Abstract
Descreve-se um baixo custo, morbidostat configurável para a caracterização da via evolutiva da resistência aos antibióticos. O morbidostat é um dispositivo de cultura bacteriana que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração da droga para desafiar constantemente as bactérias à medida que evoluem para adquirir resistência aos medicamentos. O dispositivo dispõe de um volume de trabalho de ~ 10 mL e é totalmente automatizado e equipado com medição de densidade óptica e micro-bombas para médio e entrega de droga. Para validar a plataforma, medimos a aquisição gradual de resistência trimetoprim em Escherichia coli MG 1655, e integrada com o dispositivo de microfluidos de uma plataforma multiplexado para investigar a morfologia das células e sensibilidade aos antibióticos. A abordagem pode ser up-dimensionado para estudos laboratoriais de resistência aos medicamentos antibióticos, e é extensível para adaptativa evolução de melhorias de tensão em engenharia metabólica e outros experimentos de cultura bacteriana.
Introduction
Desde a introdução da primeira penicilina antibiótico, a resistência aos antibióticos microbiana tornou-se um problema de saúde global 1. Embora a aquisição de resistência a antibióticos pode ser retrospectivamente estudados in vivo, as condições destas experiências muitas vezes não são controlados ao longo de toda a evolução 2. Alternativamente, evolução adaptativa laboratório pode revelar a evolução molecular de uma determinada espécie microbiana sob stresses ambientais ou pressão de seleção de um medicamento antibiótico 3. Recentemente, muitas experiências evolutivas bem controlados de resistência aos medicamentos antibióticos elucidaram o surgimento de resistência aos medicamentos antibióticos. Por exemplo, o grupo de Austin demonstrado surgimento rápido num ambiente compartimentado microfluidos adequadamente manipulado 4. O morbidostat recentemente desenvolvido induz a mutações sistemáticas sob droga pressão de seleção 5,6. O morbidostat, uma selec microbianação dispositivo que ajusta continuamente a concentração de antibiótico para manter uma população praticamente constante, é um grande avanço a partir do teste de flutuação utilizado em microbiologia 7,8. No teste de flutuação, uma droga antibiótica é injectada a alta concentração, e os sobreviventes mutantes são rastreadas e contadas. Em vez disso, os micróbios em um morbidostat são constantemente desafiados e adquirir múltiplas mutações.
O morbidostat opera de forma semelhante ao quimiostato, cultura de um dispositivo inventado por Novick e Szliard em 1950 que mantém uma população constante através do fornecimento de nutrientes continuamente enquanto que a diluição da população microbiana 9. Desde a sua introdução, o quemostato tem sido avançado e melhorado. quimiostatos microfluídicos em curso alcançaram capacidades nanolitros e de uma única célula. No entanto, estes dispositivos não são adequados para experiências evolução adaptativa, que necessitam de uma população de células grandes com muitos eventos de mutação 10,11. Recentemente, mini-quimiostatos com volumes de trabalho de ~ 10 ml também foram desenvolvidos para preencher a lacuna entre biorreatores em escala litro eo microfluídico quemostato 12,13.
Aqui apresentamos a concepção e utilização de um baixo custo, morbidostat automatizado para um estudo de resistência aos medicamentos antibióticos. O módulo proposto pode ser empregue num incubador agitador de laboratório com microbiologia requisito mínimo de hardware. O firmware open-source também é facilmente adaptado para aplicações específicas de evolução adaptativa, tais como engenharia metabólica 3. Finalmente, o morbidostat é integrado em uma plataforma microfluídica multiplexado para testes de sensibilidade aos antibióticos 14.
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Protocol
1. Montagem e pré-teste do dispositivo Morbidostat
- Assembleia da Morbidostat
- Soco 3 furos na tampa do frasco de cultura com uma agulha de seringa 18 G. Corte três peças de tubagem de polietileno ~ 7 cm de comprimento. Inserir essas três pedaços de tubos de polietileno na tampa.
- Use fita para envolver a borda da tampa para servir como o elenco para a mistura de polidimetilsiloxano (PDMS). Dissolvem-se 5 g de componente A e 0,5 g de componente B de o PDMS em um recipiente de plástico de 150 ml por agitação manualmente com um palito. Carregar a mistura em uma seringa de 10 ml.
- Despeje a mistura de PDMS na tampa com a seringa. Asse toda a tampa para curar o PDMS durante 8 horas na estufa a 70 ° C.
- Soldar o ânodo LED com o fio de calibre 24 e catodo LED com o resistor de carbono com um ferro de solda. Solde um resistor de 680 Ω de carbono com um fio de 24 g. Isolar a ligação do fio usando fita isolante.
- assimlder no colector do fotodetector com o G fio 24 e o emissor da célula fotoeléctrica com uma resistência de 100 kQ carbono. Isolar a ligação do fio usando fita isolante.
- Coloque o diodo emissor de luz no suporte de cultura do frasco. Seguindo o esquema de circuitos na Suplementar Figura 2, conecte o diodo emissor de luz e ligá-lo com uma fonte de alimentação de 5 V. Verifique se o LED funciona usando uma câmera digital que pode detectar IR (por exemplo, uma câmera de telefone celular).
- Colocar o fotodetector no suporte do frasco de cultura. Seguindo o esquema de circuitos na Suplementar Figura 2, conecte o fotodetector e ligá-lo com uma fonte de alimentação de 5 V. Ligue o fio de ambos os lados das resistências de fotodetectores para medir a tensão através da placa de controle eletrônico.
- Cole um íman sobre o veio da ventoinha de arrefecimento, o qual serve como unidade de agitador magnético. Note-se que o alignmENT do eixo do ventilador para o frasco de cultura, e o espaçamento entre o frasco de cultura e o íman é muito crítica para a função adequada da unidade de agitação magnética.
- Ligue cada pedaço de tubo de polietileno do frasco de cultura para a parte correspondente de tubo de silicone para os micro-bombas, garrafas médias e frasco de resíduos. Ligar a bomba durante 1 hora e medir o volume total a ser bombeado a partir da garrafa de forma para o frasco de cultura para determinar a taxa de bombagem. Note-se que a taxa de bombeamento típico deve ser ~ 4 ml / h, o que corresponde à taxa de diluição de D = 0,33 h -1 para a 12 ml de volume do frasco de cultura de trabalho.
- Coloque todo o conjunto em uma incubadora shaker médio porte (34 cm x 34 cm x 43,5 cm).
- O pré-teste do Morbidostat
- Set tensão de alimentação do ventilador de fresco a 5 V para iniciar o seu motor para testar a barra de agitação magnética. Note-se que a ação de agitação pode ser inspeccionados visualmente. A tensão que conduzirs o motor do ventilador de arrefecimento é precisamente controlado por modulação de largura de pulso (PWM).
- Preparar uma série de tipo selvagem E. Amostras de E. coli com as densidades ópticas a 600 nm, tipicamente variando 0,07-0,3 para a calibração. Coloque um teste E. amostra coli no frasco de cultura e registar a tensão fotodetector.
- Ponto ~ 100 uL da mesma amostra no leitor de placas e gravar a densidade óptica. Use a tensão fotodetector em função dos dados de densidade óptica para traçar a curva de calibração. Note-se que tipicamente, uma unidade de variação na densidade óptica corresponde a 7,6 V ~ mudança no fotodetector com o esquema de polarização utilizado aqui.
2. A execução do Morbidostat
- Preparação Antes de começar a experiência diária
- Prepara-se o frasco de cultura com três ultra-resistentes a substâncias químicas tubos Tygon com diâmetro interior de 1/32 polegadas e diâmetro externo de 3/32 de polegada para entradas para formar o dispositivo como na secção1.1 e na Figura Suplementar 1.
- Preparar o meio M9 mínimo (0,2% de glicose) e trimetoprim (TMP) de drogas contendo meio. Esteriliza-se o meio, o meio de garrafa, a garrafa forma de droga, o frasco de resíduos, e o frasco de cultura num autoclave a 121 ° C.
NOTA: O TMP é uma solução de reserva que é utilizado para alcançar as concentrações mais tarde no Quadro 1 e a droga TMP contendo meio não é autoclavado.
- Executando o Morbidostat
- No primeiro dia do experimento, descongelar 1 ml de tipo selvagem congelado E. coli MG1655 durante 5 min à temperatura ambiente e a transferência de 120 ul das células para o frasco de cultura contendo ~ 12 mL de meio de crescimento M9. Após o primeiro dia, descongelar 1 ml de E. congelado coli células a partir do dia anterior durante 5 min e transferência de 120 uL de células para um novo frasco de cultura contendo ~ 12 mL de meio de crescimento M9.
- Ligue a incubadora shaker e definir a tempe ratura de 30 ° C sem agitação.
- Inicie a operação morbidostat girando sobre o micro-bomba, a unidade de agitação magnética, e a medição da densidade óptica.
Nota: Durante a operação, um algoritmo de limiar de realimentação é utilizado para controlar a injecção de drogas. Quando a densidade óptica medida exceder um limite pré-definido, a bomba de injecção de drogas seria ligado e a bomba médio seria desligado. Caso contrário, a bomba de injecção de drogas permanece desligado ea bomba médio está ligado. - Monitorar a tensão ao longo do tempo para assegurar que não é o crescimento microbiano.
Nota: Devido à congelação e descongelação ciclo, E. coli células apresentam um atraso de ~ 4 horas durante o crescimento de cada dia. - Depois de ~ 23 h, parar a micro-bomba desligando a tensão de alimentação e retire o frasco de cultura. Adiciona-se 15% de glicerol no frasco de cultura e congelar a amostra a -80 ° C durante o armazenamento.
- Repita os passos 2.2.1 a 2.2.5.
NOTA: Executar a medição da taxa de crescimento em um leitor de placas com um formato de 96 poços para determinar o nível de resistência a antibióticos.
- Descongelar a amostra congelada diária à temperatura ambiente durante 5 min e transferir 15 ul da célula para o frasco de cultura contendo ~ 15 mL de meio M9. Permitir-lhes crescer até a densidade óptica a 600 nm atingir ~ 0,1. Dividir as 15 ml em frascos de 1 ml e adicionar o fármaco TMP nesta etapa para se obter as concentrações de droga desejadas, como mostrado na Tabela 1.
- Tome 200 ul da amostra a partir do passo 3.1 e local para cada poço na placa de leitor e permitir-lhes crescer durante 12 horas 5. A densidade óptica no comprimento de onda de 600 nm é registado automaticamente durante a medição.
NOTA: Para cada ponto de dados, as medições triplicadas são registrados e em média para garantir a consistência dos dados. Os dados sobre a densidade óptica em função do tempo pode be utilizado para obter a taxa de crescimento. - Plotar os dados da taxa de crescimento em comparação com a concentração da droga para obter IC50. Note-se que IC50 é definido como a concentração de fármaco à qual a taxa de crescimento é de cinquenta por cento da taxa de crescimento máxima 5.
4. única célula Morfologia e Antibiótico Susceptibilidade Medição em microcanais
- Realizar a fabricação dos dispositivos microfluídicos via litografia macia multicamadas de PDMS conforme já descrito 15.
- Use fotolitografia para fazer o molde fotorresistente para os níveis de controlo e de fluxo. Note-se que para a camada de controlo, utilizar fotorresistente negativa (~ 15? M de altura) e fotorresistente positivo (~ 8 uM altura) para produzir um molde sobre uma bolacha de silício nu.
- Preparar misturas de PDMS com rácios de reticulação de 5: 1 e 20: 1 para a camada de controlo e camada de fluxo, respectivamente. Coloque as misturas em um exsicador sob vácuo para remover quaisquer bolhas, Durante 1 h.
- Exponha o controlo moldes camada fotossensível em bolacha de silício para trimetilclorosilano vapor (TMCS). Adicione a camada de espessura ~ 6 milímetros de controlo, lançando-se a mistura de PDMS (com razão de reticulação 5: 1) sobre a bolacha de silício sobre o molde de controle camada foto-resistente. Cozer a camada de controlo durante 40 minutos a 80 ° C durante 1 hora no forno.
- Adicione a camada de fluxo de rotação por revestimento de uma mistura de PDMS (com reticulação proporção de 20: 1, velocidade de rotação 3000 rpm durante 60 seg) em um molde fotorresistente camada de escoamento. Cozer a camada de fluxo durante 30 min a 80 ° C durante 1 hora no forno.
- Use uma lâmina de barbear para cortar a camada de controle para o tamanho do chip desejado (tipicamente 3 cm x 2 cm) e manualmente retire a camada de controle. Coloque a camada de controlo no topo da camada de escoamento e alinhá-los sob um estereomicroscópio. Curar a montagem alinhada a 80 ° C na noite forno. Em seguida, mergulhe o conjunto em 250 ml de água deionizada em um recipiente de plástico durante 5 horas para dissolver o TMCS residual.
- Subsequentemente, perfurar os orifícios de entrada com 20 g de agulhas e ligar todo o elastómero a uma lâmina de vidro revestida com uma camada de PDMS em branco (PDMS reticulação proporção de 5: 1, velocidade de rotação 2000 rpm durante 30 seg) por tratamento com plasma de ar de 40 seg a 1,2 Torr de pressão de ar.
- Realizar ampla cozimento durante 36 h a 80 ° C para reduzir os efeitos citotóxicos de PDMS. Note-se que esta fase de cozedura é crítica para minimizar a toxicidade para as células bacterianas.
- No Experimento Crescimento Chip
- Antes de carregar no dispositivo de microfluidos, lavá-la com água desionizada durante 1 hora e meio M9 durante 1 h.
- Descongelar a amostra congelada diária à temperatura ambiente durante 5 min e inocular um novo tubo de ensaio com meio fresco M9. Colocar a amostra num incubador com agitação a 37 ° C durante a noite.
- Diluir o microbiana amostra de 10 vezes com meio M9 e carregá-lo para dentro do dispositivo microfluídico pressionando o recipiente da amostra microbiana a 5 psi. Em seguida, carregar a droga TMPmédio no chip pressionando o recipiente do meio de droga em 5 psi. Executar a mistura entre o micróbio e fármaco por actuação da válvula de micromecânica entre as duas câmaras no chip de microfluidos durante 15 min.
- Colocar o chip de microfluidos na incubadora microscópio montado no microscópio invertido. Adquirem a imagem de células na câmara de crescimento a cada HR durante 8 horas com a câmara CCD montada sobre o microscópio invertido.
- Use o script programa personalizado para calcular o número de células por meio de um algoritmo de limite sobre os dados de imagem de células 18. Note-se que os dados do número de células são calculados normalmente mais de três câmaras microfluídicos.
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Representative Results
O morbidostat acima descrito está esquematizado na Figura 1. As operações morbidostat comuns, incluindo a evolução experimental, teste de susceptibilidade aos antibióticos e a morfologia das células de controlo, foram validados em uma E. coli MG1655 cultura exposta ao trimetoprim (TMP), um fármaco antibiótico comumente utilizado 5,6. TMP induz aumentos graduais muito distintas em resistência aos medicamentos, e as mutações são agrupados em torno do gene dihidrofolato redutase (DHFR). Portanto, TMP é uma droga padrão altamente eficaz para validar a operação morbidostat. Cada dia, o micróbio é esperado para crescer acima do limiar de densidade óptica predefinido e desencadear a injecção de drogas, como mostrado na Figura 2a. A injecção de drogas é esperado para inibir o crescimento e como resultado, diminui a densidade óptica. Várias execuções de ensaios podem ser necessários para determinar a concentração de fármaco ideal. Como regra geral, nós Increase a concentração do fármaco por meio de 5 vezes após ter verificado que a forma de droga não consegue suprimir o crescimento. Depois de todo o curso do ensaio, as amostras congeladas diárias são descongeladas e utilizadas para determinar a IC50, uma medida quantitativa do nível de resistência a drogas. A trama na Figura 2b mostra o aumento temporal na resistência aos medicamentos antibióticos. A resistência aos medicamentos aumentou aproximadamente 1.500 vezes a ~ 1.000 ng / ml ao longo de ~ 12 dias, de acordo com descobertas anteriores na evolução laboratório 5 e isolados clínicos 19. As mutações pontuais de DHFR no último dia mutante foram medidos por Sanger de sequenciação e são listados na Tabela 2. Uma mutação é encontrado localizada na região do promotor e indica que a única mutação pontual na região promotora pode alterar significativamente o nível de DHFR expressão enzima 20. Outra mutação no local 49.910 está localizado na região do gene da DHFR e fica perto do atolocal ive da DHFR enzima 21. A aquisição de resistência aos medicamentos com múltiplas mutações prova a utilidade do morbidostat, como a seleção de drogas contendo placa de ágar tende a conferir apenas o única mutação.
Como uma leitura mais sensível da morfologia celular, a morfologia de verificação de uma única célula com susceptibilidade aos antibióticos é realizado em paralelo uma plataforma de microfluidos multiplexado 14. A Figura 3 mostra o design do chip de microfluidos multiplexado. Micrografias das células bacterianas (Figura 5) revelam alterações na morfologia do tipo selvagem e estirpes mutantes sob concentrações sub-inibitória de TMP. estirpes do tipo selvagem mostrar filamentation significativa, enquanto a estirpe mutante não mostra filamentation significativo. Esta mudança de morfologia de cada nível de uma única célula pode ser utilizada no diagnóstico rápido da resistência aos antibióticos. A Figura 4 mostra a sobre-quiAs curvas de crescimento de P em várias concentrações de TMP. A amostra mutante mostra um aumento significativo na resistência ao antibiótico. O crescimento de dados on-chip na Figura 4 também é consistente com o valor de IC 50 a partir do leitor de placas apresentado na Figura 2b.
Figura 1:. Esquemática do morbidostat O morbidostat é um dispositivo de cultura contínua que mede a densidade óptica da população microbiana, e ajusta em conformidade a concentração do fármaco. O dispositivo funciona no modo modo de drogas por injeção de drogas e de diluição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva de crescimento e aumento do nível de resistência aos medicamentos antibióticos (a) curva de crescimento Representante sob feedback.. O crescimento microbiano é inibida pelo fármaco antibiótico, cuja injecção é accionado por um algoritmo de limiar. Quando a taxa de crescimento positiva levanta a densidade óptica acima do limiar pré-definido (OD TH = 0,086), o dispositivo muda para o modo de drogas por injeção. Caso contrário, o dispositivo é executado no modo de drogas de diluição. setas vermelhas e roxas indicam mudar para modos de injeção de drogas e de diluição da droga, respectivamente. (B) Resistência ao nível das células durante 12 dias de exposição a trimetoprim. O IC 50 mostra um aumento gradual distinta da resistência aos medicamentos antibióticos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: dispositivos microfluídicos para investigar a morfologia celular e on-chip de sensibilidade aos antibióticos (a) micrografia do layout de chip.. compartimentos verde e azul são as câmaras de crescimento e média de drogas, respectivamente, eo layout vermelho denota a camada de controle. As dimensões da câmara de crescimento são de 450 uM (L) x 400 ^ M (W) x 8 m (h). A câmara de crescimento é carregado com as bactérias, e a câmara de medicamento é carregada com TMP. barra de escala é de 1 cm. (B) vista ampliada do mesmo chip. Barra de escala = 500 pm. (C) Magnified vista de ambas as câmaras antes e após a mistura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Curvas de crescimento on-chip de E.: Figura 4 coli expostas a várias concentrações de TMP: estirpe ancestral (a) de tipo selvagem e (b) estirpe mutante (no dia 12). A amostra mutante mostra um aumento significativo na resistência aos medicamentos antibióticos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: de uma única célula morfologias (a - d) imagens de campo claro da célula após o tratamento com níveis sub-inibitória de TMP. Note-se a filamentação significativa das células de tipo selvagem em (b), que está ausente nos mutantes (d (e - h) são imagens digitalizadas de (a - d). Todas as imagens bacterianas foram tiradas por uma câmera CCD com um objetivo de ampliação de 40X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1:. As dimensões e a montagem do suporte de cultura frasco Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Suplementar Figura 2:. O diagrama de circuito para o LED e o fotodetector Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Código Suplementar:. roteiro personalizado para contar o número de células a partir das imagens de células obtidas a partir dos chips microfluídicos Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Amostra | TMP Drogas (ug / ml) | |||||||||||
| dia 1-3 | 0 | 0,06 | 0,12 | 0,25 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| dia 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| dia 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| dia 12/08 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1.000 | 2.000 | |
Tabela 1:. Concentração de droga usada para determinar as IC50 em concentrações de droga placa leitor medida em unidades de ug / ml são apresentadas para a amostra congelada diária. À medida que as células se desenvolvem mais elevada resistência à droga, as concentrações de droga utilizadas são aumentados em conformidade.
| Não | Localização | SNP | Nota |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T> A | gene de DHFR |
| 3 | 49795 | C-> T | promotor DHFR |
Tabela 2:. Mutação em DHFR identificado por sequenciação de Sanger Os dados da sequência representativos mostram as três mutações pontuais DHFR mutante no último dia (dia 12). As regiões do promotor e do gene conter um e 2 SNPs, respectivamente. Os iniciadores directo e inverso, utilizados na PCR foram 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'e 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
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Discussion
Um dispositivo morbidostat baixa pegada de componentes de baixo custo é demonstrada. Os aumentos no nível de resistência a drogas registadas pelo dispositivo são consistentes com os dos relatórios anteriores 5. Concebido para estudos evolutivos de resistência a drogas, o dispositivo é potencialmente aplicável a muitas outras experiências. Primeiro, um banco de dados abrangente de mutações induzidas pela droga pode ser estabelecido para um grande conjunto de antibióticos clinicamente relevantes. Por exemplo, a via evolutiva de resistência a múltiplas drogas podem ser estudados por simples aumento do número de fármacos utilizados na experiência. A principal vantagem do módulo aqui relatado é a sua capacidade de configuração flexível, permitindo em larga escala, as experiências paralelas, sob diferentes condições experimentais.
Embora o conceito foi demonstrado nas medições microfluidics, o poder de investigação pode ser melhorado através da combinação de microfluidos com a tecnologia de fluidos 23. O custo pormedição (economia de escala) é drasticamente reduzido pelo consumo de reagente reduzido e trabalho reduzida. Aqui, os dados de morfologia de célula única pode ser extraído a partir da plataforma de microfluidos. Recentemente, testes de morfologia microfluídico de células individuais foi implementado com sucesso em laboratórios de microbiologia clínica, e realiza comparável ao caldo padrão testes de diluição de série 24. Com a crescente disponibilidade de dispositivos microfluídicos, tecnologias combinadas permitirá em grande escala, de alto rendimento experimentos de evolução laboratório.
Vários passos são fundamentais para executar o morbidostat. Em primeiro lugar, porque a unidade de agitação magnética é formado a partir de imans e um ventilador de arrefecimento, é crucial para alinhar o eixo do ventilador para o frasco de cultura. Além disso, a distância entre o frasco de cultura e o íman é muito crítica para assegurar um funcionamento estável. Em segundo lugar, a mudança para um novo frasco de cultura no início da experiência de cada dia é também importanteevitar a formação de biofilme. Caso contrário, a formação de biofilmes pode ocorrer dentro de 2 ou 3 dias. Em terceiro lugar, porque E. amostras de E. coli são descongelados diária a partir de uma amostra congelada durante a experiência de cada dia para garantir a consistência, é importante para definir um período de atraso de pelo menos 4 horas para evitar uma lavagem total de fora dos micróbios. Alternativamente, pode-se optar por não congelar E. Amostras de E. coli e directamente usar a amostra para inocular um novo frasco de cultura para iniciar uma nova cultura.
Em um cenário prático, o design atual sistema deve superar várias limitações para estender seus potenciais usos. O volume de todo o sistema está actualmente limitada pelo meio consumido por dia (durante a operação chemostatic, um frasco de cultura consome, aproximadamente, 0,5 L de meio por dia, à taxa de diluição típico de 0,33 h -1). Para reduzir o volume de trabalho, otimização possa ser alcançado por meio de simulação atento sobre a dinâmica populacional de drogas inibido com plumbing parâmetros 25.
Finalmente, o morbidostat é facilmente adaptável a uma vasta gama de experiências de cultura de bactérias. Por exemplo, por ligação de um diodo emissor de luz, o sistema poderia ser reconfigurado como um foto-biorreactor, permitindo o acompanhamento da evolução de cianobactérias ou microalgas 26. O módulo pode ser estendida para o cultivo anaeróbico e microaeróbia num recipiente estanque ao gás, com adsorventes por o dispositivo sem fios que opera em um conjunto de baterias. Como outro exemplo, a concentração de uma toxina pode ser gradualmente aumentado para engenharia estirpes que são resistentes ao produto alvo 27.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
