Summary
このプロトコルは、ギャップ結合チャネルを介して細胞間通信を測定メスローディング蛍光色素転写技術が記載されています。ギャップジャンクション間の通信は、組織の恒常性を維持し、この細胞シグナル伝達の破壊は健康への悪影響がありますされる主要な細胞プロセスです。
Abstract
このプロトコルは、組織の恒常性が維持されることにより、主要な細胞間プロセスであるギャップ結合チャネルを介して細胞間の通信を、測定メスローディング蛍光色素転写（SL-DT）技術が記載されています。 などの毒物、毒素、薬物によるギャップ結合細胞間コミュニケーション（GJIC）の中断は、多くの健康への悪影響にリンクされています。多くの遺伝ベースのヒト疾患は、ギャップジャンクション遺伝子の変異にリンクされています。 SL-DT技術は、細胞の大集団におけるGJICの同時評価のためのシンプルな機能アッセイです。アッセイは、簡単に細胞集団を介して手術用メスの刃を有する細胞膜を摂動することによって蛍光色素でプレローディング細胞を含みます。蛍光色素は、その後、指定された時間のための隣接セルにギャップ結合チャネルを介して通過することを許可されています。アッセイは、その後、細胞にホルマリンを添加することによって終了されます。 FLUOの広がり細胞の集団を通じrescent染料は、落射蛍光顕微鏡で評価され、画像はパブリックドメインで検出されたフリーソフトウェアパッケージを含む利用可能である形態計測ソフトウェアパッケージ、任意の数を用いて分析されています。このアッセイはまた、処置された動物からの種々の臓器からの組織切片を用いたin vivo試験のために適応されています。全体的に、SL-DTアッセイは、in vitroでの薬理学的および毒物学的ニーズの広い範囲を提供することができ、潜在的に、より短い時間でより多くのサンプルを解明するために、自動化蛍光顕微鏡イメージングおよび解析の高スループットセットアップシステムに適合させることができます。
Introduction
この方法の全体的な目標は、化合物の潜在的毒性を評価するために、単純な包括的かつ比較的安価な技術を提供することにあります。これは、複数の細胞株において使用することができるインビトロアプローチです。落射蛍光顕微鏡を搭載した標準的な細胞生物学研究所は、このアッセイを使用して研究を行うことができます。
細胞機能の私達の基本的な知識は、in vitroバイオアッセイに大きく依存してきた、医薬品、環境汚染物質、食品生まれ汚染物質の毒性評価に不可欠な要素となっています。残念ながら、総合的にすべての毒性学的評価のための要求を満たすことができない単一のin vitroバイオアッセイ系はありません。 in vitroアッセイの多くは、特定の生化学的または分子のエンドポイントを評価するだけでなく、評価するために設計され、最適化されています。これらは、かなり頻繁に摂動を反映するように設定し、高スループットで結合されますそのような1シグナリングエストロゲン受容体などの特定のシグナル伝達経路、。この戦略は非常に成功しているが、遺伝子発現に関与するシグナル伝達経路の豊富な数は非常に複雑評価するために、特定のシグナル伝達経路を選択する作業を行います。ハイスループットプロトコルが現在開発と同時に、単一のアッセイのいくつかの制限を克服するための一つのアプローチをされている多数のシグナル伝達経路を測定するために使用されています。ただし、すべてのシグナル伝達経路が正常より包括的なアプローチに組み込まれている、プラス新しいシグナル伝達経路は、絶えずさらに、この評価プロセスを複雑にすることが発見されています。特に、高スループットシステム、in vitroでのアプローチの大規模な番号を使用して、総合的な毒性学的評価も非常に高価であり、ほとんどの単一の研究者につながらないための研究プロジェクトを主導しました。
GJICは、プロセスのtigですhtly膜と細胞骨格タンパク質2,3との主要な細胞内シグナル伝達経路との相互作用によって調節される電圧の変化、カルシウム濃度、pH、酸化還元バランスによって制御されます。したがって、GJICの阻害は、細胞ストレス、異なる細胞機能の破壊、または別のシグナル伝達経路の摂動の種類を反映することができます。制限されたシグナル伝達バイオアッセイの使用を克服するための別のアプローチは、多くの、そうでない場合は、ほとんどのシグナル伝達経路は、さらに、ギャップ結合チャネル4-8を介して協調細胞間シグナル伝達系によって調節されることが生物学的現象を利用することです。細胞間シグナル伝達系も多数あり、複数の経路の制御下にあるが、ギャップ結合チャネルを介したシグナル伝達間は、最終的には、部分的に閉じたまたは完全に閉鎖開かれているチャネルの機能です。これは、簡単に様々な使用して測定することができるエンドポイントを提供します試験管内バイオアッセイシステム7インチ組織の恒常性のセットポイントは、オープンチャネルが必要であることを考慮すると、ギャップジャンクション間コミュニケーション（GJIC）に対する化合物の効果を決定することは、化合物4,8の潜在的な毒性作用を決定する上で、より包括的なアプローチです。本質的には、遺伝子発現を制御する複数のシグナル伝達事象を調整において中心的役割を果たし、この重要な生物学的現象は、毒性作用の広範な評価を可能にします。したがって、GJICを評価するバイオアッセイは、化合物の毒性を評価するための優れた出発点です。
GJICを評価するために使用される最も広範な技術は、蛍光プローブで細胞をプレロードした後、隣接するセルにロードされた細胞または細胞からの染料の移行の監視に基づいています。染料をプリロードする技術は、プローブ11のロード10、およびメチルエステルをこすり、マイクロインジェクション9を含んでいました10によって開発された転移アッセイを染めます。むしろ、より侵襲的なこすりよりも、この報告書のメスローディング方法は、侵襲的な損傷を最小限に抑える細胞の単層を介して、丸刃（ 図1）とメスの穏やかなロールを伴います。この技術の利点は、細胞ではなく、マイクロインジェクションアッセイの単一細胞の集団の毒性学的評価です。さらに、このアッセイの単純さは、蛍光プローブのメチルエステルを使用するマイクロインジェクション技術及び技法を使用する方法が大幅に多くの時間がかかるのに対し、短時間で複数のプレートの迅速な検出を可能にし、かなり高いスキルレベルを必要とします。
GJICを研究するすべてのニーズを満たすために単一の方法がありませんが。 SL-DTアッセイができる簡単な、かなり安価で汎用性の高いアッセイであります様々な化合物の毒性の初期評価のためのニーズの多くを満たします。主な利点としては、単純さ、そのようなマイクロインジェクション、（FRAP）アッセイおよび分子蛍光プローブアッセイの局所的活性化を光退色後蛍光回復、大規模でGJICの迅速かつ同時評価などの他の方法に必要とされる機器やスキルの特別な必要性をin vivo試験のための自動化された蛍光顕微鏡イメージングおよび分析、ならびにその適応性と高スループットセットアップに資する細胞の数、。
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Protocol
この研究のためのプロトコルは、in vivo実験は、ラットを安楽と苦痛の軽減のために関連して処理したことを確実にするために、行われた場所である日本の健康科学の国立研究所の動物実験と利用委員会によって承認されました。
1. SL-DTバイオアッセイ
- イーグルスを含む種子3×10 5 WB-F344ラット肝上皮細胞35へのミリの直径の培養プレートを37ºC、100％の相対湿度（RH）、5％のインキュベーター内で培地+ 5％ウシ胎児血清、培養細胞を改変しましたCO 2。
- それらは100％コンフルエンス（典型的には、2日）に到達し、以下に記載されるように、細胞の所望の実験的治療を行うまで、培養細胞。
- 用量応答実験を実施
- 10μlの100％アセトニトリルおよび4μlを、6μlの中のフェナントレンの2 mMストック溶液20μl、およびphenanの20mMストック溶液を8μlを添加しますストック溶液の各添加量の成長培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルでスレン。
- 4μlを、6μlの、8μlを、10μlの、および車両制御として機能するアセトニトリル溶液の追加された各ボリュームの成長培地2mlを含有する細胞の3プレートへのアセトニトリルの100％溶液20μlを追加します。
- 37℃、100％RHおよび5％CO 2に設定したインキュベーター中で15分間、プレートをインキュベートします。
- 1.3に進みます。
- 行動時間応答実験
- 各時点（ すなわち 、0、1、2、3、4、5、10分）のために増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリル中のフェナントレンの20mMストック溶液の7μlを添加します。
- ビヒクル対照として機能する各時点で増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの7μlを添加します。
- 各指定時間pのプレートをインキュベート37℃、100％RHおよび5％CO 2のインキュベーターでOINT。
- 1.3に進みます。
- Timeリカバリの実験を行います
- 15分間の成長培地2mlを含む細胞の3プレートに100％のアセトニトリル中のフェナントレンの20mMストック溶液を7μlを添加します。
- ビヒクル対照として15分間増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの7μlを添加します。
- フェナントレンまたはアセトニトリルのいずれかを含有する培地をデカントし、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）3mlで3倍にそれぞれのリンス。
- 希望の回復時間（ すなわち、25、35、45、60、90、120、150、180、240、360分）37℃のインキュベーター中で、100のために各プレートに新鮮な増殖培地2mlを加え、インキュベート％RHおよび5％CO 2。
- 1.3に進みます。
- 行動のメカニズムの実験
- シグナル伝達阻害剤を追加、 すなわち
- ビヒクル対照として15分間増殖培地2mlを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの5μLを加えます。
- さらに15分間、増殖培地+ D609の2ミリリットルを含む細胞の3プレートに100％のアセトニトリル中のフェナントレンの20mMストック溶液を7μlを添加します。
- 2増殖培地1mlを加えた車両制御として機能する追加の15分間100％アセトニトリルを含有する細胞の三プレート100％アセトニトリルの7μlを添加します。
- 1.3に進みます。
- 用量応答実験を実施
- いずれかの培地に穏やかにオフ注ぐことによって、または真空吸引によって培養液を捨てます。
注：適切に有害廃棄物を含む培地を廃棄してください。 - 3 mlのPBSとbetweeデカントまたは吸引のいずれかで細胞を3回ずつすすぎますn個のリンス。
- 各細胞プレートにPBS（LY）に溶解した1mg / mlのルシファーイエロー色素のピペット1ミリリットル。
- 静かにプレートの三つの異なる領域で細胞の集団を介して丸みを帯びたエッジに＃20手術用鋼の刃を回転させることにより、細胞への色素をプリロード。
- 垂直メス（90°の角度）と培養プレートの端から5mmを置くことによって開始し、その後、15°（ 図1参照）の角程度にこの垂直な角度からメスをロールバックします。
注：これは、人差し指と親指の間にメスをつまんで達成されます。メスは静かに（丸みを帯びたブレードは、単に細胞転がるように）90°〜15°の位置から行くことができるように重力を使用してください。この運動は、視覚的に目立つインデント行を残します。
- 垂直メス（90°の角度）と培養プレートの端から5mmを置くことによって開始し、その後、15°（ 図1参照）の角程度にこの垂直な角度からメスをロールバックします。
- 室温で3分間LY溶液で細胞をインキュベートします。
- デカントまたはLYを吸引し、すべてのextraceを除去するためにPBSの3ミリリットルで3回すすぎllular細胞外のバックグラウンド蛍光を除去するために染料。
- 細胞を固定するために、10％リン酸緩衝ホルマリン溶液の0.5ミリリットルを追加します。
注：ホルマリンで固定した後、空気は、細胞を乾燥し、LY色素の最小光退色と最大2つの年間暗所で保管してください。必要な場合には、蛍光色素の前面を視覚化するために10％ホルマリン溶液で再水和します。 - 200Xの倍率で536分の428 nmでの励起/発光ピークのためのダイクロイックキューブを装備した落射蛍光顕微鏡を用いて固定した細胞を表示します。インデントラインはビジョンの水平磁場に平行になるようにすべてのプレートの位置を合わせます。
注：FITCのダイクロイックキューブはうまく動作します。- CCDカメラとサポートするソフトウェアで画像をキャプチャします。
- CCDカメラ用のサポートソフトウェアを開いて、自動露出の設定を使用します。デジタルで画像を取得する「捕獲」ボタンを使用します。 「保存」ボタンを使用して.tifファイルとして画像を保存します。
肝臓組織へのSL-DTアッセイの2適応
- 解剖ハサミを使用して、5週齢、雄のフィッシャー344ラットの肝臓の左葉から約2×2cmのスライスを削除して、プラスチックの上に置き、ウェットガーゼ12で覆われたプレートの重量を量ります。
- ピペット0.5の1mgを含有するPBS溶液のミリリットル/ mlのルシファーイエローおよびローダミン - デキストラン（RD）プラスチック中の肝臓切片の表面上に計量プレートの各。
注：RDはギャップ結合チャネルを横断することはできませんし、ロードした細胞をマークする色素です。 - 鋭い刃を持つ計量プレート内の色素溶液を持つ肝臓切片の表面に約1cmの長3〜5切開を行い、その後、切開部を満たすのに十分な追加の染料を追加します。
- プレートの重量を量るプラスチック上に室温で3分間組織をインキュベートします。
- 5mlのPBSで3回洗浄します。
- 組織オベを修正しました。室温で暗所で50ミリリットルコニカル遠心チューブ中の10％リン酸緩衝ホルマリンの30ミリリットルでrnight。
- 次の日は、1×1×0.5 cm 3を短冊状にはさみを解剖して切開部の周りの組織をトリミングし、水でスライスを洗浄した後、パラフィン13でスライスを埋め込むための標準的な技術を使用しています。
- 節のスライス厚さ5μmに切開線に対して垂直と準備がミクロトーム13と標準切片技術を使用して画像化されるまで暗所でサンプルを保管します。
- セクション1.10 7に記載の蛍光色素の前線の画像を視覚化し、キャプチャするために、CCDデジタルカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡を使用してください。
3.定量化GJIC
- （ 例えば 、ImageJの）形態計測ソフトウェアパッケージを使用して、蛍光色素の広がりを測定します。
- 「ファイル」タブをクリックし、開くために、「開く」をクリック保存した画像。
- 色素の先端の輪郭をトレースするツールバータブにある「フリーハンドツール」をクリックします。
- 「分析」タブをクリックし、「測定」をクリックします。
注：これにより、必要に応じて、他のスプレッドシートプログラムにコピーすることができますスプレッドシート内の面積値を生成します。
- スプレッドシートプログラムを使用して、染料は、以下の式を用いて、制御プレートに移動した領域によって、実験プレートでの色素の広がりの面積を分割して制御（FOC）の割合を計算します。
E =そのような特定の用量または時間で、化学的に処理された細胞などの実験変数に暴露された細胞、中の色素の広がりの面積
細胞は、興味のある化学物質を溶解するために使用されるビヒクルで処置された対照色素の広がりのC =面積
注意：車両の影響を判断するには、eは車両とcで処理した細胞中の色素の広がりの面積は、車両によって処理されていない細胞中の色素の広がりの面積となるであろう。車両の効果は、好ましくは10％未満であるべきです。
- CCDカメラとサポートするソフトウェアで画像をキャプチャします。
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Representative Results
GJICの中断が広く健康への悪影響14を誘導する遺伝子制御の非遺伝毒性、エピジェネティックなレベルで有毒な化合物を同定するためのバイオマーカーとして使用されてきました。例えば、多環芳香族炭化水素（PAH）は、環境の遍在の汚染物質があるが、それらの分子構造15の関数としてのエピジェネティックな毒性に変化します。低分子量のPAHは、典型的には、タバコの煙15,16と汚染された河川の堆積物のような多くの多様な環境でのより高い分子量のPAHよりも相対的に高い濃度で見出されます。フェナントレンは、ベイ領域と呼ば角度ポケットが3のベンゼン環を有し、低分子量のPAHの一例です。 図2は、フェナントレンの漸増用量で処置されたWB-F344ラット肝上皮細胞のSL-DTの一連の画像です。移行Oの減少に注意してください。用量の増加と蛍光色素、ルシファーイエロー、F。スキャンした画像の領域が制御（FOC）の割合として決定することができます。 図2の制御は、PAHは、すなわちアセトニトリルに溶解していることを溶媒で処理した細胞です。典型的には、SL-DT実験は、この実験の用量であろう各実験パラメータのための3つの独立した試験の最小値、各試験のために、重複または三重に行われています。 FOCの値は、統計学的に分析し、平均し、そして次に（ 図3参照 ） をグラフ化することができます。
同様の実験はまた、日常的に毒物誘発性GJICの阻害、および細胞を毒物を含まない培地に移した後GJICのこの毒物誘発性阻害からの回復に必要な時間のための時間を確立するために行われます。 図4は、フェナントレンによる阻害からの時間応答と回復（両方を示していますPheで）。 SL-DTのアッセイはまた、毒物および毒素がGJIC 4,16を調節不全にすることにより、基礎となるメカニズムを決定するために用いることができます。これは、GJICをdysregulates毒物または毒素の添加前に選択されたシグナル伝達経路の薬学的阻害剤とプレインキュベートした細胞によって行われます。毒物または毒素は、もはや毒物がGJICを調節不全にし続けた場合、そのような経路が除外することができながら、シグナル伝達経路は、この経路は、GJICの調節経路であると判断されたブロック選択される医薬の存在下でGJICをdysregulatesない場合。 図5は 、この原理を実証する1-メチルアントラセン（1-MEA）ではなく、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC（PC-PLC）のかなり特異的阻害剤であるD609の存在下で、GJICを阻害する別の3環状PAH。このように、PC-PLCはGJICの1-MEA誘導阻害に関与する候補シグナル伝達酵素として支配されています。 PC-PLCの役割がfで検証されていますurther実験4,16。全体的に、SL-DTアッセイは、毒物や毒素が（調節不全）GJICを阻害する方法のメカニズムに関与マッピングシグナル伝達ネットワークのプロセスを開始するのは非常に資します。このアプローチは、GJICをdysregulatingから毒物または毒素をブロックすることができる天然物をスクリーニングするために使用することができます。例えば、レスベラトロール、赤ワインとピーナッツ製品に高濃度で見つかった酸化防止剤はGJIC（ 図6）を阻害するから1-MEAを防ぐことができます。
SL-DTアッセイは、特に肝臓17に、動物からの組織切片に適合されています。パーフルオロオクタン酸（PFOA）は、肝臓癌12,17を誘発することが知られている永続的な環境汚染物質である8炭素フッ素化脂肪酸です。 SL-DT方式用いPFOAは、インビトロ WB-F344rat肝臓モデル系18 GJICを阻害することが示されました。 in vivoでのフォローアップ調査のDETPFOAはまた、このようにin vitroモデル系12,17の検証、PFOAで処理されたF344ラットの肝臓においてGJICを阻害したこと王侯にされました。 図7は、車両とPFOAを投与したラットの肝臓組織中の染料の広がりを示す。このフォローアップ実験からの蛍光画像です。
図1：メス色素担持工程の漫画の画像。メスロードプロセスが細胞の損傷を最小限に抑えるように水平セルをスライスするのではなく、ブレードを圧延することを含むことを示した図。
図2：染料の代表的な蛍光顕微鏡画像は、ギャップ結合を介して広がります。 WB-F344ラット肝上皮細胞は、中で15分間処理しました。フェナントレン、環境に見られる流行PAHの用量をしわ。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：フェナントレン処置WB-F344ラット肝上皮細胞の用量応答曲線。 SL-DT画像の領域が計算され、その後、車両（アセトニトリル）で処理した細胞であった対照の割合として報告しました。各データ点は、3つの独立した実験の平均であり、エラーバーは、15分間の曝露時間後に各用量の95％信頼限界での標準偏差です。 4パラメーターロジスティック関数は、データ点を通る直線をフィットするために使用されました。 CLIくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらのCK。
図4： フェナントレン処理したWB-F344ラット肝上皮細胞の時間とタイム・リカバリの応答曲線。曝露の10分後GJICの完全な阻害した後、培地を含むフェナントレン（Pheでは）からPhe-フリーするために培地を切り替えした後、細胞が抑制からの回復をモニターしました。 SL-DT画像の領域が計算され、その後、車両（アセトニトリル）で処理した細胞であった対照の割合として報告しました。各データ点は、3つの独立した実験の平均であり、エラーバーは95％信頼限界での標準偏差です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5：GJIC の抑制1-メチルアントラセンによっては、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼCの 1-メチルアントラセン（1-MEA） に依存している環境で見られる流行PAHです。左のパネルは、車両（アセトニトリル、0.35％v / vの）で処理した細胞を表します。中央のパネルは、70μM1-MEAで15分間処理WB-F344ラット肝上皮細胞を表しています。右側のパネルには、さらに15分間70μM1-MEAを加えて、50μMのD609、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC阻害剤での20分間の最初の前処理した細胞を表します。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図6：レスベラトロールは、1-メチルアントラセンによってGJICの抑制を防止しました。左のパネルは、車両（アセトニトリル、0.35％v / vの）で処理した細胞を表します。レスベラトロールは、赤ワインとピーナッツ製品に見られる酸化防止剤です。中央のパネルは、70μM1-MEAで15分間処理した細胞を表します。右側のパネルには、最初にさらに15分間、70μM1-MEAを加えて、50μMのレスベラトロールで20分間前処理した細胞を表します。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7： オスF-344ラットからの肝臓切片におけるGJICの エクスビボ SL-DTアッセイ。左側のパネルは、肝TISSのスライスを表し、24時間、ビヒクル対照、ジメチルスルホキシドで処理したラットからのUE。右側のパネルには、24時間後には100mg / kgのペルフルオロオクタン酸（PFOA）の腹腔内投与後のラットからの肝臓組織の切片を表します。 PFOA、流行の環境汚染物質は、肝腫を誘発し、in vitroモデルを使用して、ギャップ結合をブロックすることが明らかに腫瘍促進ペルオキシソーム増殖因子です。切開ロードされた色素は、その後、固定トリミングし、切断した車両とPFOA処理された動物からの肝臓切片上で行われました。 環境健康展望 12から再生。 =20μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
SL-DTアッセイはGJICを測定する際の、シンプルで汎用性の高い手法であるが、適切な実験プロトコルを設計する際に考慮されるべきいくつかの重要な懸念があります。 SL-DTアッセイを用いてGJICの堅牢な測定のために細胞のギャップ結合を介して、LYの良い染料の広がりが存在しなければなりません。最低でも、十分な時間は色素が両方向でメス負荷細胞からの細胞の8行以上を介して拡散することを確実にするために選択されるべきです。また、色素がメス負荷細胞から移行距離の測定を容易にするため、コントロールプレートの色素広がりが視野の70〜90％を満たす保証倍率を選択します。 WB-F344ラットの肝臓上皮細胞では、色素の先端が4セル行を越えて移動するのLY溶液で3分間のインキュベーションで十分であり、200Xの倍率は最適です。細胞はLOADIするのは非常に修正可能である、直径35mmのプレート上で増殖していますメスで細胞内に色素をngの。しかし、細胞は、小さなウェルで増殖させることができるが、メスの使用は、特に、96ウェル培養プレートに、不可能です。小さな井戸について、ウェルに適合し、そして再び、ローリングアクションを使用することができます小さな丸いひっくり返されたカッティングエッジを使用しています。それは低侵襲性であり、そして引き裂かれ、元のスクレイピング方法の典型的な大無細胞ギャップを作成されることから細胞を防ぐロードの非常にきれいなラインを提供し、このローリングアクションは重要なステップです。代替的に、鍼治療針は、針の小さなねじれが細胞内にローディング色素のいい仕事をしている使用することができます。
他の細胞型をこのアッセイで使用することができます。しかし、特定の細胞型における細胞の選択およびGJICの役割を理解することは、適切な仮説と実験の設計をフレーミングするのに重要です。最初の最も明白なステップは、機能的ギャップ結合がEXPRESである、細胞培養条件を開発することですSED。特定の代謝機能を実行する高分化細胞型において、ギャップ結合は、典型的には、隣接する細胞間の代謝経路を調整する役割を果たしています。十分に分化した細胞型が限られているいずれかの場合、増殖能力およびチャネルは、おそらく多くの場合、形態学、細胞の特定の配列に依存する組織特異的代謝的役割を果たしています。例えば、心筋細胞は、ギャップ結合は、主にこのように溝付き皿で行うことができる細胞を、位置合わせが必要となるSL-DT法を用いて、インターカレートディスクに整列している細長い細胞です。このように、慎重な考慮事項は各細胞型のために作られなければなりません。神経細胞培養物を用いた研究は、一般的にコンフルエントされていませんし、また使用する必要がありSL-DT不適切と代替GJICアッセイを利用しており、特定の接点を必要とします。
そのような幹細胞および初期先祖細胞のような増殖性の細胞型において、GJICは、より重要な役割を果たしていますコーディネートに細胞が分裂促進イベントを制御する遺伝子の発現を制御するシグナル伝達事象。このプロトコルで使用されるWB-F344ラット肝上皮細胞は、このカテゴリに分類されます。ギャップ結合遺伝子は、組織開発とメンテナンス19-21の間に重要です。ギャップジャンクションチャネルを発現し、すべての細胞の原形質膜表面上に形成されているが、増殖細胞はGJIC阻害成長因子、に非常に敏感です。増殖性細胞型のための重要な考慮事項は、通常、培地の組成に多くを配向されます。成長因子は、特にウシ胎児血清を含む未定義の培地中で、過剰であることが多い、そして細胞のギャップ結合は、閉じた状態であってもよいです。これらの細胞におけるGJICを確立するための最も簡単な方法は、24時間は、彼らがapoptoseと同じように無血清での細胞のために長すぎるだろうが、実験前の4〜24時間のための血清レベルを減少または除去することです。実験に使用WB-F344肝上皮細胞は、Tで示さ彼の論文は、血清レベルを低下させる必要なしに、血清に対して過度に敏感ではありません。これとは対照的に、C10マウス細胞株を用いた実験は、GJIC 22を確立するために奪わ最初の血清でなければなりません。血清レベルは、2つの細胞型間で異なりますが、興味深いことに、C-10細胞は、アントラセン22,23のメチル異性体と非常によく似た答え。
品質の結果のためのその他の考慮事項は、非細胞毒性用量で実験を行っ含まれます。細胞は、治療前後の細胞型の期待健康な形態学的特徴を決定するために位相差顕微鏡で確認する必要があります。ギャップ結合機能に対する化合物の効果は、一般的な細胞傷害性応答によるものではないことを保証するために、各化合物の細胞毒性アッセイは、SL-DTアッセイで使用したのと同じ時間および用量で行われるべきです。 GJICに対する化合物の阻害効果は可逆的であるかどうかを決定するために実験を行うことも、少なくとも2つの理由のための良好な実験です。モー可逆的に試験された番目の化合物は、GJICを阻害するが、GJICのない回復が存在しない場合には、細胞毒性因子、さらなる試験が必要となるかもしれません。しかし、GJICが復元された場合、その後の用量および時間がテストされ、おそらく、細胞傷害性ではなかったです。 GJICの可逆的阻害のための生物学的な意味があります。多くの負担、環境や食品毒物や毒素の健康への悪影響は可逆過程です。したがって、分子レベルで、この可逆性を理解することが重要です。未知化合物が可逆GJICを阻害しない場合には、生物の健康への影響は、他のほとんどの薬とは全く異なっていてもよく、リスク計算の一部であることが必要である可能性があります。
GJICの抑制に関与用量および時間を決定することは反復的なプロセスです。文化用品のために時間とお金を節約するために、最善のアプローチは、ほとんどの阻害として、溶解性および時間（通常1時間に依存し、高用量、で開始します）未満15分に発生し、その後、何の効果がなくなるまで段階的プロセスで半分の時間と投与量を減らします。高用量では阻害は、一時間に存在しない場合には、ステップワイズ法で時間を倍増。最初の実験は、単一のプレート上で行うことができます。一般的な時間の見積もりと用量が確立されると、その後、より徹底的な研究を効率的に統計分析のための適切なサンプルサイズで設計することができます。 1つの実験設計の特徴は、75〜100％の阻害に達する用量および時間を使用することであろう。明らかに、結果の最終的な解釈は、上記のパラメータの要因となります。しかし、最初の用量および時間は、in vivoで適切ではないかもしれません場合でも、生物学的効果を測定することによって、確立された用量は、職業曝露の状況で役割を果たすことができる、または他の要因に曝露され、一般的な集団にも潜在的な添加剤とGJICに影響を与えることまたは相乗効果。
Gの阻害ほとんどの化合物によるJICは、典型的には高度に可変ではなく、2〜3の複製（各反復は、培養プレートまたはウェルであろう）は、用量および時間応答曲線を生成するのに十分です。変動性が高い場合は、その後多くの反復は、一つの独立した試験の所定の従属変数の正確な値を得るために必要とされるであろう。もちろん、少なくとも3回の独立試験は統計分析のために行われる必要があります。
このアッセイの単純さと有意な細胞集団の大きさの評価は、多くの用途のために有利です。これは、多くの毒性評価に特に有用です。しかし、いくつかの要因に依存し得るSL-DTアッセイの限界があります。一つは、この技術が研究された細胞に適切であるかどうかです。このアッセイは、培養プレートまたはウェル全体に散発的な接点で高い密集度に到達していない細胞ではうまく機能しません。このようなマイクロインジェクションなどの代替技術は、共同しなければなりませんnsidered。代替的に、SL-DTアッセイを改変することができます。ロード単一細胞での成功は、色素7をロードするときにわずかなねじれのアクションを必要と鍼で達成されています。染料の普及は、散発的な細胞接触を持つ細胞培養を通じてより多くのコンフルエントの状況で放射状または非晶質であろう。 LY色素溶液にローダミンデキストラン（RD、1mg / mlの）の添加は、ロードされた細胞を同定すること（例えば、RDなど）のマーカーなしでは困難であろう実験のために推奨されます。 RDは、このように細胞がロードされたかを識別する、ギャップ結合チャネルを横断するには大きすぎます。 RDは、すべてのSL-DTアッセイで使用することができるが、メスは、細胞がロードされる特定皿の底にくぼみを残します。 SL-DTアッセイはまた、色素負荷は、細胞種間を区別しませんように、細胞の異なるタイプ間のGJICの変化を測定することを助長されていません。再びマイクロインジェクションは、選択の方法が、鍼法のミグです1は、顕微鏡を用いて、特定の細胞を標的とすることができる場合も動作HT。
代謝協力アッセイは、GJICを測定するための別の方法です。この方法は、GJIC 24の最初の標準化されたバイオアッセイの一つでした。このアッセイでは、野生型チャイニーズハムスターV79細胞（6-チオグアニン感受性）および6-チオグアニン耐性細胞は、6-チオグアニン（6-TG）耐性細胞は、6-TGを代謝しない、高い密度で共培養しました毒性代謝物に、このように耐性を付与します。細胞死をもたらすギャップ結合を介した毒性代謝物の転送における6-TG感受性細胞の結果との共培養どこ毒性6-TG代謝物の移動を防止することにより、6-TG耐性細胞の救出でGJIC結果の阻害6-TG感受性細胞から。このアッセイの利点は、低侵襲性であることであるが、主な欠点は、それがtoxiの豊富な用量および時間依存性の評価を行う完了するために一週間を必要とすることですなど cantsならびに機構研究、多くの化学物質を評価するための実用的でありません。
SL-DTアッセイは、マイクロインジェクションが好ましい方法である異なる細胞型、通って染料の移行をトレースする必要が機構研究を助長されていません。あるいは、細胞は、蛍光色素のメチルエステルをプリロードすることができます。染料のロードは、このように細胞内の色素を捕獲、そのより親水性のフォームに親油性色素を加水分解し、細胞内のメチルエステラーゼの関数です。これは、蛍光プローブをプリロードする侵襲性の低い方法ですが、すべての細胞がこの方法によってプリロードされている間の通信を測定するための最も一般的な方法は、FRAPアッセイ11です。 FRAPの利点は再び機構研究のための優れた単一細胞にギャップ結合を評価する能力、です。しかしFRAPの欠点は、である：毒性学的評価のための細胞の集団を測定することができないこと、洗練された非常に高価な顕微鏡/レーザーサイトメーター、高度に熟練した技術的専門知識の必要性の必要性は、適度にレーザーによって生成されるフリーラジカルから侵襲性、および高スループットを助長されていません。
より最近別の技術が開発されています。ケージクマリンのような蛍光体の新しい世代に基づいている分子蛍光プローブ（LAMP）法25の局所的活性化。 FRAPアッセイと同様に、すべての細胞は色素がメチルエステルを含むがプリロードされている、しかし、これらの染料は、おそらくFRAPよりも有意に低いROSを生成する紫外線の小さな用量、とレーザーによるその後のローカライズされた照明の際に蛍光を発します。再び、このアッセイは、FRAPアッセイの同じ制限を有します。 GJICを測定するための他の最近の進歩はまた、メチルエステル蛍光色素の使用を含むプリロードとパラシュート技法です。プリロード技術は、懸濁伴います細胞は、無負荷のカウンターパートと一緒に蛍光プローブがプリロードした後、メッキとコンフルエントな単層を形成することが許可されています。色素の広がりは、次に落射蛍光顕微鏡26で観察することができます。パラシュートのアッセイでは、蛍光プローブをプリロード細胞は、無負荷細胞の単層上にオーバーレイされ、染料の拡散を落射蛍光顕微鏡27で観察します。この場合も、上記の技術は、技術的には、高スループット分析のためのより困難であり、すぐ近くに合流で播種し、細胞の再付着のためのタイムラグを必要としなければなりません。
全体的に、SL-DTアッセイは、通常、ほとんどの細胞培養研究室で見つかったCO 2細胞培養インキュベーター、安全キャビネットと落射蛍光顕微鏡、として、機器を使用して、比較的、安価でシンプルで汎用性の高い技術です。最小限の経験を持つ多くのプレートがf助長している日、で処理することができますまたは毒性のため、ならびに防止または毒物や毒素の効果を逆転天然物のための化合物をスクリーニングします。また、高スループットのために、このアッセイを適応すると、毒物および毒素の多数をスクリーニングする可能性があります自動化された蛍光顕微鏡イメージングおよび分析システムと、ロボットを使用して分析します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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