapunten te passen. Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Keer op keer herstel response curve van fenantreen behandelde WB-F344 rat lever epitheelcellen. Na volledige remming van GJIC na 10 min blootstelling, werd het medium met fenantreen (Phe) geschakeld Phe-vrij medium en vervolgens werden de cellen gecontroleerd op herstel van remming. Gebieden van SL-DT afbeeldingen berekend en gerapporteerd als een fractie van de controle, welke cellen behandeld met de drager (acetonitril). Elk gegevenspunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten en de foutenbalken de standaard afwijkingen in het 95% betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
her.within-page = "1"> 
Figuur 5: Remming van GJIC door 1-methylantraceen afhankelijk van fosfatidylcholine specifiek fosfolipase C 1-methylantraceen (1-MEA) is een wijdverspreide PAK in het milieu. Het linkerpaneel vertegenwoordigen cellen behandeld met de drager (acetonitril, 0,35% v / v). Het middelste paneel staat voor WB-F344 rat lever epitheelcellen behandeld gedurende 15 min met 70 uM 1 MEA. Het rechterpaneel vertegenwoordigt cellen eerst 20 min voorbehandeld met 50 pM D609, een fosfatidylcholine specifiek fosfolipase C inhibitor, gevolgd door de toevoeging van 70 uM 1-MeA gedurende nog 15 min. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
281fig6.jpg "/>
Figuur 6: Resveratrol verhinderde de inhibitie van GJIC door 1-methylantraceen. Het linkerpaneel vertegenwoordigen cellen behandeld met de drager (acetonitril, 0,35% v / v). Resveratrol is een antioxidant gevonden in rode wijn en pinda-producten. Het middelste paneel vertegenwoordigt cellen behandeld gedurende 15 min met 70 uM 1 MEA. Het rechterpaneel geeft cellen eerst 20 min voorbehandeld met 50 pM resveratrol gevolgd door de toevoeging van 70 uM 1-MeA gedurende nog 15 min. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Ex vivo SL-DT assays van GJIC in de lever segmenten van mannelijke F-344 ratten. Het linker paneel is een stukje van de lever tissue van een rat behandeld met de dragercontrole, dimethylsulfoxide, voor 24 uur. Het rechterpaneel geeft een plakje van leverweefsel van ratten na intraperitoneale toediening van 100 mg / kg perfluoroctaanzuur (PFOA) na 24 uur. PFOA, een wijdverspreide milieucontaminant, een tumorbevorderend peroxisoom proliferator dat hepatomegalie induceert en aangetoond gap junctions toepassing van een in vitro model te blokkeren. De incisie geladen kleurstof werd gedaan op de lever segmenten van het voertuig en PFOA behandelde dieren, die vervolgens werden vastgesteld, schoongemaakt en deelbaar. Overgenomen van Environmental Health Perspectives 12. Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De SL-DT-test is een eenvoudige en veelzijdige techniek in het meten van GJIC, maar er zijn een aantal kritische problemen die moeten worden verwerkt in het ontwerp van de juiste experimentele protocollen. Voor robuuste meting van GJIC de SL-DT-test moet een goede spreiding van de kleurstof LY doorgangsgat verbindingspunten van de cellen. Minimaal moet een voldoende tijd worden gekozen om te verzekeren dat de kleurstof verspreidt via acht of meer rijen cellen van de scalpel beladen cellen in beide richtingen. Ook voor het gemak van het meten van de afstand die de kleurstof migreren uit de scalpel geladen cellen, selecteer een vergrotingsfactor die verzekert de kleurstof verspreiding van de controle platen vult 70 tot 90% van het gezichtsveld. Voor de WB-F344 rattenleverepitheliale cellen, drie minuten incubatie met de LY oplossing voldoende is voor het kleurstoffront gaan dan vier rijen cellen en een vergroting van 200X optimaal. Cellen worden gekweekt op 35 mm platen met een diameter, die vrij wijzigbaar te loading van de kleurstof in de cellen met een scalpel. Echter kunnen worden gekweekt in kleine putjes, maar het gebruik van een scalpel niet mogelijk is, met name 96 putjes. Voor kleine putten, gebruik dan een kleine ronde-tip cutting edge, die past in de put, en opnieuw, gebruik dan een rollende actie. Deze rollende actie is een cruciale stap als het minimaal invasief en levert een zeer schone lijn van lading dat de cellen verhindert gescheurd en er een grote celvrij gap typisch oorspronkelijke schrapen methode. Als alternatief kan een acupunctuurnaald worden gebruikt, waarin een kleine draai van de naald heeft een leuke baan van het laden kleurstof in de cellen.
Andere celtypen kan worden gebruikt in deze test. Echter, de selectie van cellen en begrijpen van de rol van GJIC in een bepaald celtype is belangrijk bij het ontwerpen passende hypothesen en de opzet van de experimenten. De eerste en meest duidelijke stap is celcultuur omstandigheden waaronder functionele gap junctions zijn expres ontwikkelingsed. In goed gedifferentieerde celtypen, welke specifieke metabolische functies uit te voeren, gap kruispunten gewoonlijk een rol spelen bij de coördinatie van metabole routes tussen aangrenzende cellen. Goed gedifferentieerde celtypen beperkte of geen proliferatieve capaciteiten en de kanalen waarschijnlijk een weefselspecifieke metabolische rol is vaak afhankelijk van de morfologie en specifieke rangschikking van cellen spelen. Bijvoorbeeld cardiale myocyten langwerpige cellen waarin gap junctions voornamelijk worden uitgelijnd langs de tussengevoegde schijven, waardoor de SL-DT methode zou vereisen uitlijnen van de cellen, die kunnen worden uitgevoerd in een gegroefd schotel. Aldus moet een zorgvuldige overwegingen worden gemaakt voor elke cel. Onderzoeken met neuronale celkweken typisch niet confluent en vereisen ook specifieke contactpunten, die het gebruik van de SL-DT ongepast alternatieve GJIC assays maakt worden gebruikt.
In proliferatieve celtypen, zoals stamcellen en vroege progenitorcellen, GJIC speelt een cruciale rolbij de coördinatie van cell signaling gebeurtenissen die genexpressie reguleren mitogene gebeurtenissen te controleren. De WB-F344 rat lever epitheelcellen die in dit protocol valt in deze categorie. Gap junction genen zijn van cruciaal belang tijdens het weefsel ontwikkeling en onderhoud 19-21. Hoewel gap junction kanalen worden uitgedrukt en gevormd op alle oppervlakken celplasmamembraan, proliferatieve cellen zijn erg gevoelig voor groeifactoren, die GJIC remmen. Kritische overwegingen voor proliferatieve celtypen zijn meestal de samenstelling van de media georiënteerd. Groeifactoren zijn vaak hoger, met name in undefined medium dat foetaal runderserum, en de cellen gap junctions kan in een gesloten toestand. De eenvoudigste manier om GJIC vestigen in deze cellen is het verminderen of verwijderen van de serumspiegels gedurende 4 tot 24 uur voor experimenteren, maar 24 uur lang op cellen zonder serum die zouden apoptose zouden zijn. Het WB-F344 lever epitheel cellen voor de proeven die in tzijn artikel niet overgevoelig voor serum zonder de noodzaak om serum te verlagen. In tegenstelling, moet experimenten met behulp van een C10 muis cellijn eerste serum ontnomen om vast te stellen GJIC 22 zijn. Hoewel serumniveaus verschillen tussen de twee celtypen, interessant, de C-10-cellen reageerden zeer vergelijkbaar met methyl isomeren van antraceen 22,23.
Andere overwegingen voor de kwaliteit van de resultaten omvatten het uitvoeren van de experimenten op niet-cytotoxische doses. Cellen moeten worden gecontroleerd met fasecontrastmicroscopie gezonde morfologische kenmerken verwacht van het celtype voor en na behandeling te bepalen. Om te verzekeren dat de effecten van een verbinding op gap junction functie is niet vanwege een algemene cytotoxische effect dient cytotoxiciteit assays voor elke verbinding worden gedaan op hetzelfde tijdstip en dosis die in de SL-DT assay. Experimenten om te bepalen of een remmend effect van een verbinding op GJIC reversibel is ook een goede experiment tenminste twee redenen. Most verbindingen omkeerbaar getest remmen GJIC, maar als er geen herstel van GJIC, dan cytotoxiciteit misschien een factor en verdere tests nodig zou zijn. Indien GJIC vervolgens weer de dosis en beproefde waren waarschijnlijk niet cytotoxisch. Er zijn biologische gevolgen voor de reversibele remming van GJIC. De nadelige gevolgen voor de gezondheid van veel milieuproblemen en voedsel overgedragen toxische stoffen en giftige stoffen is een omkeerbaar proces. Daarom begrijpen van deze omkeerbaarheid op moleculair niveau is belangrijk. Wanneer een onbekende verbinding GJIC niet reversibel remt vervolgens de gevolgen voor de gezondheid van een organisme kan heel anders dan de meeste andere agenten en moet een deel van het risico berekeningen.
Doseren en toe betrokken bij de remming van GJIC is een iteratief proces. Om tijd en geld voor de kweek levering, de beste aanpak is om te beginnen in een hoge dosering, die afhangt van de oplosbaarheid en tijd (gewoonlijk een uur, de meeste remmingbij minder dan 15 min) en minder tijd en dosis met de helft in een stapsgewijze werkwijze tot er geen effect. Als er geen remming bij een hoge dosis om één uur, dan het dubbele van de tijd in een stapsgewijze proces. Initiële experimenten kunnen worden uitgevoerd op een enkele plaat. Zodra de algemene tijd schattingen en doses worden vastgesteld, dan grondiger onderzoek kunnen worden efficiënt ontworpen met de juiste steekproefomvang voor statistische analyses. Een proefopzet functie is om de dosis en de tijd die 75 tot 100% remming te bereiken. Uiteraard zal de uiteindelijke interpretatie van de resultaten een factor van bovengenoemde parameters. Echter, door eerst een biologisch effect bepalen, zelfs wanneer de dosering en tijd die niet relevant in vivo hetzij op het vastgestelde doses kan een rol in situaties van beroepsblootstellingen spelen, of algemene populaties blootstelling aan andere factoren die eveneens invloed GJIC potentiële additief of synergie-effecten.
De remming van GJIC de meeste verbindingen typisch niet zeer variabel en 02:58 replicaten (elke duplo zou een kweekplaat worden of ook) voldoende is om de dosis en respons curven genereren. Indien variabiliteit hoog dan meer herhalingen nodig zijn om een nauwkeurige waarde te verkrijgen voor een gegeven afhankelijke variabele van een onafhankelijk proces. Natuurlijk moet ten minste drie onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd voor statistische analyse.
De eenvoud van de test en de beoordeling van aanzienlijke afmetingen celpopulatie is een voordeel voor vele toepassingen. Dit is bijzonder nuttig in vele toxicologische evaluaties. Er zijn echter beperkingen van de SL-DT testen die kan afhangen van verschillende factoren. Eén is of deze techniek geschikt is voor de cellen bestudeerd. Deze test zou niet goed werken voor cellen die niet hoog confluentie niet bereiken met sporadische contacten in de hele cultuur plaat of goed. Alternatieve technieken, zoals micro-injectie dient gelijktijdigensidered. Als alternatief kan de SL-DT assay worden gewijzigd. Succes bij het laden enkele cellen is bereikt met een acupunctuurnaald, een lichte draaibeweging vereist bij het laden van de kleurstof 7. De verspreiding van de kleurstof zou radiale in meer confluent situaties of amorfe door middel van celkweek met sporadische cel contacten zijn. De toevoeging van Rhodamine dextran (RD, 1 mg / ml) aan de LY kleurstofoplossing wordt aanbevolen voor experimenten waarbij het identificeren van de beladen cellen moeilijk zou zijn zonder een merker (bijvoorbeeld RD). RD is te groot te doorkruisen gap junction kanalen, waardoor identificeren welke cellen zijn geladen. RD kan ook worden gebruikt in alle SL-DT assay, maar de scalpel laat een inkeping op de bodem van de schaal vaststellen waar cellen worden geladen. De SL-DT assay is niet bevorderlijk voor het meten van veranderingen in GJIC tussen verschillende soorten cellen als de kleurstof laden zou geen onderscheid tussen celtypen. Opnieuw micro-injectie is de methode van keuze, maar de acupunctuurnaald methode might ook werken als men een specifieke cel kan richten met behulp van een microscoop.
De metabole samenwerking assay is een andere methode voor GJIC meten. Deze methode was een van de eerste standaard bioassay voor GJIC 24. Bij deze test wildtype Chinese hamster V79-cellen (6-thioguanine-gevoelige) en 6-thioguanine-resistente cellen werden samen gekweekt bij hoge dichtheden waarin 6-thioguanine (6-TG) resistente cellen niet metaboliseren 6-TG een toxische metaboliet, waardoor resistentie. Co-cultuur met de 6-TG gevoelige cellen resulteert in de overdracht van de toxische metaboliet doorgangsgat junctions resulteert in celdood waarbij het remmen van GJIC resulteert in de redding van 6-TG resistente cellen door het voorkomen van de overdracht van de giftige 6-TG metaboliet de 6-TG gevoelige cellen. Hoewel een voordeel van deze test is dat het minimaal invasief Een belangrijk nadeel is dat het een week voltooid, die een uitgebreide dosis en tijdsafhankelijke beoordeling van toxi maaktsters en mechanistische studies, enz onpraktisch voor de beoordeling van veel chemicaliën.
De SL-DT test is niet bevorderlijk voor mechanistische studies die moeten de migratie van kleurstoffen te traceren door verschillende celtypen, waarbij micro-injectie verdient de voorkeur. Als alternatief kunnen cellen worden voorgeladen met de methylester van fluorescente kleurstoffen. Het laden van de kleurstof is een functie van intracellulaire esterasen methyl dat de lipofiele kleurstof hydrolyseren in de meer hydrofiele vorm, waardoor de kleurstof in de cellen vangen. Dit is een minder invasieve manier om de fluorescente probe voorspanning, maar de meest gebruikelijke manier om intercellulaire communicatie meten waar alle cellen worden voorgeladen met deze werkwijze is de FRAP test 11. Het voordeel van FRAP weer de mogelijkheid gap junctions beoordelen enkele cellen, wat uitstekend is voor mechanistische studies. Maar het nadeel van FRAP ligt in: het onvermogen om populaties van cellen voor toxicologische evaluaties te meten,de behoefte aan geavanceerde en zeer dure microscopen / laser cytometers, de behoefte aan zeer bekwame technische expertise, matig invasief van de vrije radicalen die door de laser, en niet bevorderlijk voor high throughput.
Recenter andere techniek ontwikkeld; de lokale activatie van moleculaire methode fluorescente probe (LAMP) 25, die is gebaseerd op een nieuwe generatie van gekooide cumarine-achtige fluoroforen. Vergelijkbaar met de FRAP test worden alle cellen voorgeladen met kleurstoffen die een methylester, echter deze kleurstoffen worden fluorescerende bij aansluitende gelokaliseerd belichting met lasers met een kleine dosis ultraviolet licht, wat waarschijnlijk veroorzaakt aanzienlijk lager dan ROS FRAP. Nogmaals, deze test heeft dezelfde beperkingen van de FRAP assay. Andere recente ontwikkelingen voor het meten GJIC de voorspanning en parachute technieken, die ook het gebruik van methylester-fluorescerende kleurstoffen omvatten. De voorspanning techniek houdt schorsingde cellen voorgeladen met fluorescerende probe met onbelaste tegenhangers en worden daarna uitgeplaat en toegestaan om een confluente monolaag te vormen. De verspreiding van de kleurstof kan vervolgens worden waargenomen met een epifluorescentiemicroscoop 26. In de parachute assay worden de cellen voorgeladen met de fluorescerende stof bedekt op een monolaag van cellen gelost en de verspreiding van de kleurstof wordt waargenomen met een epifluorescentiemicroscoop 27. Nogmaals, de bovenstaande technieken zijn technisch uitdagend voor high throughput analyses, en moet onmiddellijk worden verzilverd in de buurt van samenloop en vereist een vertraging voor de herbevestiging van de cellen.
Over het algemeen, de SL-DT-test is een relatief goedkope, eenvoudige en veelzijdige techniek die apparatuur gebruikt, zoals CO 2 celcultuur incubators, bioveiligheid kasten en epifluorescentiemicroscoop, doorgaans te vinden in de meeste celcultuur labs. Met minimale ervaring vele platen kunnen worden verwerkt in een dag, dat bevorderlijk fof screenen van verbindingen op toxiciteit en voor natuurlijke producten die voorkomen of omkeren van de effecten van toxische stoffen en toxines. Ook de aanpassing van deze assay voor high throughput analyse middels robotica, geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse systemen de mogelijkheid om grote hoeveelheden toxische stoffen en toxines scherm hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
