Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di trasferimento di carico bisturi-colorante fluorescente che misura la comunicazione intercellulare attraverso i canali gap junction. Gap giunzionale comunicazione intercellulare è un importante processo cellulare attraverso il quale l'omeostasi tissutale è mantenuto e la rottura di questa segnalazione cellulare ha effetti negativi sulla salute.
Abstract
Questo protocollo descrive un bisturi loading fluorescente trasferimento della tintura tecnica (SL-DT) che misura la comunicazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap, che è un importante processo intercellulare attraverso cui omeostasi tessuto sia conservato. Interruzione di spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) di sostanze tossiche, tossine, farmaci, ecc è stato collegato a numerosi effetti negativi sulla salute. Molte malattie umane genetiche basata sono state legate a mutazioni in geni gap junction. La tecnica SL-DT è un semplice saggio funzionale per la valutazione simultanea GJIC in una grande popolazione di cellule. Il test prevede cellule pre-caricamento con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana cellulare con una lama di bisturi attraverso una popolazione di cellule. Il colorante fluorescente è quindi consentito di attraversare attraverso canali di giunzione gap celle adiacenti per un tempo designato. Il saggio viene quindi interrotta mediante aggiunta di formalina alle cellule. La diffusione del fluocolorante fluore- attraverso una popolazione di cellule è valutato con un microscopio a epifluorescenza e le immagini vengono analizzate con qualsiasi numero di pacchetti software morfometrici che sono disponibili, tra cui pacchetti di software libero presenti sul dominio pubblico. Questo test è stato adattato per gli studi in vivo utilizzando fette di tessuto da vari organi da animali trattati. In generale, il dosaggio SL-DT può servire una vasta gamma di esigenze farmacologiche e tossicologiche in vitro, e può essere potenzialmente adatto per sistemi set-up high throughput con l'imaging microscopia a fluorescenza automatizzato e analisi di chiarire più campioni in un tempo più breve.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una tecnica semplice, completo e relativamente poco costoso per valutare i potenziali tossicità di composti. Questo è un approccio in vitro che possono essere utilizzati in molteplici linee cellulari. laboratori di biologia delle cellule standard dotate di microscopi epifluorescenza possono condurre una ricerca utilizzando questo test.
La nostra conoscenza di base delle funzioni cellulari è stato fortemente dipendente test biologici in vitro, ed è diventato una componente essenziale nelle valutazioni tossicologiche dei prodotti farmaceutici, inquinanti ambientali e contaminanti alimentari nato. Purtroppo, non esiste un unico sistema in vitro nel saggio biologico che può ampiamente soddisfare le richieste di tutte le valutazioni tossicologiche. Molti test in vitro sono progettati e ottimizzati per valutare e valutare uno specifico endpoint biochimica o molecolare. Questi sono spesso combinati in un flusso elevato impostato per riflettere una perturbazione di uncerto trasduzione del segnale, come ad esempio recettore per gli estrogeni segnalazione 1. Questa strategia ha avuto un discreto successo, ma il vasto numero di vie di trasduzione del segnale coinvolti nella espressione genica rende il compito di scegliere un percorso di segnalazione specifica per valutare abbastanza complessa. Alte protocolli through-put sono attualmente in fase di sviluppo e utilizzati per misurare simultaneamente numerose vie di segnalazione, che è stato uno approccio per superare alcuni dei limiti dei singoli test. Tuttavia, non tutte le vie di segnalazione sono stati inseriti con successo in approcci più completi, oltre a nuove vie di segnalazione sono costantemente scoperto che complica ulteriormente il processo di valutazione. Utilizzando i numeri ampi di approcci in vitro, particolarmente elevato through-put sistemi, per le valutazioni tossicologiche complete sono anche molto costosi e non sono favorevoli alla più unico investigatore condotto progetti di ricerca.
GJIC è un processo tightly controllato da variazioni di tensione, concentrazione di calcio, pH, redox equilibrio, regolamentati da importanti vie di trasduzione del segnale intracellulare e le interazioni con la membrana e citoscheletro proteine 2,3. Quindi, l'inibizione della GJIC può riflettere i diversi tipi di stress cellulare, interruzione delle diverse funzioni cellulari, o perturbazioni di diverse vie di trasduzione del segnale. Un altro approccio per superare l'uso di limitate biosaggi trasduzione del segnale è di sfruttare i fenomeni biologici che molti, se non la maggior parte, trasduzione del segnale sono ulteriormente modulati da sistemi di segnalazione intercellulari cooperativi attraverso canali gap junction 4-8. Sebbene i sistemi di segnalazione intercellulari sono anche numerose e sotto controllo percorso multiplo, la segnalazione intercellulare attraverso canali di giunzione gap è in definitiva una funzione dei canali essendo aperto, parzialmente chiusa o completamente chiusa. Questo fornisce un punto finale che può essere facilmente misurata utilizzando diversinei sistemi di saggi biologici in vitro 7. Considerando che il set point di un tessuto omeostatico richiede canali aperti, determinare l'effetto dei composti su spazi di giunzione comunicazione intercellulare (GJIC) è un approccio più completo nel determinare i potenziali effetti tossici dei composti 4,8. In sostanza, questo fenomeno biologico fondamentale che svolge un ruolo centrale nel coordinamento più eventi di trasduzione del segnale che controllano l'espressione genica permette una ampia valutazione degli effetti tossici. Così, test biologici che valutano GJIC sono un ottimo punto di partenza per valutare il potenziale tossicità dei composti.
I più estese tecniche utilizzate per valutare GJIC sono basati su precarico cellule con una sonda fluorescente e poi per controllare la migrazione del colorante dalla cella caricato o celle alle celle adiacenti. Tecniche per precaricare il colorante hanno coinvolto microiniezione 9, raschiare carico 10, e metilici esteri delle sonde 11 10. Piuttosto che il raschiare più invasivo, il metodo bisturi carico di questo rapporto implica un dolce rotolo di un bisturi con lama circolare attraverso un monostrato di cellule che riducano al minimo i danni invasiva (Figura 1). I vantaggi di questa tecnica sono la valutazione tossicologica di una popolazione di cellule piuttosto che singole cellule del dosaggio microiniezione. Inoltre, la semplicità di questo test consente la rapida rilevazione di più lastre in breve tempo mentre i metodi che utilizzano tecniche di microiniezione e tecniche che utilizzano gli esteri metilici di sonde fluorescenti sono significativamente più tempo e richiedono livello di abilità notevolmente superiore.
Anche se non esiste un unico metodo per soddisfare tutte le esigenze di studio GJIC; il saggio SL-DT è un test semplice, piuttosto economico e versatile che puòsoddisfare molte delle esigenze per le valutazioni iniziali di tossicità di vari composti. I principali vantaggi sono: semplicità, senza particolare bisogno di attrezzature o le competenze che sono necessarie per altri metodi come la microiniezione, recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) analisi e attivazione locale di saggi sonda fluorescente molecolare, una valutazione rapida e simultanea di GJIC in una grande numero di cellule, favorisce un alto rendimento set-up con imaging di fluorescenza automatizzata microscopia ed analisi, nonché la sua adattabilità per studi in vivo.
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Protocol
Il protocollo per questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo dei National Institutes of Health Sciences del Giappone, che è dove in vivo esperimenti sono stati fatti, per assicurare che i ratti sono stati trattati umanamente e con riguardo per alleviare le sofferenze.
1. SL-DT Bioassay
- Seed 3 x 10 5 WB-F344 cellule epiteliali di fegato di ratto Onto 35 piastre di coltura mm di diametro contenenti Eagles modificati medie più il 5% di siero fetale bovino, e cultura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 100% di umidità relativa (RH), 5% CO 2.
- Culture cellule fino a raggiungere il 100% di confluenza (tipicamente, 2 giorni) e condurre il trattamento sperimentale desiderata delle cellule come descritto di seguito.
- Condurre esperimenti Dose Response
- Aggiungere 10 ml e 20 ml di una mM soluzione madre di fenantrene 2 in 100% acetonitrile e 4 ml, 6 ml e 8 ml di una soluzione di 20 mM magazzino di phenanthrene in 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per ogni volume aggiunto di soluzione madre.
- Aggiungere 4 ml, 6 microlitri, 8 microlitri, 10 microlitri, e 20 pl di una soluzione 100% di acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per ogni volume aggiunto di soluzione di acetonitrile per servire come controllo del veicolo.
- Incubare le piastre per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C, 100% UR e 5% CO 2.
- Passare al punto 1.3.
- Comportamento Tempo Esperimenti di risposta
- Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita per ciascun punto di tempo (cioè, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita per ciascun punto di tempo per servire come controllo del veicolo.
- Incubare le piastre per ogni tempo designato pmista in un incubatore a 37 ° C, 100% UR e 5% CO 2.
- Passare al punto 1.3.
- Condurre esperimenti tempi di recupero
- Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min.
- Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min per servire come controllo del veicolo.
- Decantare il mezzo contenente sia il fenantrene o acetonitrile e risciacquare 3x ciascuno con 3 ml di tampone fosfato salino (PBS).
- Aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per ciascuna piastra e incubare per i tempi di recupero desiderati (cioè, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in un incubatore a 37 ° C, 100 % UR e 5% di CO 2.
- Passare al punto 1.3.
- Condurre esperimenti Meccanismo
- Aggiungere l'inibitore trasduzione del segnale, vale a dire
- Aggiungere 5 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di coltura per 15 min per servire come controllo del veicolo.
- Aggiungere 7 ml di una soluzione madre mM di fenantrene in 100% acetonitrile 20 a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita più la D609 per altri 15 min.
- Aggiungere 7 ml di 100% acetonitrile a tre piastre di cellule contenenti 2 ml di terreno di crescita più l'acetonitrile 100% per altri 15 min per servire come controllo del veicolo.
- Passare al punto 1.3.
- Condurre esperimenti Dose Response
- Eliminare il terreno di coltura da una delicatezza travaso del mezzo o per aspirazione sotto vuoto.
Nota: Smaltire terreno di coltura contenente rifiuti pericolosi in modo appropriato. - Lavare le cellule tre volte ciascuno con 3 ml di PBS e sia decantare o aspirare between risciacqua.
- Pipettare 1 ml di 1 mg / ml Lucifer colorante giallo disciolto in PBS (LY) in ciascuna piastra di cella.
- Precaricare il colorante nelle cellule da dolci un # 20 lama in acciaio chirurgico con un bordo arrotondato attraverso una popolazione di cellule in tre diverse aree della piastra.
- Iniziare mettendo bisturi perpendicolare (angolo di 90 °) e 5 mm dal bordo della piastra di coltura, e quindi scorrere il bisturi da questo angolo perpendicolare a circa un angolo di 15 ° (vedere Figura 1).
Nota: Questo si ottiene pizzicando la bisturi tra il dito indice e il pollice. Utilizzare gravità per consentire il bisturi per andare delicatamente dalle 90 ° a 15 ° posizione (come la lama arrotondata rotola semplicemente sulle celle). Questo movimento lascerà una linea di rientro visivamente evidente.
- Iniziare mettendo bisturi perpendicolare (angolo di 90 °) e 5 mm dal bordo della piastra di coltura, e quindi scorrere il bisturi da questo angolo perpendicolare a circa un angolo di 15 ° (vedere Figura 1).
- Incubare le cellule con la soluzione LY per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Decantare o aspirare il LY e sciacquare tre volte con 3 ml di PBS per rimuovere tutti extracellular tingere di eliminare sfondo extracellulare fluorescenza.
- Aggiungere 0,5 ml di soluzione di formalina tamponata al 10% per fissare le cellule.
Nota: Dopo aver fissato in formalina, asciugare le cellule e conservare al buio per un massimo di due anni con photobleaching minima del colorante LY. Quando richiesto, reidratare con formalina al 10% per visualizzare il fronte del colorante fluorescente. - Mostra le cellule fissate utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo dicroico per i picchi di eccitazione / emissione di 428/536 nm con un ingrandimento di 200X. Allineare tutte le piastre in modo che la linea di rientro è parallelo al campo visivo orizzontale.
Nota: Un cubo FITC dicroico funziona bene.- Acquisire l'immagine di una telecamera CCD e il software di supporto.
- Aprire il software di supporto per la fotocamera CCD e utilizzare le impostazioni per l'esposizione automatica. Utilizzare il pulsante "cattura" per acquisire digitalmente l'immagine. Salvare l'immagine come tif file utilizzando il tasto "Salva".
2. Adattamento del SL-DT test di tessuto epatico
- Rimuovere circa una fetta 2 x 2 cm dal lobo sinistro del fegato da un 5 settimane di età, di sesso maschile Fischer 344 ratti utilizzando forbici dissezione e posizionarlo su una plastica pesare piatto coperto con una garza bagnata 12.
- Pipettare 0,5 ml di una soluzione di PBS contenente 1 mg / ml ciascuna di Lucifero targa gialla e rodamina-destrano (RD) sulla superficie della fetta fegato in plastica peso.
Nota: La RD è un colorante che non può attraversare canali giunzione gap e segnerà le cellule che sono state caricate. - Effettuare tre a cinque incisioni lunghe circa 1 cm sulla superficie della fetta fegato che ha la soluzione colorante nel piatto di pesatura con una lama tagliente e quindi aggiungere ulteriori colorante sufficiente per riempire le incisioni.
- Incubare il tessuto per 3 minuti a temperatura ambiente sulla plastica pesare piatto.
- Risciacquare tre volte con 5 ml di PBS.
- Fissare il tessuto overnight in 30 ml di 10% tampone fosfato di formalina in un tubo da 50 ml conica per centrifuga al buio a temperatura ambiente.
- Il giorno seguente, lavare le fette con l'acqua, tagliare il tessuto intorno al incisione con dissezione forbici in 1 x 1 x 0,5 centimetri 3 strisce e quindi utilizzare le tecniche standard per incorporare le fette in paraffina 13.
- Sezione le fette perpendicolari alla linea di incisione di spessore di 5 micron e conservare i campioni al buio fino al momento di essere ripreso utilizzando tecniche di sezionamento standard con un microtomo 13.
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera digitale CCD di visualizzare e catturare le immagini dei fronti colorante fluorescente secondo la sezione 1.10 7.
3. Quantificare GJIC
- Misurare la diffusione colorante fluorescente utilizzando un pacchetto morfometrica software (ad esempio, ImageJ).
- Fare clic sulla scheda "File" e poi su "Apri" per aprire laimmagine salvata.
- Clicca su "strumento Free Hand" nella barra degli strumenti Tab per tracciare il contorno del fronte del colorante.
- Fare clic sulla scheda "Analizza" e quindi su "Misura".
Nota: Questo genererà un valore di area in un foglio di calcolo, che può essere copiato in altri programmi di foglio elettronico se lo si desidera.
- Utilizzando un foglio di calcolo, calcolare la frazione del controllo (FOC) dividendo l'area di diffusione colorante nel piatto sperimentale per la superficie colorante viaggiato nella piastra di controllo utilizzando la seguente equazione:
A = area e della diffusione di colorante in cellule esposte ad una variabile sperimentale, come le cellule trattate con una sostanza chimica in una dose o tempo specifico
A c = area della diffusione colorante nel controllo, che sono cellule trattate con il veicolo usato per sciogliere la sostanza chimica di interesse
Nota: Per determinare l'effetto del veicolo,A e sarebbe l'area di diffusione colorante nelle cellule trattate con il veicolo e A c sarebbe l'area di diffusione colorante in cellule non trattate con il veicolo. L'effetto del veicolo dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 10%.
- Acquisire l'immagine di una telecamera CCD e il software di supporto.
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Representative Results
Interruzione di GJIC è stato ampiamente utilizzato come biomarker per l'identificazione di composti tossici a, il livello epigenetico non genotossica di controllo gene che induce effetti negativi sulla salute 14. Ad esempio, idrocarburi aromatici policiclici (PAH) sono contaminanti ubiquitari dell'ambiente ma variano nelle loro tossicità epigenetiche in funzione delle loro strutture molecolari 15. I PAH di peso molecolare inferiore si trovano tipicamente a concentrazioni relativamente più elevati rispetto alle più alte PAH con peso molecolare in molti ambienti diversi, come sedimenti fluviali contaminati a quello di 15,16 fumo di sigaretta. Fenantrene è un esempio di un basso peso molecolare PAH che possiedono tre anelli benzenici con una tasca angolare chiamato regione baia. La figura 2 è una serie di immagini SL-DT di cellule epiteliali di fegato di ratto WB-F344 trattati con dosi crescenti di fenantrene. Notare la diminuzione nella migrazione of il colorante fluorescente, Lucifero giallo, con dosi crescenti. Le aree delle immagini acquisite possono essere determinati come frazione del controllo (FOC). Il comando di figura 2 sono cellule trattate con il solvente che la PAH è stato sciolto in, cioè acetonitrile. Tipicamente esperimenti SL-DT sono fatti in duplicato o triplicato per ogni prova con un minimo di tre prove indipendenti per ciascun parametro sperimentale, che sarebbe una dose in questo esperimento. I valori di FOC possono essere mediati, analizzati statisticamente e quindi graficamente (vedi Figura 3).
Esperimenti simili sono ordinariamente condotti per stabilire il tempo per l'inibizione causata da agenti tossici di GJIC, e il periodo di tempo necessario per recuperare da questa inibizione causata da agenti tossici dei GJIC dopo le cellule vengono trasferite al mezzo privo di sostanza tossica. La figura 4 mostra sia il tempo di risposta e recupero da inibizione da fenantrene (Phe). Il saggio SL-DT può anche essere usato per determinare meccanismi di base attraverso il quale sostanza tossica e le tossine dysregulate GJIC 4,16. Questo viene fatto cellule pre-incubazione con un inibitore farmaceutica di un percorso di segnalazione selezionato prima dell'aggiunta dell'agente tossico o tossina che dysregulates GJIC. Se la sostanza tossica o tossina non è più dysregulates GJIC in presenza di un farmaco selezionato che blocca un percorso di segnalazione, quindi questo percorso è determinato ad essere un percorso normativo di GJIC, mentre tali percorsi può essere esclusa se la sostanza tossica continua a dysregulate GJIC. Figura 5 illustra questo principio in cui 1-methylanthracene (1-MEA), altri tre PAH anelli che inibisce GJIC, ma non in presenza di D609, che è un inibitore abbastanza specifico di fosfatidilcolina specifica fosfolipasi C (PC-PLC). Così, PC-PLC è governata come un segnale candidato enzima coinvolto nella inibizione 1-MEA-indotta di GJIC. Il ruolo della PC-PLC è stato convalidato con fLTERIORI sperimentazione 4,16. Nel complesso, i saggi di SL-DT sono abbastanza favorevole per iniziare il processo di reti di segnalazione mappatura coinvolti nei meccanismi di come sostanze tossiche e tossine inibiscono (dysregulate) GJIC. Questo approccio può essere utilizzato anche per lo screening per i prodotti naturali che possono bloccare una sostanza tossica o tossina da dysregulating GJIC. Ad esempio, il resveratrolo, un antiossidante trovato in alte concentrazioni nel vino e prodotti di arachidi rosse può impedire 1-MeA da inibire GJIC (Figura 6).
Il saggio SL-DT è stato adattato alle porzioni di tessuto da animali, in particolare nel fegato 17. L'acido perfluoroctanoico (PFOA) è un acido grasso fluorurato 8-carbonio, che è un inquinante ambientale persistente noti per indurre i tumori del fegato 12,17. Utilizzando la tecnica SL-DT PFOA ha inibito GJIC in un in vitro WB-F344rat sistema modello fegato 18. Un follow-up studio in vivo detfoderato che PFOA anche inibito GJIC nel fegato dei ratti F344 trattati con PFOA, convalidando così il sistema modello in vitro 12,17. Figura 7 sono immagini fluorescenti di questo esperimento di follow-up che mostra la diffusione di colorante nei tessuti del fegato di ratti trattati con il veicolo e PFOA.
Figura 1: Immagine del fumetto del passo bisturi tintura di carico. Un esempio che mostra che il processo di caricamento bisturi coinvolge a rotazione la lama piuttosto che tagliare orizzontalmente attraverso le celle da ridurre al minimo i danni delle cellule.
Figura 2: immagini microscopiche a fluorescenza rappresentativi del colorante diffuso attraverso giunzioni. WB-F344 fegato di ratto cellule epiteliali sono stati trattati per 15 min con incordonatura dosi di fenantrene, un PAH prevalenti trovato nell'ambiente. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: curva dose-risposta di WB-F344 di fegato di ratto cellule epiteliali fenantrene-trattata. Aree di immagini SL-DT sono stati calcolati e riportati come una frazione del controllo, che erano cellule trattate con il veicolo (acetonitrile). Ciascun punto di dati è una media di tre esperimenti indipendenti e le barre di errore sono le deviazioni standard al limite di confidenza del 95% per ogni dose dopo un tempo di esposizione 15 min. Una funzione logistica a quattro parametri è stata utilizzata per adattare la linea attraverso i punti dati. Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il tempo e il tempo curva di risposta di recupero di WB-F344 di fegato di ratto cellule epiteliali fenantrene-trattata. Dopo la completa inibizione della GJIC dopo 10 minuti di esposizione, il terreno contenente fenantrene (Phe) è stato commutato PHE-Free medie e poi le cellule sono stati monitorati per il recupero di inibizione. Aree di immagini SL-DT sono stati calcolati e riportati come una frazione del controllo, che erano cellule trattate con il veicolo (acetonitrile). Ciascun punto di dati è una media di tre esperimenti indipendenti e le barre di errore sono le deviazioni standard un limite di confidenza 95%. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5: Inibizione della GJIC da 1-methylanthracene dipende fosfatidilcolina fosfolipasi specifiche C. 1-methylanthracene (1-MEA) è una PAH diffuso trovato nell'ambiente. Il pannello di sinistra rappresentano cellule trattate con il veicolo (acetonitrile, 0,35% v / v). Il pannello centrale rappresenta WB-F344 di fegato di ratto cellule epiteliali trattate per 15 minuti con 70 micron 1-MeA. Il pannello di destra rappresentano cellule pretrattate prima per 20 min con 50 pM D609, un inibitore specifico fosfatidilcolina fosfolipasi C, seguita da aggiunta di 70 mM 1-MeA per altri 15 min. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6: il resveratrolo ha impedito l'inibizione della GJIC da 1-methylanthracene. Il pannello di sinistra rappresentano cellule trattate con il veicolo (acetonitrile, 0,35% v / v). Il resveratrolo è un antiossidante presente nel vino e prodotti di arachidi rosse. Il pannello centrale rappresenta cellule trattate per 15 minuti con 70 micron 1-MeA. Il pannello di destra rappresenta cellule prima pretrattate per 20 min con 50 pM resveratrolo seguire l'aggiunta di 70 mM 1-MeA per altri 15 min. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: ex vivo saggi SL-DT di GJIC a fette di fegato da maschio F-344 ratti. Il pannello di sinistra rappresenta una fetta di fegato tissue da un ratto trattato con il controllo del veicolo, dimetilsolfossido, per 24 ore. Il pannello di destra rappresenta una fetta di tessuto epatico da un ratto dopo somministrazione intraperitoneale di 100 mg / kg di acido perfluoroottanoico (PFOA) dopo 24 ore. PFOA, un contaminante ambientale diffuso, è un tumore promuovere proliferatori dei perossisomi che induce epatomegalia e ha dimostrato di bloccare giunzioni utilizzando un modello in vitro. Il colorante incisione caricato è stato fatto su fette di fegato dal veicolo e gli animali PFOA trattati, che sono stati poi fissati, rifilata e sezionati. Tratto da Environmental Health Perspectives 12. barra della scala = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il saggio SL-DT è una tecnica semplice e versatile in misura GJIC, ma ci sono diverse preoccupazioni critiche che dovrebbero essere contabilizzati nella progettazione di adeguati protocolli sperimentali. Per misurazioni affidabili di GJIC utilizzando il test SL-DT ci deve essere una buona diffusione tintura della LY attraverso giunzioni delle cellule. Come minimo, un tempo adeguato deve essere scelto per assicurare che il colorante si diffonde attraverso otto o più righe di celle dalle cellule bisturi caricata in entrambe le direzioni. Inoltre, per la facilità di misura della distanza che il colorante migrato dalle cellule bisturi caricati, seleziona un fattore di ingrandimento che assicura la diffusione di colorante delle placche di comando riempie 70 al 90% del campo visivo. Per le cellule epiteliali di fegato di ratto WB-F344, tre minuti di incubazione con la soluzione LY è sufficiente per il fronte del colorante di andare oltre quattro file di celle e un ingrandimento di 200X è ottimale. Le cellule sono coltivate su piastre di diametro 35 mm, che è abbastanza modificabile a loading il colorante nelle cellule con un bisturi. Tuttavia, le cellule possono essere coltivate in piccoli pozzi, ma l'uso di un bisturi non è possibile, in particolare in 96 piastre di coltura così. Per i piccoli pozzi, utilizzare un piccolo bordo con punta arrotondata taglio che può andare bene nel pozzo, e ancora una volta, utilizzare un azione di rotolamento. Questa azione di rotolamento è una fase critica in quanto è minimamente invasiva e fornisce una linea molto pulita di carico che impedisce alle cellule di essere strappato e creando un divario cell-free tipica del metodo raschiatura originale. In alternativa, un ago di agopuntura può essere utilizzata in cui una piccola torsione dell'ago fa un bel lavoro di colorante carico nelle celle.
Altri tipi di cellule possono essere utilizzati in questo test. Tuttavia, la selezione di cellule e comprendere i ruoli di GJIC in un particolare tipo di cellula è importante nella definizione opportune ipotesi e la progettazione degli esperimenti. Il primo e più ovvio passo è quello di sviluppare condizioni di coltura di cellule in cui giunzioni sono funzionali Expressed. In tipi di cellule ben differenziati, che svolgono funzioni metaboliche specifiche, giunzioni in genere svolgono un ruolo di coordinamento tra le vie metaboliche celle contigue. tipi di cellule ben differenziati hanno limitato, se qualsiasi, capacità proliferative e dei canali probabilmente svolgono un particolare ruolo metabolico dei tessuti che spesso dipende dalla morfologia e la disposizione specifica delle cellule. Ad esempio, miociti cardiaci sono cellule allungate in cui giunzioni sono prevalentemente allineate ai dischi intercalati, utilizzando quindi il metodo SL-DT richiederebbe l'allineamento delle cellule, che può essere fatto in un piatto scanalato. Così, attente considerazioni devono essere effettuate per ciascun tipo di cellula. Studi con colture cellulari neuronali in genere non sono confluenti e richiedono anche specifici punti di contatto, che rende l'uso di saggi appropriati alternativa GJIC SL-DT deve essere utilizzato.
In tipi di cellule proliferative, come le staminali e cellule progenitrici precoci, GJIC gioca un ruolo più criticonel coordinamento delle cellule di segnalazione di eventi che controllano l'espressione del gene che regola gli eventi mitogeni. Le cellule epiteliali di fegato di ratto WB-F344 utilizzati in questo protocollo rientra in questa categoria. I geni di giunzione Gap sono fondamentali durante lo sviluppo e la manutenzione dei tessuti 19-21. Sebbene canali gap junction sono espressi e formati su tutte le superfici della membrana plasmatica delle cellule, le cellule proliferative sono molto sensibili ai fattori di crescita, che inibiscono GJIC. Considerazioni critiche per tipi di cellule proliferative sono generalmente orientate più alla composizione del materiale. I fattori di crescita sono spesso in eccesso, in particolare in mezzo indefinito contenente siero bovino fetale, e giunzioni delle celle possono essere in uno stato chiuso. Il modo più semplice per stabilire GJIC in queste cellule è quello di ridurre o eliminare i livelli sierici di 4 a 24 ore prima della sperimentazione, anche se 24 ore sarebbe troppo lungo per le cellule senza siero come avrebbero Apoptose. Le cellule epiteliali WB-F344 fegato utilizzati per gli esperimenti presentati in tla carta non sono eccessivamente sensibili a siero senza la necessità di ridurre i livelli sierici. Al contrario, gli esperimenti utilizzando una linea cellulare del mouse C10 devono essere il primo siero privo di stabilire GJIC 22. Anche se i livelli sierici variano tra i due tipi di cellule, in modo interessante, le cellule C-10 hanno risposto in modo molto simile a isomeri metilici di antracene 22,23.
Altre considerazioni per risultati di qualità includono la conduzione di esperimenti a dosi non citotossiche. Le cellule devono essere controllati con il microscopio a contrasto di fase per determinare le caratteristiche morfologiche sani attesi del tipo di cellula prima e dopo il trattamento. Per assicurare che gli effetti di un composto sulla funzione gap junction non è dovuta ad una risposta citotossica generale, saggi di citotossicità per ciascun composto dovrebbe essere fatto allo stesso tempo e dose usata nel saggio SL-DT. Esecuzione di esperimenti per determinare se un effetto inibitorio di un composto sulla GJIC è reversibile è anche un buon esperimento per almeno due motivi. momentocomposti st testate reversibilmente inibiscono GJIC, ma se non c'è il recupero di GJIC, poi citotossicità potrebbero essere sarebbero necessari un fattore e ulteriori test. Tuttavia, se GJIC viene ripristinato quindi la dose e il tempo testati sono stati probabilmente non citotossica. Ci sono implicazioni biologiche per l'inibizione reversibile della GJIC. Gli effetti negativi sulla salute di molti agenti tossici e le tossine ambientali e di origine alimentare è un processo reversibile. Pertanto comprendere questo reversibilità a livello molecolare è importante. Se un composto sconosciuto non reversibile inibisce GJIC, allora le implicazioni per la salute di un organismo potrebbe essere molto diverso dalla maggior parte degli altri agenti e deve essere parte dei calcoli di rischio.
Determinare la dose e tempi necessari per l'inibizione di GJIC è un processo iterativo. Per risparmiare tempo e denaro per le forniture di cultura, l'approccio migliore è quello di iniziare ad una dose elevata, che dipende dalla solubilità e il tempo (in genere un'ora, come la maggior parte di inibizioneavviene in meno di 15 minuti), e quindi ridurre il tempo e la dose della metà in un processo passo saggio finché non vi è alcun effetto. Se non vi è alcuna inibizione alla dose elevata ad un'ora, quindi raddoppiare il periodo di tempo in un processo passo saggio. Gli esperimenti iniziali può essere fatto su un unico piatto. Una volta che le stime di tempo generali e le dosi sono stabiliti, quindi ulteriori studi approfonditi possono essere progettati in modo efficiente con adeguati dimensione del campione per le analisi statistiche. Una caratteristica del progetto sperimentale sarebbe quella di utilizzare la dose e il tempo che arrivano dal 75 al 100% di inibizione. Ovviamente, le interpretazioni finali dei risultati sarà un fattore di parametri di cui sopra. Tuttavia, determinando prima un effetto biologico, anche se la dose e il tempo non possono essere rilevanti in vivo, le dosi stabilite possono svolgere un ruolo in situazioni di esposizioni professionali, o alle popolazioni generali esposti ad altri fattori che influenza anche GJIC con potenziale additivo o effetti sinergici.
L'inibizione di GJIC dalla maggior parte dei composti in genere non è molto variabile e due a tre replicati (ciascun replicato sarebbe una piastra di coltura o ben) è sufficiente a generare dose e tempo curve di risposta. Tuttavia, se la variabilità è alto quindi più replicati sarebbero necessari per ottenere un valore preciso per una data variabile dipendente di uno studio indipendente. Naturalmente, almeno tre prove indipendenti devono essere fatte per le analisi statistiche.
La semplicità di questo test e la valutazione di significative dimensioni della popolazione cellulare è un vantaggio per molte applicazioni. Questo è particolarmente utile in molte valutazioni tossicologiche. Tuttavia, vi sono limitazioni dei saggi SL-DT, che può dipendere da vari fattori. Uno è se questa tecnica è appropriata per le cellule in fase di studio. Questo test non avrebbe funzionato bene per le cellule che non raggiungono alta confluenza con sporadici contatti in tutto il piastra di coltura o bene. Tecniche alternative, come la microiniezione dovrebbero essere considered. In alternativa, il saggio SL-DT può essere modificato. Il successo in singole celle di carico è stato raggiunto con un ago di agopuntura, che richiede una leggera azione di torsione durante il caricamento del colorante 7. La diffusione di colorante sarebbe radiale in situazioni più confluenti o amorfa attraverso colture cellulari con contatti sporadici cellulari. L'aggiunta di rodamina destrano (RD, 1 mg / ml) alla soluzione di colorante LY è raccomandato per esperimenti in cui identificare le cellule caricate sarebbe difficile senza un marcatore (ad esempio RD). RD è troppo grande per attraversare canali gap junction, individuando così che le cellule sono state caricate. RD può anche essere utilizzato in tutta dosaggio SL-DT, ma il bisturi lascia una rientranza sul fondo del piatto identificare dove le cellule vengono caricati. Il saggio SL-DT non è anche favorevole a misurare i cambiamenti in GJIC tra i diversi tipi di cellule, come il carico tintura non sarebbe discriminare tra i tipi di cellule. Anche in questo caso microiniezione è il metodo di scelta, ma il metodo di agopuntura migHT funzionare anche se si può indirizzare una cella specifica utilizzando un microscopio.
Il saggio di cooperazione metabolica è un altro metodo per misurare GJIC. Questo metodo è stato uno dei primi saggio biologico standardizzato per GJIC 24. In questo saggio, wild-type cellule V79 di criceto cinese (6-tioguanina-sensitive) e le cellule 6-tioguanina-resistenti sono stati co-coltura ad alta densità in cui 6-tioguanina (6-TG) cellule resistenti non metabolizzare 6-TG ad un metabolita tossico, conferendo in tal modo la resistenza. Co-coltura con le 6-TG sensibili cellule provoca il trasferimento del metabolita tossico attraverso giunzioni gap conseguente morte cellulare in cui l'inibizione della GJIC risultati in soccorso di 6-TG cellule resistenti impedendo il trasferimento del tossica metabolita 6-TG dalle cellule sensibili 6-TG. Sebbene un vantaggio di questo saggio è che è minimamente invasiva, uno svantaggio principale è che richiede una settimana per il completamento, che fa largo dose e tempo dipendenti valutazioni di toxirichiedenti nonché studi meccanicistici, ecc poco pratici per valutare molte sostanze chimiche.
Il saggio SL-DT non è favorevole a studi meccanicistici che hanno bisogno di tracciare la migrazione di coloranti attraverso diversi tipi di cellule, in cui microiniezione è il metodo preferito. In alternativa, le cellule possono essere precaricate con l'estere metilico di coloranti fluorescenti. Il caricamento del colorante è una funzione di esterasi metilici intracellulari che idrolizzano il colorante lipofile nella sua forma più idrofilo, intrappolando così il colorante nelle cellule. Questo è un modo meno invasivo per precaricare la sonda fluorescente, ma il metodo più comune per misurare comunicazione intercellulare in cui tutte le cellule sono precaricate con questo metodo è il test FRAP 11. Il vantaggio di FRAP è ancora una volta la capacità di valutare giunzioni in singole cellule, che è eccellente per gli studi meccanicistici. Tuttavia lo svantaggio di FRAP consiste in: l'incapacità di misurare popolazioni di cellule per valutazioni tossicologiche,la necessità di sofisticati e molto costosi citometri microscopi / laser, la necessità di competenze tecnico altamente specializzato, è moderatamente invasivo dai radicali liberi prodotti dal laser, e non favorisce alto rendimento.
Più recentemente è stato sviluppato un'altra tecnica; l'attivazione locale del metodo molecolare sonda fluorescente (LAMP) 25, che si basa su una nuova generazione di fluorofori cumarinici gabbia. Simile al test FRAP, tutte le celle sono precaricate con coloranti contenenti un estere metilico, tuttavia, questi coloranti diventano fluorescenti alla successiva illuminazione localizzata dal laser con una piccola dose di raggi ultravioletti, che probabilmente produce ROS significativamente inferiori FRAP. Ancora una volta, questo test ha le stesse limitazioni del test FRAP. Altre innovazioni recenti per la misurazione GJIC sono del precarico e paracadute tecniche, che prevedono anche l'uso di coloranti metil esteri-fluorescente. La tecnica comporta la sospensione precaricole cellule precaricato con sonda fluorescente unitamente alle controparti scaricati e vengono poi placcati e permesso di formare un monostrato confluente. La diffusione del colorante può essere osservato con un microscopio a epifluorescenza 26. Nel saggio paracadute, le cellule precaricate con la sonda fluorescente sono sovrapposti su un monostrato di cellule scaricati, e la diffusione del colorante è osservata con un microscopio a epifluorescenza 27. Anche in questo caso, le tecniche sopra sono tecnicamente più impegnativo per le analisi high throughput e deve essere immediatamente placcato in prossimità confluenza e richiede un intervallo di tempo per il riattacco delle cellule.
Nel complesso, il test SL-DT è una tecnica relativamente poco costoso, semplice e versatile che utilizza apparecchiature, come ad esempio incubatori cellulari di CO 2 cultura, cappe di sicurezza biologica e microscopio a epifluorescenza, tipicamente presenti nella maggior parte dei laboratori di coltura cellulare. Con l'esperienza minima molti piatti possono essere trattati in un giorno, che è favorevole fo lo screening di composti di tossicità, nonché per i prodotti naturali che impediscono o invertire gli effetti di sostanze tossiche e tossine. Inoltre, adattando questo test per un throughput elevato analisi utilizzando la robotica, con sistemi di imaging microscopia a fluorescenza e analisi automatizzata avrà il potenziale per lo screening un gran numero di sostanze tossiche e tossine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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