Summary
Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.
Abstract
Bu protokol, doku homeostazı muhafaza edildiği bir önemli arası bir süreçtir gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya transferi (SL-DT) tekniği açıklar. Vb toksik maddelerin, toksinler, ilaçlar, tarafından boşluk junctional arası iletişim (GJIC) kesilmesi çok olumsuz sağlık etkileri ile bağlantılı olmuştur. Birçok genetik temelli insan hastalıkları gap junction genlerdeki mutasyonlarla bağlantılı olmuştur. SL-DT tekniği hücrelerinin geniş bir popülasyonda GJIC eşzamanlı değerlendirilmesi için basit bir işlevsel tahlildir. Deney kısa hücre popülasyonu ile bir neşter ile hücre zarı bozucu bir floresan boya ile ön yükleme hücreleri içerir. floresan boya sonra belirlenmiş bir süre için hücreler komşu gap junction kanalları aracılığıyla çapraz izin verilir. Bundan sonra, tahlil hücrelere formalin ilavesi ile sona erdirilir. fluo yayılmasıhücre popülasyonu ile rescent boya Epifloresans mikroskop ile değerlendirilir ve görüntüler kamu malı bulunan ücretsiz yazılım paketleri de dahil olmak üzere mevcut morfometrik yazılım paketleri, herhangi bir sayı ile analiz edilir. Bu deney, aynı zamanda tedavi edilen hayvanlardan elde edilen çeşitli organlarda doku dilimleri kullanılarak in vivo çalışmalar için adapte edilmiştir. Genel olarak, SL-DT deneyi in vitro farmakolojik ve toksikolojik ihtiyaçlarını geniş bir hizmet edebilir, ve potansiyel olarak daha kısa bir süre içinde daha fazla örnek aydınlatmak için otomatik floresans mikroskobu görüntüleme ve analiz ile yüksek verim kurulum sistemleri için adapte edilebilir.
Introduction
Bu yöntem genel amacı, bileşiklerin potansiyel toksisite değerlendirmek için basit, kapsamlı ve nispeten ucuz bir teknik sunmaktır. Bu, birden fazla hücre hatlarında kullanılan bir in vitro bir yaklaşımdır. Epifloresans mikroskopları ile donatılmış standart hücre biyoloji laboratuarları bu testi kullanılarak araştırma yapabilir.
Hücre fonksiyonlarının temel bilgi, in vitro biyoanalizlere son derece bağımlı olmuştur ve ilaç, çevresel kirleticiler ve gıda doğan kirleticilerin toksikolojik değerlendirmeler önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Ne yazık ki, kapsamlı, tüm toksikolojik değerlendirmeler için taleplerini karşılayacak tek in vitro biyoassay sistemi vardır. In vitro deneyler birçok tasarlanmış ve değerlendirmek ve aynı zamanda özel bir biyokimyasal ve moleküler uç noktasını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Bunlar oldukça sık bir bir pertürbasyon yansıtmak için kurulmuş bir yüksek verimlilik birleştirilirBu östrojen reseptörü 1 sinyal belirli bir sinyal iletim yolu,. Bu strateji çok başarılı olmuştur, ama gen sentezlenmesine katılan sinyal transdüksiyon yollarının fazla sayıda oldukça karmaşık değerlendirmek için özel bir sinyal yolunu seçmek görevi yapar. Yüksek verimlilikte bir protokoller şu anda geliştirilen ve aynı anda tek tahlillerin bazı zayıf taraflarını bertaraf etmek bir yaklaşım olmuştur sayısız sinyal yolları, ölçmek için kullanılmaktadır. Ancak, tüm sinyal yolları başarıyla daha kapsamlı yaklaşımlar içine dahil edilmiştir, artı yeni sinyal yolları sürekli ileri daha karmaşık hale getirmektedir bu değerlendirme sürecini tespit edilmektedir. Özellikle yüksek verimlilikte bir sistemlerde, in vitro yaklaşımların geniş numaralarını kullanarak, kapsamlı toksikolojik değerlendirmeler de çok pahalı ve en tek araştırmacı için elverişli değildir için araştırma projeleri yürüttü.
GJIC bir işlem tıg olduğuhtly zarı ve hücre iskeletinin proteinleri 2,3 ile önemli hücre içi sinyal iletim yolları ve etkileşimler tarafından düzenlenir voltaj değişiklikleri, kalsiyum konsantrasyonu, pH, redoks dengesinin tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, GJIC inhibisyonu farklı hücresel stres tipleri, farklı hücresel fonksiyonları kesintiye uğraması ya da farklı sinyal iletim yollarının düzensizlikler yansıtabilir. Sınırlı sinyal iletim biyoanalizlere kullanımını aşmak için başka bir yaklaşım değil, en takdirde, sinyal iletim yolları daha gap junction kanalları 4-8 ile kooperatif arası sinyalizasyon sistemleri tarafından pek modüle edilir biyolojik olayların yararlanmak etmektir. arası sinyal sistemleri de çok sayıda ve çok yolu kontrolü altında olmakla birlikte, boşluk birleşim kanallardan arası sinyal sonuçta kısmen kapalı ya da tamamen kapalı açılan kanalların bir fonksiyonudur. Bu kolayca çeşitli kullanılarak ölçülebilir bir bitiş noktası sağlarnitro biyo-tahlil sistemlerinde 7. Bir doku homeostatik ayar noktası boşluk junctional içi iletişim bileşiklerin etkisini belirleyen, açık kanallar gerektirdiğini düşünürsek (GJIC) bileşiklerin 4,8 potansiyel toksik etkileri belirlemede daha kapsamlı bir yaklaşımdır. Esas olarak, gen ekspresyonunu kontrol çoklu sinyal transdüksiyon olayları koordine merkezi bir rol oynamaktadır, bu kritik bir biyolojik fenomen toksik etkileri geniş bir değerlendirmesi için olanak sağlar. Böylece, GJIC değerlendirmek biyo-bileşiklerin toksik potansiyelini değerlendirmek için mükemmel bir başlangıç noktasıdır.
GJIC değerlendirmek için kullanılan en geniş teknikler floresan prob hücreleri ön yükleme ve daha sonra komşu hücrelere yüklenen hücre veya hücrelerden boya geçişini takip dayanmaktadır. Boya önyükleneceği Teknikleri prob 11 yükleme 10, ve metil esterleri kazıyın, mikroenjeksiyon 9 yer var 10 tarafından geliştirilen aktarım deneyi boya. Aksine daha invaziv scrape daha bu raporun neşter yükleme yöntemi invaziv zararı en aza indirmek hücreleri (Şekil 1) bir tek tabaka ile yuvarlak bıçak ile bir neşter hafif bir rulo içerir. Bu tekniğin avantajları hücreleri yerine mikroenjeksiyon tahlilinin tek hücrelerden oluşan bir popülasyonun toksikolojik değerlendirilmesi bulunmaktadır. Mikroenjeksiyon teknikleri ve fluoresan problar metil esterlerini kullanmak teknikler kullanılarak yöntemleri çok daha fazla zaman alıcı ve önemli ölçüde daha yüksek yetenek ihtiyacı olmasına rağmen Ayrıca, bu deneyde basitliği, kısa sürede çok sayıda levha hızlı tespiti için verir.
GJIC okuyan tüm ihtiyaçlarını karşılamak için tek bir yöntem olsa da; SL-DT tahlil o can, basit, oldukça ucuz ve çok yönlü bir testtirÇeşitli bileşiklerin toksisite ilk değerlendirmeler için birçok ihtiyaçlarını karşılamak. Önemli avantajları şunlardır: basitlik, (sıkı bağlamak) deneyi ve moleküler flüoresan prob deneyleri, büyük içinde GJIC arasında hızlı ve aynı anda değerlendirme lokal aktifleştirilmesi ile ışıkla ağartma sonra mikroenjeksiyon, floresan kurtarma gibi diğer yöntemler için gerekli olan ekipman veya beceri için özel bir ihtiyacı in vivo çalışmalar için otomatik floresans mikroskobu görüntüleme ve analiz, hem de kendi ile uyumlu olan bu yüksek işleme kapasiteli bir kurulumu için elverişli hücrelerin sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için protokol sıçanlar insanca ve sıkıntılarını azaltmak için ilgili tedavi edildi sağlamak için Hayvan Bakım ve in vivo deneyler yapılmıştır nerede Japonya Sağlık Bilimleri, National Institutes Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. SL-DT Biyo
- Eagles ihtiva eden tohum 3 x 10 5 DB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri 35 üzerine mm çaplı kültür plakaları 37 ° C,% 100 nispi nem (RH),% 5, bir kuluçka makinesi içinde ortam artı% 5 fetal sığır serumu ve kültür hücreleri modifiye CO 2.
- Kültür hücreleri% 100 izdiham (tipik olarak 2 gün) ulaşmak ve aşağıda tarif edildiği gibi hücre istenen deney işlem yürütmek kadar.
- Doz Tepki Deneyler Davranış
- 10 ul% 100 asetonitril ve 4 ul, 6 ul fenantren bir 2 mM stok çözeltisi 20 ul ve phenan bir 20 mM stok solüsyonu 8 ul ekleStok çözeltisinin eklenen her birim için büyüme ortamının 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril threne.
- 4 ul, 6 ul, 8 ul, 10 ul ve araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere asetonitril çözeltisi eklenen her birim için büyüme ortamının 2 ml ihtiva eden üç hücre plakaları asetonitril% 100 çözeltisi 20 ul ekle.
- 37 ° C'de,% 100 nem ve% 5 CO2 ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 1.3 adıma geçin.
- Davranış Zaman Tepki Deneyleri
- Her bir zaman noktası (yani, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 dakika) için büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril fenantren bir 20 mM stok solüsyonu 7 ul ekle.
- Her bir zaman noktası, araç kontrolü olarak hizmet etmek için büyüme ortamının 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 7 ul ekle.
- Her belirlenen zaman p inkübe37 ° C'de bir inkübatör içinde birleştirme yeri,% 100 nem ve% 5 CO2.
- 1.3 adıma geçin.
- Zaman Kurtarma Deneyler Davranış
- 15 dakika boyunca büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril fenantren bir 20 mM stok solüsyonu 7 ul ekle.
- Araç kontrol olarak hizmet etmek için 15 dakika boyunca büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 7 ul ekle.
- fenantren veya asetonitril ya da ihtiva eden bir ortam süzün ve fosfat tamponlu tuzlu su, 3 ml (PBS) ile 3 kez her durulama.
- Istenen iyileşme süreleri (yani, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 dak), 37 ° C'de bir inkübatörde, 100, her bir plaka taze büyüme ortamına 2 ml ilave edilir ve kuluçkaya % RH ve% 5 CO2.
- 1.3 adıma geçin.
- Davranış Mekanizması Deneyleri
- Sinyal transdüksiyon inhibitörü ekleme örneğin,
- Araç kontrol olarak hizmet etmek için 15 dakika boyunca büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 5 ul ekle.
- ilave bir 15 dakika boyunca büyüme ortamı artı D609 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril fenantren bir 20 mM stok solüsyonu 7 ul ekle.
- araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere bir 15 dakika daha büyüme ortamı artı% 100 2 ml asetonitril ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 7 ul ekle.
- 1.3 adıma geçin.
- Doz Tepki Deneyler Davranış
- Ya yavaşça orta kapalı dökerek veya vakum emme ile kültür ortamı atın.
Not: Uygun tehlikeli atık içeren kültür ortamı bertaraf edin. - 3 PBS ml ve betwee tortusundan ayırma veya aspirat ya hücreleri üç kez her durulayınn durular.
- Pipet 1 1 mg / ml Lucifer sarı boya her hücre plaka PBS (LY) içinde çözüldü ml.
- hafifçe plaka, üç farklı alanlarda hücre popülasyonu ile yuvarlatılmış kenarı ile 20. Cerrahi çelik bıçak haddeleme ile hücreler içine boya önceden yükle.
- Dik neşter (90 ° açı) ve kültür plakasının kenarından 5 mm yerleştirerek başlayın ve 15 ° (Şekil 1 e bakınız) bir açı yaklaşık Bu dik açıdan neşter döndürün.
Not: Bu parmağı ve başparmak arasında neşter kısma elde edilir. (Yuvarlak bıçak sadece hücreler üzerinde rulo gibi) neşter yavaşça 15 ° pozisyona 90 ° gitmek için izin yerçekimi kullanın. Bu hareket bir görsel fark girinti hattını bırakacaktır.
- Dik neşter (90 ° açı) ve kültür plakasının kenarından 5 mm yerleştirerek başlayın ve 15 ° (Şekil 1 e bakınız) bir açı yaklaşık Bu dik açıdan neşter döndürün.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca LY çözeltisi ile inkübe hücreleri.
- Süzün ve LY aspirat ve extrace uzaklaştırmak için PBS 3 ml ile üç kez yıkayınllular hücre dışı arka plan floresan ortadan kaldırmak için boya.
- hücrelerin tespit edilmeleri için,% 10 fosfat tamponlu formalin çözeltisi 0.5 ml ilave edilir.
Not: formalin giderdikten sonra, hava hücrelerini kurutmak ve LY minimum boya photobleaching ile iki yıla kadar süreyle karanlıkta saklayın. Gerektiğinde, floresan boya ön görselleştirmek için% 10 formalin solüsyonu ile rehidrate. - 200X büyütmede 428/536 nm uyarım / emisyon tepe için dikroik küp ile donatılmış bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak tespit hücreleri gör. girinti hat görme yatay alanına paralel olacak şekilde tüm plakaları aynı hizaya getirin.
Not: Bir FITC dikroik küp iyi çalışıyor.- bir CCD kamera ve destekleyici yazılım ile görüntü yakalamak.
- CCD kamera için destek yazılımı açın ve otomatik pozlama ayarlarını kullanın. dijital görüntü elde etmek için "yakalama" düğmesini kullanın. "Kaydet" düğmesini kullanarak dosyaları tif olarak görüntü kaydetme.
Karaciğer Dokusu SL-DT Testi 2. Adaptasyon
- 5 haftalık, erkek Fischer 344 sıçan kullanarak diseksiyon makas yaklaşık bir karaciğer sol lob 2 x 2 cm dilim çıkarın ve plaka ıslak bir gazlı bez 12 ile kaplı tartmak plastik üzerine yerleştirin.
- Pipet 0.5 ila 1 mg içeren bir PBS çözeltisi / ml Lucifer sarı ve rodamin-dekstran (RD) plastik karaciğer dilimi yüzeyi üzerine ağırlığı plakanın her.
Not: RD gap junction kanalları çapraz edemez ve yüklenen hücreleri işaretlemek bir boyadır. - keskin bir bıçak ile tartın plaka boya çözümü vardır karaciğer dilim yüzeyinde yaklaşık 1 cm uzunluğunda üç beş kesiler yapmak ve daha sonra kesi doldurmak için yeterli ek boya ekleyin.
- plaka ağırlık plastik, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca doku inkübe edin.
- 5 ml PBS ile üç kere yıkayın.
- Doku ove Fixoda sıcaklığında karanlıkta bir 50 mL konik santrifüj tüpü içinde% 10 fosfat tamponlu formalin 30 ml rnight.
- Ertesi gün, su ile dilimleri yıkayın 1 x 1 x 0.5 cm 3 şeritler halinde makas diseksiyon ile kesi çevresinde doku Döşeme ve daha sonra parafin 13 dilimleri gömmek için standart teknikleri kullanın.
- Bölüm hazır olana kadar karanlıkta 5 mikron kalınlığına insizyon hattına dik dilimleri ve depolamak numuneler mikrotom 13 standart kesit teknikleri kullanarak görüntülü edilecek.
- Bölüm 1.10 7'ye göre floresan boya cephede görüntüleri görselleştirmek ve yakalamak için bir CCD dijital kamera ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop kullanın.
3. ükler GJIC
- (Örneğin, ImageJ) morfometrik yazılım paketi kullanarak floresan boya yayılmasını ölçün.
- "Dosya" sekmesini tıklayın ve ardından açmak için "açık"kaydedilen görüntü.
- boya ön hatlarını izlemek için Araç Çubuğu Tab "Ücretsiz Hand Tool" üzerine tıklayın.
- "Analiz" sekmesini tıklayın ve ardından "Ölçü" butonuna tıklayınız.
Not: Bu istenirse diğer tablolama programları içine kopyalanabilir bir tablosunu, bir alan değeri üretecektir.
- Bir tablo programı kullanarak, boya aşağıdaki denklem kullanılarak kontrol plakasında, seyahat alanında deneysel plaka boya yayılması alana bölünmesi kontrol (FOC) bölümünü hesaplamak:
Bir E = Örneğin, belirli bir dozu veya bir zaman bir kimyasal ile muamele edilen hücreler gibi bir deney değişken maruz kalan hücrelerin, boya yayılması alanı
Ilgi kimyasal çözünmesi için kullanılan araç ile tedavi edilen hücreler kontrol boya yayılması, bir c = alan
Not: Aracın etkisini belirlemek için,Bir E araçla tedavi edilen hücrelerde, boya yayılması alanı olacak ve bir C araç ile işleme tabi tutulmamış hücreler, boya yayılması alanı olacaktır. aracın etkisi tercihan% 10 daha az olmalıdır.
- bir CCD kamera ve destekleyici yazılım ile görüntü yakalamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GJIC kesilmesi yoğun olumsuz sağlık etkileri 14 uyarmaktadır gen kontrolünün nongenotoxic, epigenetik düzeyde toksik bileşiklerin belirlenmesi için bir biyolojik belirteç olarak kullanılmıştır. Örneğin, poliaromatik hidrokarbonlar (PAH), çevrenin yerde kirletici maddelerdir, ancak molekül yapıları 15 bir fonksiyonu olarak epigenetik toksisite olarak değişir. Düşük molekül ağırlıklı PAH tipik olarak, sigara dumanı 15,16 edilene kontamine Nehri çökeltilerinin olarak çok çeşitli ortamlarda yüksek molekül ağırlıklı PAH göre daha yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Fenantren bölmesi bölgesi adı verilen açısal cep üç benzen halkası sahip düşük moleküler ağırlıklı PAH bir örnektir. Şekil 2, fenantren artan dozları ile tedavi edilen DB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerinin SL-DT görüntüleri dizisidir. göç o azalma dikkatartan dozları ile flüoresan boya, Lusifer Sarısı, f. Taranan görüntüler bölgeleri kontrol (FOC) bir fraksiyonu olarak belirlenebilir. Şekil 2, kontrol hücreleri PAH, yani asetonitril içinde çözülmüş, bu çözücü ile muamele edilir. Tipik haliyle SL-DT deneyleri Bu deneyde, bir doz, her bir deney parametre için üç bağımsız çalışmalarda, en az, her deneme için ikili veya üçlü olarak yapılır. Elverişli bayrak değerleri daha sonra istatistiksel analiz, ortalama ve daha sonra (bakınız Şekil 3) grafikle gösterilebilir.
Benzer deneyler, aynı zamanda rutin olarak zehirli kaynaklı GJIC önlenmesi ve hücreler, zehirli içermeyen ortama transfer sonra GJIC bu zehirli kaynaklı inhibisyonu kurtarmak için gerekli bir süre için zaman kurmak için gerçekleştirilmiştir. Şekil 4 fenantren tarafından engellenmesinden zaman tepki ve kurtarma (her ikisi de gösterirPhe). SL-DT tahlil de hangi zehirli ve toksinler tarafından GJIC 4,16 disregüle altında yatan mekanizmaları belirlemek için kullanılabilir. Bu GJIC dysregulates zehiri ve toksin ilave edilmeden önce seçilen bir sinyal yolunun bir farmasötik inhibitörü ile ön kuluçka hücreler tarafından yapılır. zehirli ya da toksin artık zehirli GJIC disregüle devam etmesi durumunda bu yollar göz ardı edilebilir ise bir sinyal yolunu, bu yol, GJIC bir düzenleme yolu olduğu tespit edilmiştir blok seçilen bir ilaç varlığında GJIC dysregulates edin. Şekil 5, Bu ilke göstermektedir ki 1-methylanthracene (1-MEA) ancak fosfatidilkolin özgü fosfolipaz C (PC-PLC) oldukça spesifik bir inhibitör olduğu D609 mevcudiyetinde, GJIC inhibe başka bir üç halkalı PAH. Böylece, PC-PLC GJIC 1-MeA kaynaklı inhibe katılan aday sinyalizasyon enzim olarak yönetiliyor. PC-PLC rolü f ile onaylanmıştırurther deney 4,16. Genel olarak, SL-DT deneyleri toksik maddeler ve toksinler (disregüle) GJIC inhibe nasıl mekanizmalarında yer haritalama sinyal ağlarının işlemini başlatmak için oldukça elverişli. Bu yaklaşım aynı zamanda GJIC dysregulating bir zehirli madde ya da toksin engelleyebilir doğal ürünler taranması için de kullanılabilir. Örneğin, resveratrol, bir antioksidan GJIC (Şekil 6) inhibe 1-MEA önleyebilir kırmızı şarap ve fıstık ürünlerinde yüksek konsantrasyonlarda bulunan.
SL-DT tahlil özellikle karaciğerde 17, hayvanlardan doku dilimleri adapte edilmiştir. Perfluorooktonik asit (PFOA), karaciğer kanseri 12,17 indüklediği bilinen kalıcı çevre kirletici bir 8-C-fluorlu yağ asididir. SL-DT tekniği kullanılarak PFOA bir in vitro DB-F344rat karaciğer model sistemde 18 GJIC engellediği gösterilmiştir. Bir in vivo takip çalışması detPFOA ayrıca, böylece in vitro model sistemi 12,17 doğrulayarak, PFOA ile muamele F344 sıçanların karaciğerlerinde GJIC inhibe ettiğini ermined. Şekil 7 araç ve PFOA ile muamele edilmiş sıçanların karaciğer dokularında boya yayılım gösteren bu takip deneyden floresan görüntüler.
Şekil 1: neşter boya yükleme aşamasının Karikatür görüntüsü. Neşter Yükleme işlemi hücre hasarı en aza indirmek için yatay olarak hücreler arasında dilimleme yerine bıçak haddeleme içerir gösteren bir illüstrasyon.
Şekil 2: boya Temsilcisi floresan mikroskobik görüntüleri gap junction yoluyla yayılır. DB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri ile 15 dakika boyunca muamele edildifenantren dozlarının kırışma, bir yaygın PAH ortamında buldum. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: fenantren-tedavi WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri doz yanıt eğrisi. SL-DT görüntüleri Alanı hesaplanır ve daha sonra araç (asetonitril) ile muamele edilmiş hücreler, kontrol, bir kısım olarak rapor edilmiştir. Her bir veri noktası üç bağımsız deneyin ortalama ve hata çubukları, bir 15 dakika süresinden sonra her bir doz için% 95 güven sınırında standart sapmaları göstermektedir. Dört parametreli lojistik fonksiyon veri noktaları aracılığıyla hat uyacak şekilde kullanılmıştır. cli LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya ck.
Şekil 4: fenantren-tedavi WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerinin Zaman ve kurtarma tepki eğrisi. maruz kalma 10 dakika sonra GJIC komple inhibisyonuna sonra ortam içeren fenantren (Phe) Phe-Free orta açık ve daha sonra hücreler, inhibisyon iyileşme izlenmiştir. SL-DT görüntüleri Alanı hesaplanır ve daha sonra araç (asetonitril) ile muamele edilmiş hücreler, kontrol, bir kısım olarak rapor edilmiştir. Her bir veri noktası üç bağımsız deneyin ortalama ve hata çubukları,% 95'lik güven sınırında standart sapmaları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
her.within-page = "1"> 
Şekil 5: GJIC inhibisyonu 1-methylanthracene fosfatidilkolinin özgü fosfolipaz C 1-methylanthracene (1-MEA) bağlıdır ortamda bulunan yaygın PAH olup. Sol panel araç ile muamele edilmiş hücreleri temsil (asetonitril,% 0.35 h / h). orta panel 70 uM 1-MEA ile 15 dakika boyunca muamele DB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri temsil eder. Sağ panel, bir 15 dakika daha 70 uM 1-MEA ilave edildi 50 uM D609, fosfatidilkolin özgü fosfolipaz C inhibitörü ile 20 dakika boyunca, ilk önceden muamele edilmiş hücreler, temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
281fig6.jpg "/>
Şekil 6: resveratrol 1-methylanthracene göre GJIC engellenmesini engellemektedir. Sol panel araç ile muamele edilmiş hücreleri temsil (asetonitril,% 0.35 h / h). Resveratrol, kırmızı şarap ve fıstık ürünlerinde bulunan bir antioksidandır. orta panel 70 uM 1-MEA ile 15 dakika boyunca muamele hücreleri temsil eder. sağ panel ilk olarak bir 15 dakika daha 70 uM 1-MEA ilave edildikten sonra 50 uM resveratrol ile 20 dakika boyunca önceden muamele edilmiş hücreleri temsil eder. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: erkek F-344 sıçan karaciğer dilimleri GJIC ex vivo SL-DT deneyleri. Sol panel karaciğer Tiss bir dilim temsil24 saat süre ile, araç kontrolü, dimetil sülfoksit ile muamele edilmiş bir sıçandan UE. sağ panel 100 mg intraperitoneal sonra sıçan karaciğer dokusunda bir dilim temsil / 24 saat sonra perfluorooktonik asit (PFOA) kg. PFOA yaygın çevresel kontaminantlar, hepatomegali neden olur ve bir in vitro model kullanılarak GAP kavşakları bloke ettiği gösterilmiştir, tümörü güçlendiren peroksizom proliferatör olup. kesi yüklenen boya daha sonra, sabit bir kesilmiş ve kesitler alındı araç ve PFOS muamele edilmiş hayvanlardan elde edilen karaciğer dilimleri üzerinde yapıldı. Environmental Health Perspectives 12 çoğaltılamaz. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SL-DT tahlil GJIC ölçmek basit ve çok yönlü bir tekniktir, ancak uygun deneysel protokolleri tasarlama göz önüne alınmalıdır birçok kritik endişeler vardır. SL-DT tahlili kullanılarak GJIC sağlam ölçümler için hücrelerin gap junction aracılığıyla LY iyi bir boya yayılmış olması gerekir. En azından, uygun bir zaman boya her iki yönde de neşter yüklü hücrelerden hücre sekiz ya da daha fazla sıra yayılır sağlamak için seçilmelidir. Ayrıca, boya neşter yüklü hücrelerin göç mesafesi ölçme kolaylığı için, kontrol levhaları boya yayılması görüş alanının 70 ila% 90 doldurur garanti bir büyütme faktörünü belirleyin. DB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri için, boya cephesinin, dört hücre satırları ötesine için LY çözeltisi ile üç dakikalık bir inkübasyon yeterlidir ve 200X büyütme optimumdur. Hücreler loadi oldukça amendable olan 35 mm çaplı plakalar üzerinde yetiştirilenbir neşter ile hücre içine boya ng. Bununla birlikte, hücreler ince kuyu yetiştirilebilir, ancak bir neşter kullanılması özellikle 96 oyuklu kültür plakaları içinde, mümkün değildir. Küçük kuyu, kuyu içine sığacak ve yine bir yuvarlanma eylemi kullanabileceğiniz küçük yuvarlak uçlu kesici kenar kullanın. minimal invaziv ve yırtık ve orijinal kazıma yöntemi tipik bir büyük hücreli serbest boşluk yaratarak olmaktan hücreleri engeller yükleme çok temiz bir hat sağlar gibi bu haddeleme işlemi kritik bir adımdır. Seçenek olarak ise, bir akupunktur iğne iğne küçük büküm hücrelerine yükleme boyası güzel bir iş yaparken kullandığı kullanılabilir.
Diğer hücre tipleri bu deneyde kullanılabilir. Bununla birlikte, belirli bir hücre türü hücrelerin seçimi ve GJIC rollerini anlama uygun hipotez ve deney tasarımı çerçevesinin belirlenmesinde önemlidir. İlk ve en belirgin adımı hücre kültürü koşulları olan fonksiyonel gap junction expres vardır geliştirmektirsed. spesifik metabolik işlevleri yerine iyi farklılaşmış hücre türleri içinde, ara bağlantılar, tipik olarak, bitişik hücreler arasındaki metabolik koordine bir rol oynayabilir. herhangi bir proliferatif kapasiteleri ve kanallar, muhtemelen çoğunlukla morfolojisi ve hücre özel düzenlemeye bağlı olarak, bir doku spesifik metabolik bir rol oynamaktadır, düzgün farklılaşmış hücre türleri, sınırlıdır. Örneğin, kardiyak miyositler ara bağlantılar ağırlıklı, böylece oluklu bir çanak içinde yapılabilir hücreleri, hizalama gerektiren SL-DT yöntemi kullanılarak birleştirilmiş diskler hizalanır uzun hücrelerdir. Bu nedenle, dikkat hususlar her hücre tipi için yapılmalıdır. Nöronal hücre kültürleri ile yapılan çalışmalar, tipik olarak birleşmiş değildir ve kullanılmalıdır SL-DT olmayan ve alternatif GJIC tahlillerin kullanımı kılan özel temas noktalarını gerektirir.
Bu kök ve erken projenitör hücrelerin proliferatif hücre tiplerinde, GJIC daha kritik bir rol oynarkoordine hücre mitojenik olayları düzenleyen gen ekspresyonunu kontrol olayları sinyal. Bu protokolde kullanılan WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri bu kategoriye girer. Gap junction genler doku gelişimi ve bakımı 19-21 sırasında kritik önem taşımaktadır. GAP birleşim kanalları ifade, tüm hücre, plazma membranı yüzeylerinin üzerinde oluşturulmuş olsa da, proliferatif hücre GJIC inhibe büyüme faktörleri, karşı çok hassastır. proliferatif hücre tipleri için kritik hususlar genellikle medya kompozisyonu daha odaklı. Büyüme faktörleri, özellikle sığır fetus serumu içeren bir ortam içinde tanımlanmamış, fazla olabilir ki, hücrenin ara bağlantılar kapalı bir halde olabilir. Bu hücrelerde GJIC kurmak için en kolay yolu, 24 saat bu şişebilir gibi bir serum olan hücreler için çok uzun olur, ancak, azaltmak ya da deney 4 saat önce 24 için serum seviyelerini ortadan kaldırmaktır. Deneyler için kullanılan DB-F344, karaciğer epitel hücreleri T sunulanonun kağıt serum seviyelerini düşürmek gerek kalmadan serum aşırı duyarlı değildir. Bunun aksine, bir C10 fare hücre hattı kullanılarak deneyler GJIC 22 kurmak için yoksun ilk serumu olmalıdır. Serum düzeyleri iki hücre tipleri arasında farklılık gösterse de, ilginç bir şekilde, Cı-10 hücreleri, antrasen 22,23 metil izomerleri çok benzer bir cevap verdi.
kalitede sonuçlar için diğer hususlar sitotoksik olmayan dozlarda deneyler içerir. Hücreler tedavi öncesi ve sonrası hücre tipi beklenen sağlıklı morfolojik özelliklerinin belirlenmesi faz kontrast mikroskobu ile kontrol edilmesi gerekir. GAP bileşke fonksiyon bir bileşiğin etkisi, genel sitotoksik yanıta bağlı olmadığını sağlamak için, her bir bileşik için sitotoksisite deneyleri, aynı zamanda yapılmalı ve SL-DT deneyinde kullanılan doz. GJIC ilgili bir bileşiğin inhibe edici etkisi, geri olup olmadığını belirlemek için deneyler, aynı zamanda, en az iki nedenle iyi bir deneydir. Motersinir test st bileşikleri GJIC inhibe ancak GJIC hiçbir iyileşme varsa, o zaman sitotoksisite bir faktör ve ileri testler gerekli olacaktır olabilir. GJIC sonra dozu geri ve test zaman olsaydı Ancak, muhtemelen sitotoksik olmadığı. GJIC nın tersine çevrilebilen engellenmesi biyolojik etkileri vardır. Birçok kaynaklı çevre ve gıda toksik maddeler ve toksinler olumsuz sağlık etkileri geri dönüşümlü bir süreçtir. Bu nedenle moleküler düzeyde bu Reversibilite anlamak önemlidir. bilinmeyen bir bileşik, tersine çevrilebilir GJIC inhibe etmez, daha sonra bir organizmanın sağlık üzerindeki etkileri çoğu diğer maddeler oldukça farklı olabilir ve risk hesaplamalarına parçası olması gerekmektedir olabilir.
GJIC inhibisyonu dahil dozda ve sürede belirlenmesi yinelemeli bir işlemdir. kültür kaynakları için zaman ve paradan tasarruf etmek için, en iyi yaklaşım çoğu engellenmesi olarak, çözünürlük ve zaman (tipik olarak bir saat bağlıdır yüksek dozda, başlayacak olan) En az 15 dakika içinde meydana gelir ve hiçbir etkisi yoktur olana kadar adım adım işlemde yarı zaman ve doz azaltır. en az bir saat yüksek dozda herhangi bir inhibisyon yok ise, o zaman adım adım işlemde süre çift. Başlangıç deneyleri, tek bir plaka üzerinde yapılabilir. genel zaman tahminleri ve dozları oluşturulduktan sonra, o zaman daha kapsamlı çalışmalar verimli istatistiksel analizler için uygun numune boyutları ile dizayn edilebilir. Bir deneysel tasarım özelliği 75-100% inhibisyonu ulaşmak doz ve zaman kullanmak olacaktır. Açıkçası, sonuçların nihai yorumların yukarıdaki parametrelerin bir faktör olacaktır. Ancak, ilk doz ve zaman in vivo ilgili olmayabilir bile, bir biyolojik etkiye belirleyerek, kurulan dozlar Mesleki maruz kalınan durumlarda bir rol oynayabilir, ya da diğer etkenlere maruz genel nüfusa de potansiyel katkı ile GJIC etkileyen veya sinerjistik etkiler.
G inhibisyonuEn bileşiklerle JIC tipik olarak oldukça değişken değildir ve iki (her suret de bir kültür plakası olarak ya da olur) tekrarlı üç doz ve zaman tepki eğrilerini oluşturmak için yeterlidir. değişkenlik yüksek ise, ancak daha sonra çoğaltır bir bağımsız deneme belirli bir bağımlı değişken için doğru bir değer elde etmek için gerekli olacaktır. Tabii ki, en az üç bağımsız denemeler istatistiksel analizler için yapılması gerekir.
Bu tahlilde önemli hücre popülasyonu boyutlarının değerlendirilmesi basitliği bir çok uygulama için bir avantajdır. Bu, pek çok toksikolojik değerlendirmelerde özellikle yararlıdır. Ancak, çeşitli faktörlere bağlı olabilir SL-DT deneyleri, sınırlamaları vardır. Bir hücre çalışılan bu tekniğin uygun olup olmadığıdır. Bu deney kültür plakasına ya da iyi boyunca sporadik kişiler ile yüksek confluency ulaşamayan hücreler için iyi işe yaramaz. mikroenjeksiyon gibi alternatif teknikler, co olmalıdırnsidered. Seçenek olarak ise, SL-DT deney değiştirilebilir. Yükleme tek hücre başarı boya 7 yüklerken hafif bükme eylemi gerektiren bir akupunktur iğnesi ile elde edilmiştir. boya yayılması sporadik hücre kişiler ile hücre kültürü ile daha birleşik durumlarda radyal ya da amorf olacaktır. LY boya çözeltisine rodamin dekstran (RD, 1 mg / ml) eklenmesi yüklü hücrelerin belirlenmesi (örneğin, RD gibi) bir marker olmadan zor olacaktır deneyler için tavsiye edilir. RD böylece hücreler yüklenen edildiği belirleme, gap junction kanalları çapraz için çok büyük. RD, tüm SL-DT deneyde kullanılabilir, ancak neşter hücreleri yüklenir burada belirleme çanak alt bir çentik bırakır. SL-DT deneyi, hücre tipleri arasındaki ayrım olmaz boya yükleme gibi farklı hücre türleri arasında GJIC değişiklikleri ölçmek için elverişli değildir. Yine mikroenjeksiyon tercih edilen yöntem, ama akupunktur iğne yöntemi mig olduğunubir mikroskop kullanarak belirli bir hücre hedefleyebilir da işe Ht.
Metabolik işbirliği tahlil GJIC ölçmek için diğer bir yöntemdir. Bu yöntem, GJIC 24 ilk standart biyoassay oldu. Bu tahlilde vahşi tip Çin hamster V79 hücreleri (6-tioguanin duyarlı) ve 6-tioguanin dirençli hücreler 6-tiyoguanin (6-TG) dirençli hücreler 6-TG metabolize olmayan burada yüksek yoğunluklarda ko-kültürlenmiştir toksik metabolite böylece direnç kazandıran. hücre ölümü ile sonuçlanan boşluk bağlantıları yoluyla toksik metabolitin transferi 6-TG duyarlı hücreler sonuçları ile ko-kültür Toksik 6-TG metabolitinin aktarılmasının önlenmesinde 6-TG dirençli hücrelerinin kurtarılmasına GJIC sonuçlarının önlenmesi 6-TG hassas hücrelerinden. Bu deneyde bir avantajı, minimal invaziv olmasıdır, ancak önemli bir dezavantajı ise, TOXI arasında geniş bir doza ve zamana bağlı değerlendirmeler yapar tamamlanması için, bir hafta gerektirmesidirvb evlerinden atılmış yanı sıra mekanik çalışmalar, birçok kimyasal maddelerin değerlendirilmesi için pratik.
SL-DT tahlil mikroenjeksiyon tercih edilen yöntem olduğu farklı hücre tipleri ile boyaların göç izlemek için gerek mekanik çalışmalar, elverişli değildir. Seçenek olarak ise, hücreler, floresan boyalar metil ester ile önceden yüklenebilir. Boyanın yükleme ve böylece hücrelerde boya tutucu olarak, daha fazla hidrofilik forma lipofilik boya hidrolize hücre içi metil esterazların bir fonksiyonudur. Bu floresan prob önceden yüklemek için daha az invaziv bir yoldur, ancak tüm hücreler bu yöntemle önceden yüklenmiş olan hücrelerarası iletişimi ölçmek için en yaygın yolu sıkı bağlamak deneyi 11'dir. FRAP avantajı daha mekanik çalışmalar için mükemmeldir tek hücre boşluğu kavşakları değerlendirmek yeteneğidir. Ancak FRAP dezavantajı yatıyor: toksikolojik değerlendirmeler için hücre popülasyonları ölçmek için yetersizlik,Sofistike ve çok pahalı mikroskoplar / lazer sitometrelerinde ihtiyacı, çok yetenekli teknik uzmanlık ihtiyacı, orta lazer tarafından üretilen serbest radikallere karşı invaziv ve yüksek verimlilik için elverişli değildir.
Daha yakın zamanlarda başka bir teknik geliştirilmiştir; kafesli kumarin benzeri fluorophores yeni nesil dayanmaktadır moleküler floresan prob (LAMP) yönteminin 25 yerel aktivasyonu. FRAP tahliline benzer biçimde, tüm hücreler boyalar bir metil ester ihtiva eden önceden yüklenmiş, bununla birlikte, bu boyalar, muhtemelen FRAP göre daha düşük ROS üretimi ultraviyole ışık küçük bir doz ile lazerler daha sonra lokal aydınlatma girdiğinde flüoresan hale gelir. Yine, bu deney sıkı bağlamak tahlili ile aynı sınırlamalara sahiptir. GJIC ölçmek için diğer son gelişmeler, aynı zamanda metil ester fluoresan boyaların kullanımını içermektedir önyükleme ve paraşüt teknikleridir. ön yükleme tekniği askıya içerirHücreler yüklenmemiş meslektaşları ile birlikte floresan prob ile önceden yüklenmiş ve daha sonra kaplama ve konfluent tek tabaka oluşturacak şekilde izin verilir. Boya yayılması sonra Epifloresans mikroskop 26 ile görülebilir. Paraşüt tahlilde, floresan prob ile önceden yüklenmiş hücreler boş hücrelerin tek bir tabakası üzerine yerleştirilmiş olan ve boya yayılması Epifloresans mikroskop 27 görülmektedir. Yine, yukarıdaki teknikler yüksek verimlilik analizleri ve hemen yakın izdiham kaplama olmalıdır ve hücrelerin yatıştırıldı için bir zaman gecikme gerektirir için teknik olarak daha zordur.
Genel olarak, SL-DT tahlil gibi genellikle çoğu hücre kültürü laboratuvarlarında bulunan CO 2 hücre kültürü kuvöz, biyogüvenlik kabinleri ve Epifloresans mikroskop gibi, ekipmanlarını kullanan nispeten ucuz, basit ve çok yönlü bir tekniktir. Minimal tecrübesi ile birçok plakaları f elverişli bir günde, işlenebilirveya toksisite açısından hem de önlemek ya da toksik ve toksinler etkilerini tersine doğal ürünler için tarama bileşikleri. Ayrıca, yüksek verimlilik için bu testte adapte toksik maddelerin ve toksinlerin çok sayıda taranması potansiyeline sahip olacak otomatik floresan mikroskopi görüntüleme ve analiz sistemleri ile, robotik kullanarak analiz eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
