Abstract
私たちは、抗生物質耐性の進化の経路を特徴付けるための低コスト、設定morbidostatについて説明します。 morbidostatは、継続的に細菌の増殖を監視し、動的にそれらが薬剤耐性を獲得するように進化として常に細菌に挑戦する薬物濃度を調整した細菌培養装置です。デバイスは、〜10ミリリットルの作業容量を備え、完全に自動化し、光学密度測定、中および薬物送達のためのマイクロポンプが装備されています。プラットフォームを検証するために、我々はMG 1655 大腸菌でトリメトプリム耐性の段階的買収を測定し、細胞の形態や抗生物質感受性を調査するために多重化されたマイクロ流体プラットフォームとデバイスを統合しました。アプローチは、抗生物質耐性の実験室での研究にスケールアップ、および代謝工学および他の細菌培養実験における歪みの改善のために進化を適応するために拡張することができます。
Introduction
最初の抗生物質ペニシリンの導入以来、微生物の抗生物質耐性は、世界的な健康問題1へと発展しています。抗生物質耐性の獲得が遡及的in vivoで研究することができるが、これらの実験の条件は、多くの場合、全体の進化2を通じて制御されていません。あるいは、適応実験室進化は抗生物質3から、環境ストレスまたは選択圧下微生物種の分子進化を明らかにすることができます。最近、抗生物質耐性の多くのよく制御された進化実験は、抗生物質耐性の出現を明らかにしています。たとえば、オースティンのグループが適切に設計されたマイクロ流体区画環境4の急速な出現を示しました。最近開発されたmorbidostatは、薬剤選択圧5,6の下で体系的突然変異を誘発します。 morbidostat、微生物セレク連続してほぼ一定の人口を維持するために抗生物質濃度を調整ションデバイスは、微生物学7,8で使用される変動試験から大きな進歩です。変動試験では、抗生物質を高濃度で注入し、生存変異体をスクリーニングし、計数します。その代わりに、morbidostat中の微生物は、常に挑戦し、複数の変異を獲得しています。
morbidostatはケモスタット、微生物集団9を希釈しながら継続的に栄養を供給することにより一定の人口を維持し、1950年にNovickとSzliardによって発明された培養装置と同様に動作します。導入以来、ケモスタットが進められ、改善されました。現在のマイクロ流体ケモスタットは、ナノリットルおよび単一セルの容量に達しています。しかしながら、これらのデバイスは、多くの変異事象10,11を有する大きな細胞集団を必要とする適応進化の実験には適していません。最近、ミニ〜10ミリリットルの作業容量でケモスタットもリットル規模のバイオリアクターおよびマイクロ流体ケモスタット12,13の間のギャップを埋めるために開発されてきました。
ここでは、抗生物質耐性の研究のための低コスト、自動化されたmorbidostatの設計および使用を提示します。提案されたモジュールは、最小限のハードウェア要件を有する微生物実験室でシェーカーインキュベーター内で使用することができます。オープンソースのファームウェアも簡単に、このような代謝工学3として適応進化の特定の用途に合わせて調整されます。最後に、morbidostatは、抗生物質感受性試験14用の多重マイクロ流体プラットフォームに統合されています。
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Protocol
Morbidostatデバイスの1アセンブリおよび予備試験
- Morbidostatの組立
- 18 G注射針で培養バイアルのキャップ上の3つの穴をパンチ。 〜の長さは7センチポリエチレンチューブの3枚をカット。キャップにポリエチレン管のこれらの3枚を挿入します。
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）の混合物のためのキャストとして機能するようにキャップの縁をラップするためにテープを使用してください。爪楊枝を使って手動で攪拌することにより、コンポーネントの5グラムと150ミリリットルのプラスチック容器中のPDMSのB成分の0.5グラムを混ぜます。 10ミリリットルの注射器に混合物をロードします。
- シリンジでキャップにPDMSの混合物を注ぎます。 70℃のオーブン中で8時間、PDMSを硬化させるために全体のキャップを焼きます。
- はんだごてを持つカーボン抵抗と24ゲージワイヤとLEDのカソードとLEDのアノードを半田付けします。 24 G線と680Ωカーボン抵抗を半田付けします。電気テープを使用して、ワイヤ接続を絶縁してください。
- そう24 G線と100kΩのカーボン抵抗と受光素子のエミッタと光検出器のコレクタlder。電気テープを使用して、ワイヤ接続を絶縁してください。
- 培養バイアルホルダーに発光ダイオードを配置します。 補足 図2に回路図に従うことで、それはLEDはIR（ 例えば、携帯電話のカメラ）を検出することができるデジタルカメラを使用して動作することを確認し、5Vの電源で発光ダイオードと電源を接続します。
- 文化バイアルホルダーに光検出器を配置します。 補足 図2の回路図に従うことにより、電子制御基板の両端の電圧を測定する光検出器抵抗器の両側にワイヤ5 V.接続の電力供給と光検出器と電源を接続します。
- 磁気攪拌手段としての冷却ファンのシャフトの磁石を接着。 alignmことに注意してください培養バイアルにファンのシャフトの耳鼻咽喉科、培養バイアルと磁石の間の間隔は、磁気攪拌装置の適切な機能のために非常に重要です。
- マイクロポンプ、培地ボトル、および廃液ボトル用のシリコンチューブの対応する片に培養バイアルのポリエチレンチューブの各部分を接続します。 1時間ポンプの電源をオンにし、ポンプ速度を決定するために、培養バイアルに培地ボトルから圧送される総体積を測定。典型的なポンピング速度は、希釈率D = 0.33時間-1培養バイアルの12ミリリットル作業容量のために対応〜4ミリリットル/ hrで、でなければならないことに注意してください。
- 中規模（34センチメートルのx 34センチメートルX 43.5センチメートル）シェーカーインキュベーターにアセンブリ全体を置きます。
- Morbidostatを事前テスト
- 磁気撹拌棒をテストするためのモーターを起動するために、5Vまで冷却ファンの電源電圧を設定します。攪拌動作が視覚的に検査することができることに注意してください。ドライブ電圧冷却ファンモータは正確にパルス幅変調（PWM）によって制御されていますよ。
- 野生型E.一連の準備典型的には、キャリブレーションのための0.07から0.3までの範囲の600nmでの光学密度を有する大腸菌サンプル 。テストEを置きます培養バイアル中の大腸菌サンプルとは、光検出器の電圧を記録します。
- 場所〜100プレートリーダーで同じサンプルμlの光学密度を記録。検量線をプロットするために、光学濃度データ対の光検出器電圧を使用してください。一般的に、光学濃度の1単位の変化は、ここで使用されるバイアス方式と光検出器で〜7.6 Vの変化に対応していることに注意してください。
2. Morbidostatを実行します
- 毎日の実験を開始する前の準備
- セクションのようなデバイスを形成するための注入口用の内径1/32インチ、外径3/32インチと3超耐薬品性のタイゴンチューブで培養バイアルを準備1.1と補足図1インチ
- M9最少培地（0.2％グルコース）およびトリメトプリム（TMP）は、薬物含有培地を準備します。培地、培地ボトル、薬の媒体ボトル、廃液ボトル、および121℃のオートクレーブ中で培養バイアルを滅菌します。
注：TMPは、後の表1に濃度を達成するために使用される媒体を含むTMP薬物がオートクレーブ処理されていないストック溶液です。
- Morbidostatを実行します
- 実験の初日に、凍結された野生型の1ミリリットルE.を解凍室温で5分間コリ MG1655細胞及びM9の成長培地の〜12ミリリットルを含む培養バイアルに細胞120μlのを転送します。最初の日の後、凍結したE.の1ミリリットルを解凍大腸菌 5分と転送含む新しい培養バイアルに細胞を120μlのために前日からの細胞〜M9の増殖培地12ミリリットル。
- シェーカーインキュベーターをオンにして、テンペを設定無振とうしながら30℃までrature。
- マイクロポンプ、磁気攪拌装置、および光学密度測定をオンにしてmorbidostat操作を開始します。
注：動作中、フィードバック閾値アルゴリズムは、薬剤注入を制御するために使用されます。測定された光学濃度が予め設定された閾値を超えた場合に、薬剤注入ポンプがオンになると培地ポンプはオフになります。それ以外の場合は、薬剤注入ポンプがオフのままと培地ポンプがオンになっています。 - 微生物の増殖があることを確認する時間までの時間からの電圧を監視します。
注：ため凍結融解サイクルの、E。大腸菌細胞は、毎日の成長時〜4時間の遅延を示します。 - 〜23時間後、その供給電圧をオフにすることで、マイクロポンプを停止し、培養バイアルを取り出します。培養バイアルに15％グリセロールを添加し、貯蔵のために-80℃で試料を凍結します。
- 繰り返しは、2.2.5に2.2.1を繰り返します。
注：抗生物質耐性のレベルを決定するために、96ウェル形式でプレートリーダーで成長速度測定を行います。
- 5分間、室温で毎日凍結サンプルを解凍し、〜15ミリリットルM9培地を含む培養バイアルにセルの15μLを移します。彼らは〜0.1に到達した600nmでの光学密度まで増殖することを可能にします。 1 mlのボトルに15 mlで分割し、 表1に示すように、所望の薬物濃度を得るために、この段階でTMPの薬剤を加えます。
- ステップ3.1からのサンプルの200μLを取り、プレートリーダーで各ウェルに配置し、それらを12時間5のために成長することができます。波長600nmにおける光学密度を測定中に自動的に記録されます。
注：各データ点は、三連の測定値を記録し、データの整合性を確保するために平均化されます。時間に対する光学濃度のデータはbはできEは、成長速度を得るために使用されます。 - IC 50を得るために、薬物濃度に対する成長速度データをプロットします。 IC 50は、成長率が最大増殖速度5の五十パーセントされる薬剤濃度として定義されることに留意されたいです。
4.単一細胞形態とマイクロ流体デバイスにおける抗生物質感受性測定
- 他の場所で15説明したように、PDMSから多層ソフトリソグラフィーを介してマイクロ流体デバイスの製造を行います。
- 制御フロー層用のフォトレジスト金型を作るために、フォトリソグラフィを使用してください。制御層のために、ベアシリコンウェーハ上に金型を製造するためにネガ型フォトレジスト（〜15μmの高さ）と、ポジ型フォトレジスト（〜8μmの高さ）を使用することに注意してください。
- それぞれ、制御層と流動層のために1：1と20：5の架橋比を有するPDMSの混合物を準備します。任意の気泡を除去するために真空下でデシケーター中に混合物を入れて、1時間。
- （TMCS）蒸気をトリメチルクロロシランするために、シリコンウエハ上に制御層レジストの金型を公開します。 PDMS混合物を鋳造することにより~6ミリメートルの厚さの制御層を作る（架橋比5：1）制御層フォトレジスト型のシリコンウェハ上に。オーブン中で1時間、80℃で40分間、制御層を焼きます。
- （：1、スピン速度60秒間3,000rpmで架橋比20で）流れ層のフォトレジストモールド上のPDMS混合物をスピンコートすることにより流動層を作ります。オーブン中で1時間、80℃で30分間流動層を焼きます。
- 希望のチップサイズに制御層（一般的に3センチメートル×2センチ）を切断し、手動制御層を剥離するカミソリの刃を使用してください。流動層の上に制御層を配置し、実体顕微鏡下でそれらを揃えます。オーブンで一晩中80℃で整列アセンブリを治します。その後、残余のTMCSを溶解するために5時間プラスチック容器に脱イオン水250ml中にアセンブリを浸漬。
- その後、20gの針を用いて入口穴パンチブランクPDMS層でコーティングされたガラススライドに全体のエラストマーを結合：で40秒間空気プラズマ処理によって（PDMS比5架橋30秒間、1の回転速度を2,000rpmで） 1.2トルの空気圧。
- PDMSからの細胞毒性効果を減少させるために80℃で36時間、大規模なベーキングを行います。この焼成工程は、細菌細胞への毒性を最小限にするために重要であることに注意してください。
- チップ生育実験について
- マイクロ流体デバイスにロードする前に、1時間1時間とM9培地を脱イオン水で洗い流します。
- 5分間、室温で毎日凍結サンプルを解凍し、新鮮なM9培地で新しい試験管に接種します。 37℃で一晩振とう培養器内のサンプルを配置します。
- M9培地で微生物サンプル10倍に希釈し、5 psiで微生物サンプル容器を加圧することにより、マイクロ流体デバイスにロードします。そして、TMP薬をロード5 psiで薬剤培地容器を加圧することにより、チップへの媒体。 15分間のマイクロ流体チップ上の2つのチャンバ間のマイクロメカニカルバルブを作動させることにより、微生物と薬物との間の混合を実行します。
- 倒立顕微鏡に搭載された顕微鏡インキュベーター内でマイクロ流体チップを置きます。成長チャンバー内の倒立顕微鏡に搭載されたCCDカメラで8時間毎に時間の細胞画像を取得します。
- 細胞画像データ18上の閾値アルゴリズムを介して細胞数を計算するために、カスタムプログラムのスクリプトを使用します。セル番号データが3マイクロ流体チャンバーの上に一般的に平均化されることに注意してください。
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Representative Results
上記のmorbidostatは、図1に図式化されている。実験的進化、抗生物質感受性試験および細胞形態のチェックなどの一般的なmorbidostat操作を、Eに検証されましたトリメトプリム（TMP）にさらさコリ MG1655文化、一般的に使用される抗生物質5,6。 TMPは、薬物耐性に非常に特徴的な段階的な増加を誘導し、そして突然変異はジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子の周囲にクラスタ化されます。したがって、TMPはmorbidostat動作を検証するための非常に効果的な標準薬です。毎日、微生物が予め設定された光学密度の閾値より上に成長し、 図2aに示すように、薬物注射をトリガすることが期待されます。薬物注射は、成長を阻害し、その結果、光学密度を減少させることが期待されます。いくつかの試験の実行は、最適な薬物濃度を決定するために必要とされ得ます。経験則として、我々はincreas薬剤媒体が成長を抑制しないことを発見した後に5倍の薬剤媒体の濃度を電子。実験の全経過した後、毎日の凍結サンプルを解凍し、IC 50、薬剤耐性レベルの定量的測定値を決定するために使用されます。 図2Bにプロットは、抗生物質耐性の経時的な増加を示しています。薬剤耐性は、19を隔離実験室進化5で以前の知見と一致し、臨床、12日〜の上に約〜1,000μgの/ mlに1500倍に増加しました。最終日の変異体におけるDHFRの点突然変異は、サンガー配列決定法によって測定し、 表2に列挙されている。一つの変異がプロモーター領域に位置し、プロモーター領域における単一点突然変異は、有意にDHFRの発現レベルを変更することができることを示すことが見出されています酵素20。場所49910で別の変異は、DHFRの遺伝子領域に位置し、行為に近いですDHFR酵素21のIVEサイト。寒天プレートを含む薬剤の選択は、単一の変異を付与する傾向があるように、複数の突然変異を有する薬剤耐性の獲得は、morbidostatの有用性を証明しています。
細胞形態のより敏感な読み出しとして、抗生物質感受性を有する単一の細胞の形態の検査を並行して行われ、多重マイクロ流体プラットホーム14。 図3は、多重化されたマイクロ流体チップの設計を示します。細菌細胞（ 図5）の顕微鏡写真は、TMPのサブ抑制濃度下での野生型および変異株の両方における形態変化を明らかにしました。変異株は有意なフィラメンテーションを示していない間、野生型株はかなりのフィラメンテーションを示しています。単一細胞レベルでのこの形態変化は、抗生物質耐性の迅速診断に使用することができる。4ディスプレイ上カイ図TMPの種々の濃度のp増殖曲線。変異体サンプルは、抗生物質耐性の有意な増加を示しています。 図4のオンチップ成長データは、 図2bに表示されたプレートリーダーからのIC 50値と一致しています。
図1：morbidostat の概略 morbidostatは、微生物集団の光学密度を測定し、それに応じて薬剤濃度を調節する連続培養装置です。デバイスは、薬剤注入モードおよび薬物希釈モードで実行されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 成長曲線と抗生物質薬剤耐性レベルの増加フィードバックの下で（a）の代表的な成長曲線。微生物の成長は、その噴射閾値アルゴリズムによってトリガされる抗生物質によって阻害されます。プラス成長率が予め設定した閾値（OD TH = 0.086）上記の光学濃度を上昇させた場合、デバイスは、薬物注入モードに切り替わります。そうでない場合、デバイスは、薬物希釈モードで実行されます。赤と紫の矢印は、それぞれ、薬物注射と薬の希釈モードに切り替え示しています。 （b）はトリメトプリムへの曝露の12日の間に細胞の抵抗レベル。 IC 50は、抗生物質薬剤耐性の明確な段階的増加を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3： 細胞形態とオンチップ抗生物質感受性を調査するためのマイクロ流体デバイスチップレイアウトの（a）の顕微鏡写真。緑と青の区画は、それぞれ、増殖および薬物媒体室であり、赤色レイアウト制御層です。成長室の寸法は、450ミクロン（l）は 400ミクロン（ ワット）が 8ミクロン（h）を X Xです。成長チャンバは、細菌がロードされ、そして薬剤室はTMPがロードされます。スケールバーは1cmです。 （b）は同じチップのビューに拡大。スケールバー=500μmの。 （c）の両室の拡大図を前にし、混合した後。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4：E のオンチップ成長曲線 （a）は、野生型祖先株及び（12日目）（b）の変異株： 大腸菌は、TMP の様々な濃度に曝露しました 。変異体サンプルは、抗生物質耐性の有意な増加を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 単一細胞形態 （ - d）の TMPのサブ抑制レベルでの処理後の細胞の明視野像。 （D変異体に存在しない野生型細胞の有意な糸状体（B）を 、注意してください（E - H）を、デジタル画像である（ - D）。すべての細菌の画像は40倍の倍率の対物レンズとCCDカメラで撮影した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足図1：培養バイアルホルダーの寸法およびアセンブリは 、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足図2：LEDと光検出器のための回路図で 、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足コード：マイクロ流体チップから取得された細胞の画像から細胞数をカウントするカスタムスクリプト 、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| サンプル | TMP薬物濃度（μg/ ml）を | |||||||||||
| 日1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| 4日目 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| 日5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <TD> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| 日8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 千 | 2,000 | |
表1：/ mlの単位でプレートリーダー測定薬物濃度で IC 50を 決定するために使用される薬物濃度は、毎日凍結試料のために表示されます。細胞は、より高い薬剤耐性を開発するように、使用される薬物濃度はそれに応じて増加します。
| いいえ | ロケーション | SNP | 注意 |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> A | DHFR遺伝子 |
| 3 | 49795 | C-> T | DHFRプロモーター |
表2：サンガー配列決定により同定DHFRにおける変異の代表的な配列データは、最後の日の変異体（12日目）で3 DHFRの点変異を示します。プロモーターと遺伝子の領域は、それぞれ、1と2のSNPが含まれています。 PCRに用いたフォワードおよびリバースプライマーは3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'と3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5」でした。
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Discussion
低コストの構成要素からの低フットプリントmorbidostat装置が示されています。デバイスが登録された薬剤耐性レベルの増加は、以前の報告5のものと一致しています。薬剤耐性の進化の研究のために設計され、デバイスは、他の多くの実験に潜在的に適用可能です。まず、薬剤誘発性の変異の包括的なデータベースは、臨床的に関連する抗生物質の大規模なセットのために確立することができます。例えば、複数の薬剤耐性の進化の経路は、単に実験に用いた薬物の数を増加させることによって調べることができます。ここで報告されたモジュールの主な利点は、異なる実験条件の下で大規模な、平行実験を可能にする、柔軟な構成可能です。
概念は、マイクロ流体の測定で実証されたが、調査力は、流体技術23を用いてマイクロ流体工学を組み合わせることによって改善することができます。あたりのコスト測定（規模の経済）が劇的に低下し、試薬の消費量と低減労力によって低減されます。ここでは、単一細胞形態のデータは、マイクロ流体プラットホームから抽出することができます。最近では、単一細胞のマイクロ流体形態のテストが正常に臨床微生物検査室で実施されており、標準的な培養液連続希釈試験24と同等に行います。マイクロ流体デバイスの可用性を高めるとともに、組み合わせの技術は、大規模、高スループット実験室進化実験を可能にします。
いくつかのステップがmorbidostatを実行することが重要です。磁気撹拌器は、磁石と、冷却ファンから形成されているため、第一に、培養バイアルにファンの軸を整列させるために重要です。また、培養バイアルと磁石との間の距離は、安定した動作を保証するために非常に重要です。第二に、毎日の実験の初めに新しい培養バイアルに切り替えることでもすることが重要ですバイオフィルム形成を回避します。それ以外の場合は、バイオフィルム形成は、2または3日以内に発生する可能性があります。第三に、理由E.大腸菌試料は一貫性を確保するために、毎日の実験中に凍結したサンプルから、毎日解凍し、微生物のうち合計洗浄を回避するために、少なくとも4時間の遅延時間を設定することが重要です。あるいは、Eを凍結しないことを選択することができます直接大腸菌サンプルと新しい文化を開始するために、新しい文化バイアルを接種するために、サンプルを使用しています。
実際的な設定では、現在のシステムの設計は、その潜在的な用途を拡張するためにいくつかの制限を克服しなければなりません。システム全体のボリュームが、現在、一日あたり消費媒体によって制限されている（ケモスタット操作中に、1つの培養バイアルは0.33時間-1の典型的な希釈率で一日あたりの培地の約0.5 Lを消費します）。作業量を減少させるために、さらなる最適化がplumbi有する薬物禁止人口動態に注意深いシミュレーションすることによって達成することができますngが25パラメータ 。
最後に、morbidostatは、細菌培養実験の広い範囲に容易に適応可能です。例えば、発光ダイオードを取り付けることによって、システムは、シアノバクテリアまたは微細藻類26の進化の監視を可能にする、フォトバイオリアクターとして再構成することができます。モジュールは、無線で、バッテリパック内のデバイスを操作することにより、吸着剤を用いて気密容器内に嫌気性微好気培養に拡張することができます。別の例として、毒素の濃度が徐々に目標化学物質27に対して耐性である株を操作するために増加させることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
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