Abstract
Describimos un bajo costo, morbidostat configurable para la caracterización de la vía evolutiva de resistencia a los antibióticos. El morbidostat es un dispositivo de cultivo bacteriano que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano y ajusta dinámicamente la concentración de fármaco para desafiar constantemente las bacterias a medida que evolucionan para adquirir resistencia a los medicamentos. El dispositivo cuenta con un volumen de trabajo de ~ 10 ml y es totalmente automatizado y equipado con medición de la densidad óptica y micro-bombas para el medio y la administración de fármacos. Para validar la plataforma, que mide la adquisición gradual de la resistencia a trimetoprima en Escherichia coli MG 1655, e integró el dispositivo con una plataforma de microfluidos multiplexado para investigar la morfología celular y la sensibilidad a los antibióticos. El enfoque puede ser de hasta a escala en los estudios de laboratorio de resistencia a los antibióticos, y es extensible a la evolución adaptativa para las mejoras de deformación en la ingeniería metabólica y otros experimentos con cultivos bacterianos.
Introduction
Desde la introducción del primer fármaco antibiótico penicilina, la resistencia microbiana a los antibióticos se ha convertido en un problema de salud mundial 1. Aunque la adquisición de resistencia a los antibióticos puede ser estudiado retrospectivamente in vivo, las condiciones de estos experimentos a menudo no están controlados a lo largo de toda la evolución 2. Alternativamente, la evolución adaptativa de laboratorio puede revelar la evolución molecular de una especie microbiana menores de estrés ambiental o la presión de selección de un fármaco antibiótico 3. Recientemente, muchos experimentos evolutivos bien controlados de resistencia a los antibióticos han permitido comprender la aparición de resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el grupo de Austin demostró emergencia rápida en un entorno compartimentado microfluidos diseñado adecuadamente 4. El morbidostat recientemente desarrollado induce mutaciones sistemáticas bajo la presión de selección de drogas 5,6. El morbidostat, una selec microbianadispositivo de la que ajusta continuamente la concentración de antibiótico para mantener una población casi constante, es un avance importante en la prueba de fluctuación se utiliza en microbiología 7,8. En la prueba de fluctuación, un fármaco antibiótico se inyecta a alta concentración, y los mutantes supervivientes se tamizan y se contó. En cambio, los microbios en un morbidostat son constantemente desafiados y adquieren múltiples mutaciones.
El morbidostat opera de manera similar a la quimiostato, un dispositivo inventado por la cultura y Novick Szliard en 1950 que mantiene una población constante mediante el suministro continuo de nutrientes, mientras que la dilución de la población microbiana 9. Desde su introducción, el quimiostato se ha avanzado y mejorado. quimiostatos microfluidos actuales han alcanzado las capacidades de nanolitros y unicelulares. Sin embargo, estos dispositivos no son adecuados para los experimentos de evolución adaptativa, que requieren una población de células grandes con muchos eventos de mutación 10,11. Recientemente, mini-quimiostatos con volúmenes de trabajo de ~ 10 ml también se han desarrollado para rellenar el hueco entre los biorreactores de escala en litros y el microfluidos quimiostato 12,13.
Aquí se presenta el diseño y el uso de un bajo costo, morbidostat automatizado para un estudio de resistencia a los antibióticos. El módulo propuesto se puede emplear en un incubador agitador en un laboratorio de microbiología con el requisito mínimo de hardware. El firmware de código abierto también se adapta fácilmente a las aplicaciones específicas de la evolución de adaptación, como la ingeniería metabólica 3. Por último, el morbidostat está integrado en una plataforma de microfluidos multiplexado para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Las pruebas preliminares de la Asamblea y del dispositivo Morbidostat
- Asamblea de la Morbidostat
- Perforar 3 agujeros en el tapón del vial de cultivo con una aguja de jeringuilla 18 G. Cortar tres piezas de tubo de polietileno ~ 7 cm de longitud. Insertar estas tres piezas de tubo de polietileno en la tapa.
- Use cinta adhesiva para envolver el borde de la tapa para servir de molde para la mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS). Mezclar 5 g de un componente y 0,5 g del componente B de los PDMS en un recipiente de plástico 150 ml por agitación manual con un palillo de dientes. Cargar la mezcla en una jeringa de 10 ml.
- Verter la mezcla de PDMS en la tapa con la jeringa. Hornear toda la tapa para curar los PDMS durante 8 horas en el horno a 70 ° C.
- Soldar el ánodo del LED con el cable de calibre 24 y el cátodo del LED con la resistencia de carbono con un soldador. Soldar una resistencia de 680 Ω de carbono con un alambre G 24. Aislar la conexión de cables utilizando cinta aislante.
- Asi quelder el colector del fotodetector con el alambre G 24 y el emisor del fotodetector con una resistencia de 100 kW de carbono. Aislar la conexión de cables utilizando cinta aislante.
- Coloque el diodo emisor de luz en el soporte de vial de cultivo. Siguiendo el esquema de conexiones en la figura complementaria 2, conecte el diodo emisor de luz y el poder con una fuente de alimentación de 5 V. Asegúrese de que el LED funciona mediante el uso de una cámara digital que puede detectar IR (por ejemplo, una cámara de teléfono móvil).
- Coloque el fotodetector en el soporte de vial de cultivo. Siguiendo el esquema de conexiones en la figura complementaria 2, conecte el fotodetector y la potencia con una fuente de alimentación de 5 V. Conectar el cable a ambos lados de las resistencias de fotodetectores para medir el voltaje a través del panel de control electrónico.
- Pegar un imán en el eje del ventilador de refrigeración, que sirve como la unidad de agitador magnético. Tenga en cuenta que la alignment del eje del ventilador para el vial de cultivo, y la separación entre el vial de cultivo y el imán es muy crítica para el correcto funcionamiento de la unidad de agitación magnética.
- Conectar cada trozo de tubo de polietileno de la cultura vial en la pieza correspondiente de tubos de silicona para las micro-bombas, botellas medianas y botella de residuos. A su vez en la bomba durante 1 hr y medir el volumen total que se bombea desde la botella medio en el vial de cultivo para determinar la velocidad de la bomba. Tenga en cuenta que la velocidad de bombeo típica debe ser ~ 4 ml / hora, lo que corresponde a la tasa de dilución D = 0,33 h-1 durante unos 12 ml de volumen del vial de cultivo de trabajo.
- Colocar todo el conjunto en un incubador con agitación de tamaño mediano (34 cm x 34 cm x 43,5 cm).
- Pruebas preliminares del Morbidostat
- tensión de alimentación conjunto de ventilador fresco a 5 V para iniciar su motor para probar la barra de agitación magnética. Tenga en cuenta que la acción de agitación se puede inspeccionar visualmente. La tensión que impulsans del motor del ventilador de refrigeración se controla con precisión mediante modulación por ancho de pulso (PWM).
- Preparar una serie de tipo salvaje E. muestras coli con densidades ópticas a 600 nm que típicamente varía 0,07-0,3 para la calibración. Coloque una prueba E. coli muestra en el vial de cultivo y registrar la tensión fotodetector.
- Place ~ 100 l de la misma muestra en el lector de placas y registrar la densidad óptica. Utilice la tensión fotodetector frente a los datos de densidad óptica para trazar la curva de calibración. Tenga en cuenta que por lo general, una unidad de cambio en la densidad óptica corresponde a ~ 7,6 V cambio en el fotodetector con el esquema de restricción utilizado aquí.
2. Ejecutar el Morbidostat
- Preparación Antes de comenzar el experimento diario
- Preparar el vial de cultivo con tres tubos Tygon resistentes ultra-químicas con diámetro interior de 1/32 de pulgada y diámetro exterior 3/32 pulgadas para las entradas para formar el dispositivo como en la sección1.1 y en la Figura 1 complementario.
- Preparar el medio M9 mínimo (0,2% de glucosa) y trimetoprim (TMP) de drogas medio que contiene. Esterilizar el medio, la botella de medio, la botella de medio con el fármaco, la botella de residuos, y el vial de cultivo en un autoclave a 121 ° C.
NOTA: La TMP es una solución de reserva que se utiliza para lograr más tarde las concentraciones de la Tabla 1 y el fármaco TMP que contiene el medio no se trata en autoclave.
- La ejecución de la Morbidostat
- En el primer día del experimento, descongelar 1 ml de tipo salvaje congelado E. células de E. coli MG1655 de 5 min a temperatura ambiente y la transferencia de 120 l de las células a la vial de cultivo que contiene ~ 12 ml de medio de crecimiento M9. Después del primer día, descongelar 1 ml de E. congelado coli células del día anterior durante 5 min y la transferencia de 120 l de las células a un nuevo vial de cultivo que contiene ~ 12 ml de medio de crecimiento M9.
- Encienda la incubadora agitador y ajuste la tempe ratura de 30 ° C sin agitación.
- Iniciar la operación de morbidostat activando la micro-bomba, la unidad de agitación magnética, y la medición de la densidad óptica.
NOTA: Durante la operación, un algoritmo de umbral de realimentación se utiliza para controlar la inyección de drogas. Cuando la densidad óptica medida supera un umbral preestablecido, la bomba de inyección de drogas se enciende y la bomba del medio se apaga. De lo contrario, la bomba de inyección de drogas permanece apagado y la bomba está en medio. - Monitor de la tensión de vez en cuando para asegurar que no es el crecimiento microbiano.
Nota: Debido al ciclo de congelación y descongelación, E. coli células presentan un retraso de ~ 4 horas durante el crecimiento de cada día. - Después de ~ 23 horas, detener la micro-bomba apagando su tensión de alimentación y sacar el tubo del cultivo. Añadir 15% de glicerol en el vial de cultivo y la congelación de la muestra a -80 ° C para el almacenamiento.
- Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.5.
NOTA: Realice la medición tasa de crecimiento en un lector de placas con un formato de 96 pocillos para determinar el nivel de resistencia a los antibióticos.
- Descongelar la muestra congelada diaria a temperatura ambiente durante 5 min y transferir 15 l de la célula para el vial de cultivo que contiene ~ 15 ml de medio M9. Permiten que crezcan hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanza ~ 0,1. Divida a los 15 ml en 1 ml botellas y añadir el fármaco TMP en este paso para obtener las concentraciones de fármaco deseadas como se muestra en la Tabla 1.
- Tomar 200 l de la muestra a partir del paso 3.1 y lugar en cada pocillo en el lector de placas y les permiten crecer durante 12 horas 5. La densidad óptica a la longitud de onda 600 nm se registra automáticamente durante la medición.
NOTA: Para cada punto de datos, mediciones por triplicado se registran y se promedió para asegurar la consistencia de los datos. Los datos sobre la densidad óptica en función del tiempo puede be utiliza para obtener la tasa de crecimiento. - Representar gráficamente los datos de la tasa de crecimiento frente a la concentración de fármaco para obtener IC50. Tenga en cuenta que IC 50 se define como la concentración de fármaco en el que la tasa de crecimiento es el cincuenta por ciento de la tasa de crecimiento máximo 5.
4. Single Cell Morfología y susceptibilidad antibiótica de medición en dispositivos de microfluidos
- Realizar la fabricación de los dispositivos de microfluidos mediante litografía blanda multicapa de PDMS como se describe en otra parte 15.
- Utilice la fotolitografía para hacer el molde fotorresistente para las capas de control y de flujo. Tenga en cuenta que para la capa de control, utilice fotoprotector negativo (~ 15 m de altura) y fotoprotector positivo (~ 8 m de altura) para producir un molde sobre una oblea de silicio al descubierto.
- Preparar las mezclas de PDMS con relaciones de reticulación de 5: 1 y 20: 1 para la capa de control y la capa de flujo, respectivamente. Poner las mezclas en un desecador a vacío para eliminar las burbujas, Por 1 hr.
- Exponer los moldes capa fotorresistente de control en la oblea de silicio para trimetilclorosilano vapor (TMCS). Hacer la capa de control de ~ 6 mm de espesor por colada la mezcla de PDMS (con una relación de reticulación 5: 1) en la oblea de silicio sobre el molde de control de capa fotorresistente. Hornear la capa de control durante 40 minutos a 80 ° C durante 1 hora en el horno.
- Hacer la capa de flujo por giro el recubrimiento de una mezcla de PDMS (con una relación de reticulación 20: 1, velocidad de centrifugado 3000 rpm durante 60 segundos) en un molde de resina fotosensible capa de flujo. Hornear la capa de flujo durante 30 min a 80 ° C durante 1 hora en el horno.
- Use una hoja de afeitar para cortar la capa de control en el chip de tamaño deseado (típicamente de 3 cm x 2 cm) y manualmente retire la capa de control. Coloque la capa de control en la parte superior de la capa de flujo y alinearlos bajo un estereomicroscopio. Curar el montaje alineado a 80 ° C durante la noche en el horno. Después, disfrute del conjunto en 250 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico durante 5 horas para disolver los PTM residual.
- Posteriormente, perforar los agujeros de entrada con 20 agujas G y unir todo el elastómero a un portaobjetos de vidrio recubierto con una capa de PDMS en blanco (cruz PDMS que une relación de 5: 1, velocidad de centrifugado 2000 rpm durante 30 sec) por tratamiento con plasma de aire de 40 segundos a 1.2 Torr presión de aire.
- Llevar a cabo una amplia hornear durante 36 horas a 80 ° C para reducir los efectos citotóxicos de PDMS. Tenga en cuenta que esta etapa de cocción es crítica para minimizar la toxicidad para las células bacterianas.
- El experimento de crecimiento de la viruta
- Antes de cargar en el dispositivo de microfluidos, lavarlo con agua desionizada durante 1 hora y medio M9 durante 1 hora.
- Descongelar la muestra congelada diaria a temperatura ambiente durante 5 min y inocular un nuevo tubo de ensayo con medio M9 fresco. Colocar la muestra en un incubador con agitación a 37 ° C durante la noche.
- Diluir la muestra microbiana 10 veces con medio M9 y cargarlo en el dispositivo de microfluidos al presionar al recipiente de la muestra microbiana a 5 psi. A continuación, cargue el medicamento TMPmedio en el chip presionando el recipiente medio con el fármaco a 5 psi. Ejecutar la mezcla entre el microbio y el fármaco por accionamiento de la válvula micromecánica entre las dos cámaras en el chip microfluídico para 15 min.
- Coloque el chip de microfluidos en la incubadora microscopio montado en el microscopio invertido. Adquirir la imagen de células en la cámara de crecimiento cada hora durante 8 horas con la cámara CCD montada en el microscopio invertido.
- Utilice la secuencia de programa personalizado para calcular el número de células a través de un algoritmo de umbral en los datos de imagen celular 18. Tenga en cuenta que los datos de número de células se promedian por lo general más de tres cámaras de microfluidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El morbidostat anteriormente descrito se esquematiza en la Figura 1. Las operaciones morbidostat comunes, incluyendo la evolución experimental, prueba de susceptibilidad a los antibióticos y la comprobación de la morfología celular, fueron validados en una E. cultivo de E. coli MG1655 expuesto a trimetoprim (TMP), un fármaco antibiótico que se usa comúnmente 5,6. TMP induce muy distintivos incrementos escalonados en resistencia a los medicamentos, y las mutaciones están confinados en el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR). Por lo tanto, TMP es un medicamento estándar altamente eficaz para la validación de la operación morbidostat. , Se espera que el microbio Cada día a crecer por encima del umbral de densidad óptica preestablecida y desencadenar la inyección del fármaco, como se muestra en la Figura 2a. Se espera que la inyección del fármaco para inhibir el crecimiento y, como resultado, disminuye la densidad óptica. Pueden ser necesarias varias ejecuciones de prueba para determinar la concentración óptima de drogas. Como regla general, que Increase la concentración del medio con el fármaco por 5 veces después de encontrar que el medio con el fármaco deja de suprimir el crecimiento. Después de todo el curso del experimento, las muestras congeladas diarias se descongelan y utilizan para determinar IC 50, una medida cuantitativa del nivel de resistencia a los medicamentos. El gráfico de la Figura 2b muestra el aumento temporal en la resistencia a los antibióticos. La resistencia a los medicamentos se incrementó en aproximadamente 1.500 veces a ~ 1.000 mg / ml durante ~ 12 días, en consonancia con los resultados anteriores en la evolución de laboratorio 5 y 19 aislados clínicos. Las mutaciones puntuales de DHFR en el mutante de último día se midieron mediante secuenciación de Sanger y se enumeran en la Tabla 2. Una mutación se encuentra situado en la región de promotor e indica que la mutación de un solo punto en la región promotora puede cambiar significativamente el nivel de expresión de la DHFR enzima 20. Otra mutación en la posición 49910 se encuentra en la región del gen de DHFR y está cerca del actoive sitio de la enzima DHFR 21. La adquisición de resistencia a los medicamentos con múltiples mutaciones demuestra la utilidad de la morbidostat, como la selección de fármaco que contiene una placa de agar tiende a conferir únicamente la única mutación.
Como una lectura más sensible de la morfología celular, la comprobación de la morfología de célula única con la susceptibilidad a los antibióticos se lleva a cabo en un paralelo, la plataforma de microfluidos multiplexado 14. La Figura 3 muestra el diseño del chip de microfluidos multiplexada. Las micrografías de las células bacterianas (Figura 5) revelan cambios en la morfología, tanto de tipo salvaje y cepas mutantes bajo concentraciones sub-inhibidora de TMP. cepas de tipo salvaje muestran filamentation significativa, mientras que la cepa mutante no muestra filamentation significativa. Este cambio morfología en un solo nivel de la célula se puede utilizar en el diagnóstico rápido de resistencia a los antibióticos. La figura 4 muestra el sobre-chicurvas de crecimiento p a diversas concentraciones de TMP. La muestra mutante muestra un aumento significativo de resistencia a los antibióticos. Los datos de crecimiento en el chip en la Figura 4 también es consistente con el valor IC 50 desde el lector de placas que se muestra en la Figura 2b.
Figura 1:. Esquemática de la morbidostat El morbidostat es un dispositivo de cultivo continuo que mide la densidad óptica de la población microbiana, y en consecuencia ajusta la concentración de fármaco. El dispositivo funciona en el modo de modo de inyección de drogas y fármacos de dilución. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curva de crecimiento y aumento del nivel de resistencia a los antibióticos (a) Representante curva de crecimiento bajo retroalimentación.. El crecimiento microbiano es inhibido por el fármaco antibiótico, cuya inyección se activa mediante un algoritmo de umbral. Cuando la tasa de crecimiento positiva eleva la densidad óptica por encima del umbral predeterminado (TH OD = 0,086), el dispositivo cambia al modo de inyección de drogas. De lo contrario, el dispositivo se ejecuta en modo de drogas-dilución. flechas rojas y púrpuras indican el cambio en los modos de inyección de drogas y la dilución del fármaco, respectivamente. (B) nivel de resistencia de las células durante 12 días de la exposición a la trimetoprima. El IC 50 muestra un aumento escalonado distinta de la resistencia a los antibióticos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
t = "Figura 3" src = "/ files / ftp_upload / 54426 / 54426fig3.jpg" />
Figura 3: dispositivos de microfluidos para la investigación de la morfología celular y en el chip de sensibilidad a los antibióticos (a) Micrografía de la disposición de circuitos integrados.. compartimentos verde y azul son las cámaras de crecimiento y medio con el fármaco, respectivamente, y el diseño de color rojo indica la capa de control. Las dimensiones de la cámara de crecimiento son 450 mm (l) x 400 mm (W) x 8 mm (h). La cámara de crecimiento se carga con las bacterias, y la cámara de drogas se carga con TMP. La barra de escala es de 1 cm. (B) vista del mismo chip magnificada. Barra de escala = 500 micras. (C) la vista de ambas cámaras magnificada antes y después de la mezcla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
"Src =" / files / ftp_upload / 54426 / 54426fig4.jpg "/>
Curvas de crecimiento on-chip de E.: Figura 4 coli expuesto a diversas concentraciones de TMP: (a) de tipo salvaje cepa ancestral y (b) la cepa mutante (al día 12). La muestra mutante muestra un aumento significativo en la resistencia a los antibióticos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: una sola célula morfologías (a - d) imágenes de campo claro de la célula después del tratamiento con niveles sub-inhibidora de TMP. Tenga en cuenta la filamentación significativa de las células de tipo salvaje en (b), que está ausente en los mutantes (d (e - h) son imágenes digitalizadas de (a - d). Todas las imágenes bacterianas fueron tomadas por una cámara CCD con un objetivo de 40 aumentos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Que complementa la figura 1:. Las dimensiones y el montaje del soporte del vial de cultivo Haga clic aquí para descargar este archivo.
Que complementa la figura 2:. El diagrama de circuito para el LED y el fotodetector Haga clic aquí para descargar este archivo.
Código suplementario:. script personalizado para contar el número de células a partir de las imágenes de células adquiridas de los chips de microfluidos Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Muestra | TMP Drogas (g / ml) | |||||||||||
| día 1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 8 | dieciséis | 32 | |
| Día 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| día 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| día 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2.000 | |
Tabla 1:. La concentración del fármaco utilizado para determinar la IC 50 en las concentraciones del fármaco placa de lector de medición en unidades de g / ml se muestran para la muestra congelada diaria. A medida que las células se desarrollan más alta resistencia a los medicamentos, las concentraciones de fármaco utilizadas se incrementan en consecuencia.
| No | Ubicación | SNP | Nota |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> A | gen DHFR |
| 3 | 49795 | C-> T | promotor de DHFR |
Tabla 2:. La mutación en DHFR identificado mediante secuenciación de Sanger La secuencia de datos representativos muestran las tres mutaciones puntuales de DHFR en el mutante de último día (día 12). Las regiones promotoras de genes y contienen uno y 2 SNPs, respectivamente. Los cebadores directo e inverso utilizados en la PCR fueron 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'y 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un dispositivo morbidostat bajo la huella de componentes de bajo coste se demuestra. Los aumentos en el nivel de resistencia a los medicamentos registrados por el dispositivo son coherentes con los informes anteriores de 5. Diseñado para los estudios evolutivos de la resistencia a los medicamentos, el dispositivo es potencialmente aplicable a muchos otros experimentos. En primer lugar, una amplia base de datos de mutaciones inducidas por fármacos se puede establecer para un gran conjunto de antibióticos clínicamente relevantes. Por ejemplo, la vía de evolución de la resistencia a múltiples fármacos puede ser estudiado por el simple aumento del número de fármacos utilizados en el experimento. La ventaja principal del módulo informado aquí es su capacidad de configuración flexibles, lo que permite a gran escala, experimentos paralelos en diferentes condiciones experimentales.
Aunque el concepto se demostró en las mediciones de microfluidos, el poder de investigación se puede mejorar mediante la combinación de microfluidos con la tecnología de fluidos 23. El coste pormedición (economía de escala) se reduce drásticamente por el consumo de reactivos bajada y la reducción del trabajo. Aquí, los datos de la morfología de células individuales se pueden extraer de la plataforma de microfluidos. Recientemente, las pruebas de la morfología de las células individuales de microfluidos se ha aplicado con éxito en los laboratorios de microbiología clínica, y lleva a cabo de forma comparable a caldo estándar de pruebas de dilución en serie 24. Con la creciente disponibilidad de dispositivos de microfluidos, tecnologías combinadas permitirán a gran escala, de alto rendimiento experimentos de evolución de laboratorio.
Varios pasos son críticos para ejecutar el morbidostat. En primer lugar, debido a que la unidad de agitación magnética se forma a partir de los imanes y un ventilador de refrigeración, es crucial para alinear el eje del ventilador para el vial de cultivo. Además, la distancia entre el vial de cultivo y el imán es muy crítico para asegurar un funcionamiento estable. En segundo lugar, el cambio a un nuevo vial de cultivo en el comienzo del experimento cada día También es importanteevitar la formación de biopelículas. De lo contrario, la formación de biopelículas se puede producir dentro de 2 o 3 días. En tercer lugar, porque E. coli muestras se descongelan todos los días de una muestra congelada durante el experimento de cada día para garantizar la coherencia, es importante establecer un periodo de retraso de al menos 4 horas para evitar un total de lavado de los microbios. Alternativamente, se puede optar por no congelar E. muestras coli y directamente el uso de la muestra para inocular un nuevo vial de cultivo para iniciar una nueva cultura.
En un entorno práctico, el diseño del sistema actual debe superar varias limitaciones para extender sus posibles usos. El volumen de todo el sistema se encuentra limitado por el medio consumido por día (durante la operación chemostatic, un vial de cultivo consume aproximadamente 0,5 L de medio por día a la tasa de dilución típico de 0,33 -1 hr). Para reducir el volumen de trabajo, la optimización adicional puede conseguirse mediante la simulación cuidado en la dinámica de población inhibida por el medicamento con plumbing Parámetros 25.
Por último, el morbidostat es fácilmente adaptable a una amplia gama de experimentos de cultivo bacterianos. Por ejemplo, uniendo un diodo emisor de luz, el sistema podría ser reconfigurado como una foto-biorreactor, lo que permite el seguimiento de la evolución de las cianobacterias o algas micro 26. El módulo se puede extender a anaeróbica y el cultivo microaerobia en un recipiente hermético a los gases con adsorbentes operando de forma inalámbrica el dispositivo en un paquete de baterías. Como otro ejemplo, la concentración de una toxina podría aumentarse gradualmente para diseñar cepas que son resistentes a la sustancia química objetivo 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
