Summary
Denne protokol beskriver en skalpel loading-fluorescerende farvestof transfer teknik, der måler intercellulær kommunikation via gap junction kanaler. Gap junktion intercellulære kommunikation er en væsentlig cellulær proces, hvorved væv homeostase opretholdes og afbrydelse af denne cellesignalering har sundhedsskadelige virkninger.
Abstract
Denne protokol beskriver en skalpel loading-fluorescerende farvestof overførsel (SL-DT) teknik, der måler intercellulær kommunikation via gap junction kanaler, som er et stort intercellulære proces, hvorved væv homeostase opretholdes. Afbrydelse af kløften junktion intercellulær kommunikation (GJIC) ved giftstoffer, toksiner, stoffer mv har været forbundet med en række sundhedsskadelige virkninger. Mange genetiske baserede humane sygdomme er blevet forbundet med mutationer i gap junction gener. SL-DT teknik er en simpel funktionel analyse til samtidig vurdering af GJIC i en stor population af celler. Assayet involverer forpåfyldning celler med et fluorescerende farvestof ved kortvarigt at forstyrre cellemembranen med en skalpelblad gennem en population af celler. Det fluorescerende farvestof lades derefter krydse gennem gap junction kanaler til naboceller for et defineret tidspunkt. Assayet afsluttes derefter ved tilsætning af formalin til cellerne. Udbredelsen af fluospare- farvestof gennem en population af celler vurderes med en epifluorescensmikroskop og billederne analyseres med et vilkårligt antal morfometriske softwarepakker, der er tilgængelige, herunder gratis software pakker findes på det offentlige område. Dette assay er også blevet tilpasset til in vivo undersøgelser under anvendelse af vævssnit fra forskellige organer fra behandlede dyr. Alt i alt kan SL-DT assay tjene en bred vifte af in vitro-farmakologiske og toksikologiske behov, og kan potentielt tilpasses til high throughput set-up systemer med automatiseret fluorescens mikroskopi billedbehandling og analyse for at belyse flere prøver på kortere tid.
Introduction
Det overordnede mål med denne fremgangsmåde er at tilvejebringe en enkel, omfattende og forholdsvis billig teknik til at vurdere de potentielle toksiciteter af forbindelser. Dette er en in vitro fremgangsmåde, der kan anvendes i multiple cellelinier. Standard cellebiologiske laboratorier udstyret med epifluorescens mikroskoper kan foretage målinger ved hjælp af denne analyse.
Vores grundlæggende viden om cellefunktioner har været meget afhængig af in vitro-bioassays, og er blevet en væsentlig komponent i toksikologiske vurderinger af lægemidler, miljøforurening, og fødevarer født forureninger. Desværre er der ingen enkelt in vitro bioassay system, omfattende kan opfylde kravene til alle toksikologiske vurderinger. Mange in vitro-assays er udformet og optimeret til at evaluere samt vurdere en specifik biokemisk eller molekylær endepunkt. Disse er ofte kombineret i et højt gennemløb sat op til at afspejle en forstyrrelse af envisse signaltransduktionsvej, såsom østrogen-receptor signalering 1. Denne strategi har været ret vellykket, men det omfattende antal signaltransduktionsveje der er involveret i genekspression gør opgaven med at vælge en specifik signaleringsvej at vurdere temmelig komplekse. Høje gennemløb protokoller er under udvikling og anvendes til samtidigt at måle talrige signalveje, hvilket har været en fremgangsmåde for at eliminere nogle af begrænsningerne af enkelte assays. Imidlertid har ikke alle signalveje blevet indarbejdet i mere omfattende metoder, plus nye signalveje konstant bliver opdaget, at yderligere komplicerer denne vurdering proces. Brug omfattende antal af in vitro-metoder, særligt høje gennemgående sat systemer, for omfattende toksikologiske vurderinger er også meget dyrt og er ikke befordrende for de fleste enkelt investigator førte forskningsprojekter.
GJIC er en proces tightly styret af ændringer i spænding, calcium koncentration, pH, redox balance, reguleret af de store intracellulære signaltransduktionsveje og interaktioner med membran og cytoskeleton proteiner 2,3. Således kan inhibering af GJIC afspejle forskellige typer af cellulært stress, forstyrrelser i forskellige cellulære funktioner, eller forstyrrelser af forskellige signaltransduktionsveje. En anden fremgangsmåde for at eliminere anvendelsen af begrænsede signaltransduktionsveje bioassays er at drage fordel af de biologiske fænomener, at mange, hvis ikke de fleste, signaltransduktionsveje er yderligere moduleret af kooperative intercellulære signalsystemer via gap junction kanaler 4-8. Selvom intercellulære signalsystemer er også talrige og under flere kontrol-biosyntesen, intercellulære signalering via gap junction-kanaler er i sidste ende en funktion af kanalerne åbnes, delvist lukket eller helt lukket. Dette tilvejebringer et endepunkt, der let kan måles ved anvendelse af forskelligein vitro bioassay-systemer 7. I betragtning af at den homøostatiske sæt punkt i et væv kræver åbne kanaler, bestemmelse af effekten af forbindelser på kløften junktion intercellulær kommunikation (GJIC) er en mere omfattende tilgang til at bestemme potentielle toksiske virkninger af forbindelser 4,8. I det væsentlige, denne kritiske biologiske fænomen, der spiller en central rolle i koordineringen af flere signal transduktion begivenheder kontrollerer genekspression giver mulighed for en bred vurdering af toksiske virkninger. Således bioassays, der vurderer GJIC er et glimrende udgangspunkt for at vurdere toksiske potentiale af forbindelser.
De mest omfattende teknikker anvendes til at vurdere GJIC er baseret på forbelastning celler med en fluorescerende probe og derefter overvåge migrationen af farvestoffet fra den belastede celle eller celler til tilstødende celler. Teknikker forudindlæser farvestoffet har involveret mikroinjektion 9, skrabe loading 10, og methylestere af sonderne 11 10. Snarere end den mere invasive skrabe, skalpel loading fremgangsmåden ifølge denne rapport indebærer en blid rulle af en skalpel med en rund klinge gennem et monolag af celler, der minimerer invasive skader (figur 1). Fordelene ved denne teknik er den toksikologiske vurdering af en population af celler i stedet for enkelte celler af mikroinjektion assay. Endvidere enkelheden i dette assay tillader hurtig detektion af multiple plader på kort tid henviser metoder under anvendelse mikroinjektion teknikker og teknikker, der bruger methylestere af fluorescerende prober er betydeligt mere tidskrævende og kræver væsentligt højere færdighedsniveau.
Selv om der ikke er nogen enkelt metode til at opfylde alle de behov, studere GJIC; SL-DT-assay er en simpel, forholdsvis billig og alsidig assay, der kanmøde mange af behovene for indledende vurderinger af toksicitet af forskellige forbindelser. Større fordele kan nævnes: enkelhed, ingen særlige behov for udstyr eller færdigheder, der kræves for andre metoder såsom mikroinjektion, fluorescerende bedring efter fotoblegning (FRAP) assay og lokal aktivering af molekylære fluorescerende probe assays, en hurtig og samtidig vurdering af GJIC i et stort antal celler, der bidrager til en høj produktion set-up med automatiseret fluorescens mikroskopi billedbehandling og analyse, samt dens tilpasningsevne til in vivo undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og Udnyttelse udvalg af National Institutes of Health Sciences i Japan, hvilket er hvor in vivo forsøg blev gjort, for at sikre, at rotterne blev behandlet humant og med hensyn til lindring af lidelse.
1. SL-DT Bioassay
- Seed 3 x 10 5 WB-F344 rottelever epitelceller onto 35 mm diameter dyrkningsplader indeholdende Eagles modificeret medium plus 5% føtalt bovint serum, og dyrke cellerne i en inkubator ved 37 ºC, 100% relativ fugtighed (RH), 5% CO2.
- Dyrke cellerne, indtil de når 100% konfluens (typisk 2 dage) og udføre den ønskede eksperimentel behandling af cellerne, som beskrevet nedenfor.
- Udføre Dose Respons Eksperimenter
- Tilsæt 10 pi og 20 pi af en 2 mM stamopløsning af phenanthren i 100% acetonitril og 4 pi, 6 pi, og 8 pi af en 20 mM stamopløsning af phenanthrene i 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium for hver tilsat mængde stamopløsning.
- Tilsæt 4 pi, 6 pi, 8 pi, 10 pi, og 20 pi af en 100% opløsning af acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium for hver tilsat mængde acetonitrilopløsning at tjene som vehikelkontrollen.
- Pladerne inkuberes i 15 minutter i en inkubator indstillet til 37 ° C, 100% RH og 5% CO2.
- Fortsæt til trin 1.3.
- Conduct Time Eksperimenter Respons
- Tilføj 7 pi af en 20 mM stamopløsning af phenanthren i 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium for hvert tidspunkt (dvs. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- Tilføj 7 pi 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium for hvert tidspunkt til at tjene som kontrol køretøjet.
- Pladerne inkuberes for hver udpeget tid pBlandede i en inkubator ved 37 ° C, 100% RH og 5% CO2.
- Fortsæt til trin 1.3.
- Udføre Time Recovery Eksperimenter
- Tilføj 7 pi af en 20 mM stamopløsning af phenanthren i 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium i 15 min.
- Tilføj 7 pi 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium i 15 minutter for at tjene som kontrol køretøjet.
- Dekanteres mediet indeholdende enten phenanthren eller acetonitril og skyl 3x hver med 3 ml phosphatpufret saltvand (PBS).
- Tilsæt 2 ml frisk vækstmedium til hver plade og inkuberes i de ønskede restitutionstider (dvs. 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) i en inkubator ved 37 ° C, 100 % RH og 5% CO2.
- Fortsæt til trin 1.3.
- Conduct Mechanism Eksperimenter
- Tilsæt signaltransduktionsinhibitor, dvs.
- Tilsæt 5 pi 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium i 15 minutter for at tjene som kontrol køretøjet.
- Tilføj 7 pi af en 20 mM stamopløsning af phenanthren i 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium plus D609 i yderligere 15 min.
- Tilføj 7 pi 100% acetonitril til tre plader af celler indeholdende 2 ml vækstmedium plus 100% acetonitril i yderligere 15 minutter for at tjene som kontrol køretøjet.
- Fortsæt til trin 1.3.
- Udføre Dose Respons Eksperimenter
- Kassér dyrkningsmediet ved enten forsigtigt at hælde mediet eller ved vakuumsugning.
Bemærk: Bortskaf dyrkningsmedium indeholdende farligt affald korrekt. - Skyl cellerne tre gange hver med 3 ml PBS og enten dekanteres eller aspirat between skylninger.
- Pipetter 1 ml 1 mg / ml Lucifer gult farvestof opløst i PBS (LY) i hver celle plade.
- Forudindlæs farvestoffet i cellerne ved forsigtigt at rulle en # 20 kirurgisk stål klinge med en afrundet kant gennem en population af celler i tre forskellige områder af pladen.
- Begynd med at placere skalpel vinkelret (90 ° vinkel) og 5 mm fra kanten af dyrkningspladen, og derefter rulle skalpellen fra denne vinkelrette vinkel til omkring en vinkel på 15 ° (se figur 1).
Bemærk: Dette opnås ved at klemme skalpellen mellem pegefingeren og tommelfingeren. Brug tyngdekraften til at tillade skalpel til forsigtigt gå fra de 90 ° til 15 ° positionen (som den afrundede klinge simpelthen ruller over cellerne). Denne bevægelse vil efterlade en visuelt mærkbar indrykning linje.
- Begynd med at placere skalpel vinkelret (90 ° vinkel) og 5 mm fra kanten af dyrkningspladen, og derefter rulle skalpellen fra denne vinkelrette vinkel til omkring en vinkel på 15 ° (se figur 1).
- Inkubér cellerne med LY opløsning i 3 min ved stuetemperatur.
- Dekanteres eller aspirere den LY og skyl tre gange med 3 ml PBS for at fjerne alle extracellular farvestof for at fjerne ekstracellulær baggrundsfluorescens.
- Tilsæt 0,5 ml 10% phosphatbufret formalinopløsning at fikseres cellerne.
Bemærk: Efter fastsættelse i formalin, lufttørre cellerne og opbevar i mørke i op til to år med minimum fotoblegning af LY farvestof. Når det er påkrævet, rehydrere med 10% formalinopløsning at visualisere det fluorescerende farvestof fronten. - Se de faste celler ved hjælp af en epifluorescensmikroskop udstyret med en dichroic terning for excitation / emission toppe af 428/536 nm ved en forstørrelse på 200X. Tilpasse alle plader, således at indrykningen linje er parallel med den horisontale synsfelt.
Bemærk: En FITC dichroic terning fungerer godt.- Tage billedet med et CCD-kamera og understøttende software.
- Åbn understøttende software til CCD-kameraet og bruge indstillingerne til automatisk eksponering. Brug knappen "capture" til digitalt hente billedet. Gem billedet som .tif filer ved hjælp af knappen "Gem".
2. Tilpasning af SL-DT Assay til levervæv
- Fjern ca. 2 x 2 cm skive fra venstre lap af en lever fra en 5 uger gamle, mandlige Fischer 344 rotter ved hjælp af dissektion saks og placere den på en plastik afvejes plade dækket med våde gaze 12.
- Pipetter 0,5 ml af en PBS-opløsning indeholdende 1 mg / ml af hver af lucifer gul og rhodamin-dextran (RD) på overfladen af leveren skive i plasten veje pladen.
Bemærk: RD er et farvestof, der ikke kan krydse gap junction-kanaler og vil markere de celler, der blev indlæst. - Foretag tre til fem indsnit ca. 1 cm lange på overfladen af leveren skive, der har farveopløsningen i indvejningen plade med en skarp kniv og derefter tilføje yderligere farvestof tilstrækkelig til at fylde indsnit.
- Inkuber vævet i 3 min ved stuetemperatur på plastik vejer pladen.
- Skyl tre gange med 5 ml PBS.
- Fastgør vævet overnight i 30 ml 10% phosphatpufret formalin i en 50 ml konisk centrifugerør i mørke ved stuetemperatur.
- Den følgende dag, vaske skiverne med vand, trim væv omkring snittet med dissekere saks i 1 x 1 x 0,5 cm 3 strips og derefter bruge standard teknikker til at integrere skiverne i paraffin 13.
- Afsnit skiverne vinkelret på snittet linje til tykkelse på 5 um og gemme prøverne i mørke, indtil klar til at blive afbildet ved hjælp af standard sektionsopdelingen teknikker med en mikrotom 13.
- Brug en epifluorescensmikroskop udstyret med en CCD digital kamera til at visualisere og fange billeder af de fluorescerende farvestof fronter efter § 1.10 7.
3. Kvantificering GJIC
- Mål fluorescerende farvestof spredning ved anvendelse af en morfometrisk softwarepakke (f.eks ImageJ).
- Klik på fanen "File" og derefter klikke på "åben" for at åbnegemte billede.
- Klik på "Free Hand Tool" i værktøjslinjen Tab for at spore omridset af farvestoffet front.
- Klik på fanen "Analyser" og derefter klikke på "Measure".
Bemærk: Dette vil generere en værdi område i et regneark, som kan kopieres til andre regneark programmer, hvis det ønskes.
- Brug af et regnearksprogram, beregne den del af kontrollen (FOC) ved at dividere arealet af farvestoffet spredning i den eksperimentelle plade med arealet farvestoffet rejste i styrepladen ved følgende formel:
En e = areal af farvestoffet spredning i celler udsat for en eksperimentel variabel, såsom celler behandlet med en kemisk på en specifik dosis eller tid
A c = areal af farvestoffet spredning i kontrollen, som er celler behandlet med køretøjet anvendes til at opløse den kemiske interesse
Bemærk: For at bestemme virkningen af køretøjet,En e ville være det område af farvestoffet spredning i celler behandlet som køretøjet og en C ville være det område af farvestoffet spredning i celler ikke behandlet med køretøjet. Virkningen af køretøjet bør fortrinsvis være mindre end 10%.
- Tage billedet med et CCD-kamera og understøttende software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afbrydelse af GJIC er blevet flittigt brugt som biomarkør til at identificere giftige stoffer på ikke genotoksisk, epigenetisk niveau af gen kontrol, inducerer sundhedsskadelige virkninger 14. For eksempel polycykliske aromatiske hydrocarboner (PAH) er allestedsnærværende miljøforurenende stoffer, men varierer i deres epigenetiske toksiciteter som en funktion af deres molekylære strukturer 15. De lavere molekylvægt PAH'er findes typisk ved relativt højere koncentrationer end de højere molekylvægt PAH'er i mange forskellige miljøer såsom forurenede flodsedimenter til at af cigaretrøg 15,16. Phenanthren er et eksempel på et lavmolekylært PAH, der besidder tre benzenringe med en vinkelformet lomme kaldet bugten region. Figur 2 er en serie af SL-DT billeder af WB-F344 rottelever epiteliale celler behandlet med stigende doser af phenanthren. Bemærk faldet i migration of det fluorescerende farvestof, Lucifer Yellow, med stigende doser. De områder af de scannede billeder kan bestemmes som en del af kontrollen (FOC). Kontrollen for figur 2 behandles celler med opløsningsmidlet, at PAH blev opløst i, nemlig acetonitril. Typisk SL-DT forsøg udføres dobbelt eller tredobbelt for hvert forsøg med et minimum af tre uafhængige forsøg for hver forsøgsgruppe parameter, hvilket ville være en dosis i dette forsøg. De FOC værdier kan derefter gennemsnit, statistisk analyseret, og derefter tegnes (se figur 3).
Lignende forsøg også rutinemæssigt til at fastslå tidspunktet for giftstoffet-induceret hæmning af GJIC, og tidsperioden nødvendig for at komme sig efter denne giftstof-induceret hæmning af GJIC efter at cellerne overføres til giftstof-frit medium. Figur 4 viser både tid respons og genrejsning hæmning af phenanthren (Phe). SL-DT analyse kan også anvendes til at bestemme de underliggende mekanismer, som giftstof og toksiner dysregulate GJIC 4,16. Dette gøres ved at præ-inkubere celler med en farmaceutisk inhibitor af en udvalgt signalvej før tilsætningen af giftstoffet eller toksin der dysregulates GJIC. Hvis giftstof eller toksin ikke længere dysregulates GJIC i tilstedeværelse af en udvalgt farmaceutisk, der blokerer en signalvej, så er denne vej er bestemt til at være en regulerende vej af GJIC, mens sådanne veje kan udelukkes, hvis giftstoffet fortsætter dysregulate GJIC. Figur 5 viser dette principal hvori 1-methylanthracene (1-MEA), en anden tre ringmærket PAH som inhiberer GJIC, men ikke i nærvær af D609, som er en temmelig specifik inhibitor af phosphatidylcholin specifik phospholipase C (PC-PLC). Således er PC-PLC regerede i som kandidat signalering enzym involveret i en-MEA-induceret hæmning af GJIC. Rolle PC-PLC er blevet valideret med fDERLIGERE eksperimenter 4,16. Samlet set SL-DT-analyser er ganske befordrende for begynde processen med kortlægning signalering netværk involveret i mekanismerne for, hvordan giftstoffer og toksiner hæmmer (dysregulate) GJIC. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til screening for naturlige produkter, der kan blokere en giftstof eller toksin fra dysregulating GJIC. For eksempel, resveratrol, en antioxidant, som findes i høje koncentrationer i rødvin og jordnøddeolie produkter kan forebygge 1-MEA fra inhibering GJIC (figur 6).
SL-DT assay er blevet tilpasset til vævssnit fra dyr, især i leveren 17. Perfluoroktansyre (PFOA) er en 8-carbon fluoreret fedtsyre, der er et vedvarende miljøforurening vides at inducere levercancere 12,17. Brug af SL-DT teknik PFOA blev vist at inhibere GJIC i en in vitro WB-F344rat liver modelsystem 18. En in vivo opfølgende undersøgelse theermined at PFOA hæmmede også GJIC i lever fra F344 rotter behandlet med PFOA, dermed validering af in vitro model-system 12,17. Figur 7 er fluorescerende billeder fra denne opfølgning eksperiment viser farvestoffet spredning i leveren væv rotter behandlet med køretøjet og PFOA.
Figur 1: Cartoon billede af skalpel farvestof lastning trin. En illustration, der viser, at skalpellen læsningen involverer rullende klingen i stedet for vandret udskæring gennem cellerne for at minimere celleskader.
Figur 2: Repræsentative fluorescerende mikroskopiske billeder af farvestoffet spredes gennem gap junctions. WB-F344 rottelever epitelceller blev behandlet i 15 min med ikrøl doser af phenanthren, en udbredt PAH findes i miljøet. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: dosisreaktionskurve af phenanthren-behandlede WB-F344 rottelever epitelceller. Områder i SL-DT billeder blev beregnet og derefter rapporteres som en brøkdel af den kontrol, der var celler behandlet med køretøjet (acetonitril). Hvert datapunkt er et gennemsnit af tre uafhængige forsøg, og fejlsøjlerne er standardafvigelserne på konfidensgrænse på 95% for hver dosis efter en 15 min eksponeringstid. En fire-parameter logistisk funktion blev anvendt til at passe til linien gennem datapunkterne. venligst CLIck her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Igen og genvinding respons kurve af phenanthren-behandlede WB-F344 rotte lever epitelceller. Efter fuldstændig inhibering af GJIC efter 10 minutter af eksponering blev mediet indeholdende phenanthren (Phe) skiftes til Phe-frit medium og derefter cellerne blev overvåget for restitution fra inhibering. Områder i SL-DT billeder blev beregnet og derefter rapporteres som en brøkdel af den kontrol, der var celler behandlet med køretøjet (acetonitril). Hvert datapunkt er et gennemsnit af tre uafhængige forsøg, og fejlen barer er standardafvigelserne på grænsen på 95% tillid. Klik her for at se en større version af dette tal.
her.within-side = "1"> 
Figur 5: Hæmning af GJIC ved 1-methylanthracene er afhængig af fosfatidylcholin specifikke phospholipase C. 1-methylanthracene (1-MEA) er en udbredt PAH findes i miljøet. Det venstre panel repræsenterer celler behandlet med køretøjet (acetonitril, 0,35% volumen / volumen). Den midterste panel repræsenterer WB-F344 rotte lever epitelceller behandlet i 15 min med 70 pM 1-MEA. Det højre panel repræsenterer celler forbehandlet først i 20 minutter med 50 uM D609, en phosphatidylcholin specifik phospholipase C-hæmmeren, efterfulgt af tilsætning af 70 uM 1-MEA i yderligere 15 min. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
281fig6.jpg "/>
Figur 6: Resveratrol forhindrede hæmning af GJIC ved 1-methylanthracene. Det venstre panel repræsenterer celler behandlet med køretøjet (acetonitril, 0,35% volumen / volumen). Resveratrol er en antioxidant, som findes i rødvin og peanut produkter. Den midterste panel repræsenterer celler behandlet i 15 min med 70 pM 1-MEA. Højre panel repræsenterer celler først forbehandlet i 20 minutter med 50 uM resveratrol efterfulgt af tilsætning af 70 uM 1-MEA i yderligere 15 min. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Ex vivo SL-DT analyser af GJIC i leveren skiver fra mandlige F-344 rotter. Den venstre panel repræsenterer en skive lever tissue fra en rotte behandlet med vehikelkontrol, dimethylsulfoxid, i 24 timer. Højre panel repræsenterer et udsnit af levervæv fra en rotte efter intraperitoneal administration af 100 mg / kg perfluoroctansyre (PFOA) efter 24 timer. PFOA, en udbredt miljøforurening, er et tumorfremmende peroxisomproliferatoraktiveret der inducerer hepatomegali og påvist at blokere gap junctions anvendelse af en in vitro-model. Snittet er lagt farvestof blev udført på leveren skiver fra køretøjet og PFOA behandlede dyr, som derefter blev fastsat, trimmes og sektionerede. Gengivet fra Environmental Health Perspectives 12. Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SL-DT-analysen er en enkel og alsidig teknik måling GJIC, men der er flere kritiske bekymringer, der skal bogføres i at designe passende eksperimentelle protokoller. For robuste målinger af GJIC anvender SL-DT-assay skal der være et godt farvestof spredning af LY gennem gap junctions af cellerne. Som minimum bør vælges en passende tid til at sikre, at farvestoffet spredes gennem otte eller flere rækker af celler fra skalpellen indlæst celler i begge retninger. Også for den lette målingen af afstanden, at farvestoffet migreret fra skalpel indlæst celler, vælg forstørrelse faktor, der sikrer farvestoffet spredning af kontrolpladerne fylder 70 til 90% af synsfeltet. For WB-F344 rottelever epitelceller, tre minutters inkubering med LY opløsningen er tilstrækkelig til farvestoffronten at bevæge sig ud over fire celle rækker, og en forstørrelse på 200X er optimal. Celler dyrkes på plader diameter 35 mm, hvilket er ganske amendable at loading farvestoffet ind i cellerne med en skalpel. Imidlertid kan celler dyrkes i små brønde, men brugen af en skalpel ikke er muligt, navnlig i dyrkningsplader med 96 brønde. For små brønde, bruge en lille rund spids forkant, der kan passe ind i brønden, og igen, bruge en rullende handling. Denne rullende handling er et kritisk trin, som det er minimalt invasiv og giver en meget ren linje lastningen der forhindrer cellerne i at blive revet, og skabe et stort cellefri mellemrum typisk for den oprindelige skrabning metode. Alternativt kan en akupunkturnål anvendes hvor en lille twist af nålen gør et nice job påføringsfarvestof i cellerne.
Andre celletyper kan anvendes i dette assay. Imidlertid selektion af celler og forstå roller GJIC i en bestemt celletype er væsentlige ved udformningen passende hypoteser og udformningen af forsøgene. Den første og mest indlysende skridt er at udvikle celledyrkningsbetingelser hvori funktionelle gap junctions er expressed. I godt differentierede celletyper, som udfører specifikke metaboliske funktioner, gap junctions spiller typisk en rolle i koordineringen metaboliske veje mellem tilstødende celler. Well-opdelte celletyper har begrænset, hvis nogen, proliferative kapacitet og kanalerne sandsynligvis spille en vævsspecifik metabolisk rolle, ofte afhænger af morfologi og specifik indretning af celler. For eksempel er hjertemyocytter er langstrakte celler, hvor gap junctions overvejende rettet ind på det indlejrede skiver, således anvender SL-DT metode ville kræve justering af cellerne, hvilket kan gøres i en rillet skål. Derfor skal omhyggelige overvejelser foretages for hver celletype. Undersøgelser med neuronale cellekulturer er typisk ikke sammenflydende og også kræver specifikke kontaktpunkter, som gør brug af SL-DT upassende og alternativ GJIC assays skal anvendes.
I proliferative celletyper, såsom stamceller og tidlige progenitorceller, GJIC spiller en mere kritisk rollei koordineringen cellesignalerende begivenheder, der styrer genekspression regulering mitogene begivenheder. De WB-F344 rotte lever epitelceller anvendes i denne protokol falder ind under denne kategori. Gap junction gener er kritisk under væv udvikling og vedligeholdelse 19-21. Selvom gap junction kanaler er udtrykt og udformet på alle celleplasmamembranen overflader, proliferative celler er meget følsomme over for vækstfaktorer, som inhiberer GJIC. Kritiske overvejelser for proliferative celletyper sædvanligvis orienteret mere til sammensætningen af mediet. Vækstfaktorer er ofte i overskud, især i undefined medium indeholdende føtalt bovint serum, og cellernes gap junctions kan være i en lukket tilstand. Den nemmeste måde at etablere GJIC i disse celler er at reducere eller fjerne serumniveauer i 4 til 24 timer før eksperimenter, selvom 24 hr ville være for lang for celler uden serum, som de ville apoptose. De WB-F344 lever epitelceller anvendes til forsøgene præsenteres i thans papir er ikke alt for følsomme til serum uden behov for at reducere serumniveauer. I modsætning hertil skal forsøg med en C10 mus cellelinie være første serum berøvet at etablere GJIC 22. Selvom serumniveauer varierer mellem de to celletyper, interessant, C-10 celler reagerede meget på samme måde som methyl isomerer af anthracen 22,23.
Andre overvejelser for kvalitet resultater omfatter udførelse af eksperimenter ved ikke-cytotoksiske doser. Celler skal kontrolleres med fasekontrastmikroskopi at bestemme sunde morfologiske egenskaber, der forventes af den celletype før og efter behandling. For at sikre, at virkningerne af en forbindelse på gap junction-funktionen ikke skyldes en generel cytotoksisk respons, bør cytotoksiske assays for hver forbindelse udføres på samme tid og dosis i den SL-DT assay. Gennemføre eksperimenter for at bestemme om en inhiberende virkning af en forbindelse på GJIC er reversibel er også en god eksperiment i mindst to grunde. Motestet reversibelt st forbindelser inhiberer GJIC, men hvis der ikke er inddrivelse af GJIC, så cytotoksicitet måske ville være behov for en faktor, og yderligere test. Men hvis GJIC er genoprettet derefter dosis og testet tid var sandsynligvis ikke cytotoksisk. Der er biologiske implikationer for den reversible inhibering af GJIC. De sundhedsskadelige virkninger af mange miljømæssige og fødevarer bæres giftstoffer og toksiner er en reversibel proces. Derfor forstå denne reversibilitet på det molekylære niveau er vigtig. Hvis en ukendt forbindelse, ikke reversibelt hæmmer GJIC, så konsekvenserne for sundheden for en organisme kunne være helt forskellig fra de fleste andre agenter og skal være en del af beregningerne de risikofaktorer.
Fastsættelse af dosis og tid involveret i inhibering af GJIC er en iterativ proces. For at spare tid og penge til kultur forsyninger, den bedste fremgangsmåde er at begynde på en høj dosis, som afhænger af opløselighed og tid (typisk en time, da de fleste hæmningforekommer i mindre end 15 min), og derefter reducere den tid og dosis til det halve i en trinvis proces, indtil der ikke er nogen virkning. Hvis der ikke er inhibering ved en høj dosis på en time, hvorefter fordoble det tidsrum i en trinvis proces. Indledende forsøg kan udføres på en enkelt plade. Når de generelle tid skøn og doser er etableret, så flere grundige undersøgelser kan effektivt designet med passende stikprøvestørrelser til statistiske analyser. En eksperimentel design funktion vil være at bruge dosis og tid, der har nået 75 til 100% hæmning. Selvfølgelig vil de endelige fortolkninger af resultater være en faktor af de ovennævnte parametre. Men ved først at bestemme en biologisk virkning, selv om dosen og tid ikke kan være relevante in vivo, kan de etablerede doser spille en rolle i situationer med erhvervsmæssig eksponering, eller overordnede populationer er udsat for andre faktorer, der også påvirke GJIC med potentiel additiv eller synergistiske virkninger.
Inhiberingen af GJIC af de fleste forbindelser typisk ikke meget variabel og to til tre gentagelser (hver gentagelse ville være en dyrkningsplade eller brønd) er tilstrækkelig til at frembringe dosis og respons-kurver. Men hvis variabilitet er høj så flere gentagelser vil være behov for at få en præcis værdi for en given afhængige variabel af en uafhængig retssag. Selvfølgelig skal gøres for statistiske analyser mindst tre uafhængige forsøg.
Enkelheden i dette assay og vurdering af væsentlige cellepopulation størrelser er en fordel for mange anvendelser. Dette er særligt nyttigt i mange toksikologiske vurderinger. Der er dog begrænsninger af SL-DT assays, som kan afhænge af flere faktorer. Den ene er, om denne teknik er egnet til cellerne der undersøges. Denne analyse vil ikke fungere godt for celler, der ikke når høj sammenflydning med sporadiske kontakter i hele kulturen plade eller godt. Alternative teknikker, såsom mikroinjektion bør coafskridtning betragtes. Alternativt kan SL-DT assay modificeres. Succes i lastning enkelte celler er blevet opnået med en akupunktur nål, som kræver en let drejende handling, når du lægger farvestoffet 7. Udbredelsen af farvestof ville være radial i mere sammenflydende situationer eller amorf gennem cellekultur med sporadiske celle kontakter. Tilsætningen af rhodamin dextran (RD, 1 mg / ml) til LY farveopløsning anbefales til eksperimenter, hvor identifikation af de belastede celler ville være vanskeligt uden en markør (såsom RD). RD er for stor til at krydse gap junction-kanaler, således identificere, hvilke celler blev indlæst. RD kan også anvendes i alle SL-DT-assay, men skalpellen efterlader en fordybning i bunden af skålen identificere, hvor cellerne er indlæst. SL-DT-analysen er heller ikke befordrende for måling af ændringer i GJIC mellem forskellige typer af celle som farvestoffet belastning ville ikke diskriminere mellem celletyper. Igen mikroinjektion er den foretrukne metode, men den akupunkturnål metode MIGht også arbejde, hvis man kan målrette en bestemt celle ved hjælp af et mikroskop.
Den metaboliske samarbejde assay er en anden metode til at måle GJIC. Denne metode var en af de første standardiserede bioassay for GJIC 24. I dette assay vildtype kinesisk hamster V79-celler (6-thioguanin-følsomme) og 6-thioguanin-resistente celler blev co-dyrket ved høje densiteter, hvor 6-thioguanin (6-TG) resistente celler ikke metaboliserer 6-TG til en toksisk metabolit, hvorved der giver resistens. Co-kultur med følsomme celler resulterer de 6-TG i overførslen af den toksiske metabolit gennem gap junctions resulterer i celledød, hvor inhibering af GJIC resulterer i redningen af 6-TG-resistente celler ved at forhindre overførsel af det toksiske 6-TG metabolit fra 6-TG sensitive celler. Selvom en fordel ved dette assay er, at det er minimalt invasiv, en stor ulempe er, at den kræver en uge for færdiggørelse, hvilket gør omfattende dosis og tidsafhængige vurderinger af toxigere samt mekanistiske undersøgelser osv upraktisk til at vurdere mange kemikalier.
SL-DT-assay er ikke befordrende for mekanistiske undersøgelser, der skal spore migrering af farvestoffer gennem forskellige celletyper, i hvilke mikroinjektion er den foretrukne metode. Alternativt kan celler indlæst med methylesteren af fluorescerende farvestoffer. Lastningen af farvestoffet er en funktion af intracellulære methyl esteraser, som hydrolyserer den lipofile farvestof i dets mere hydrofil form således fange farvestof i cellerne. Dette er en mindre invasiv måde at forbelaste fluorescerende probe, men den mest almindelige måde at måle intercellulær kommunikation, hvor alle celler er forbelastet ved denne fremgangsmåde er FRAP assay 11. Fordelen ved FRAP er igen evnen til at vurdere gap junctions i enkelte celler, som er fremragende til mekanistiske undersøgelser. Men ulempen ved FRAP ligger i: den manglende evne til at måle populationer af celler til toksikologiske vurderinger,behovet for sofistikerede og meget kostbare mikroskoper / laser cytometre, behovet for højt kvalificeret teknisk ekspertise, er moderat invasiv fra de frie radikaler produceret af laser, og ikke befordrende for high throughput.
For nylig en anden teknik er blevet udviklet; den lokale aktivering af molekylær fluorescerende probe (LAMP) metode 25, som er baseret på en ny generation af bur coumarinlignende fluoroforer. Svarende til FRAP assay alle celler indlæst med farvestoffer indeholdende en methylester, men disse farvestoffer bliver fluorescerende ved efterfølgende lokaliseret belysning med lasere med en lille dosis af ultraviolet lys, som sandsynligvis producerer betydeligt lavere ROS end FRAP. Igen, dette assay har de samme begrænsninger for FRAP assay. Andre nylige fremskridt til måling GJIC er forbelastningen og faldskærm teknikker, som også indebærer anvendelse af methyl ester-fluorescerende farvestoffer. Forbelastningen teknik indebærer suspensioncellerne indlæst med fluorescerende probe sammen med de lossede modparter og udplades derefter og får lov at danne et konfluent monolag. Udbredelsen af farvestoffet kan derefter iagttages ved et epifluorescensmikroskop 26. I faldskærm assay cellerne indlæst med den fluorescerende probe lagt oven på et monolag af losses celler, og spredning af farvestoffet observeres med et epifluorescensmikroskop 27. Igen er de ovennævnte teknikker er teknisk mere udfordrende for high throughput analyser, og skal straks udpladet ved nær konfluens og kræver en tidsforskydning for refiksation af celler.
Samlet, SL-DT-analysen er en relativt billig, enkel og alsidig teknik, der bruger udstyr, såsom CO 2 cell culture inkubatorer, biosikkerhed kabinetter og epifluorescensmikroskop, der typisk findes i de fleste cellekultur labs. Med minimal erfaring mange plader kan behandles på en dag, hvilket er befordrende feller screening forbindelser for toksicitet såvel som for naturlige produkter, der forhindrer eller vende virkningerne af giftstoffer og toksiner. Også tilpasningen af denne assay for high throughput analyser under anvendelse robotter, med automatiserede fluorescensmikroskopi billeddannelse og analyse systemer vil have potentiale til at screene et stort antal toksiske stoffer og toksiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
