Abstract
Vi beskriver en låg kostnad, konfigurerbar morbidostat för att karakterisera den evolutionära vägen för antibiotikaresistens. Den morbidostat är en bakteriekultur enhet som kontinuerligt övervakar bakterietillväxt och dynamiskt justerar läkemedelskoncentrationen att ständigt utmana bakterier eftersom de utvecklas att förvärva läkemedelsresistens. Enheten har en arbetsvolym av ~ 10 ml och är helt automatiserad och utrustad med optisk densitet mätning och mikropumpar till mellanstora och drug delivery. För att validera plattformen, mätte vi stegvis förvärv av trimetoprim motstånd i Escherichia coli MG 1655, och integreras enheten med en multiplex mikroflödes plattform för att undersöka cellmorfologin och antibiotikakänslighet. Tillvägagångssättet kan skalas upp till laboratoriestudier av antibiotika resistens, och är utdragbara för adaptiv evolution för stam förbättringar i metabolisk ingenjörskonst och andra bakteriekultur experiment.
Introduction
Sedan introduktionen av den första antibiotikum penicillin, har mikrobiell antibiotikaresistens utvecklats till ett globalt hälsoproblem 1. Även förvärvet av antibiotikaresistens kan i efterhand studeras in vivo, är villkoren för dessa försök ofta inte kontrolleras hela evolutionen 2. Alternativt kan adaptiv laboratorium evolution avslöja molekylär evolution av en mikrobiell art enligt miljöpåfrestningar eller selektionstryck från ett antibiotikum läkemedel 3. På senare tid har många välkontrollerade evolutionära experiment av antibiotika resistens klar uppkomsten av antibiotikaläkemedelsresistens. Till exempel, Austin grupp visade snabb framväxt i en korrekt konstruerad mikroflödesfack miljö 4. Den nyutvecklade morbidostat inducerar systematiska mutationer enligt läkemedelsselektionstryck 5,6. Den morbidostat, en mikrobiell selectionsanordning som kontinuerligt justerar antibiotikakoncentrationen att upprätthålla en nästan konstant befolkning, är ett stort framsteg från fluktuationer test som används i mikrobiologi 7,8. I fluktuationen test, ett antibiotikum läkemedlet injiceras vid hög koncentration, och de överlevande mutanter screenas och räknas. Istället mikrober i en morbidostat ständigt utmanas och förvärva flera mutationer.
Den morbidostat fungerar på samma sätt som kemostat, en kultur anordning uppfanns av Novick och Szliard 1950 som upprätthåller en konstant befolkning genom att kontinuerligt tillföra näringsämnen samtidigt späda den mikrobiella populationen 9. Sedan introduktionen har kemostaten förts fram och förbättras. Aktuella mikroflödes kemostater har nått nanoliter och encelliga kapacitet. Emellertid är dessa anordningar är olämpliga för adaptiv evolution experiment, vilka kräver en stor cellpopulation med många mutationshändelser 10,11. Nyligen, mini-kemostater med arbetsvolymer ~ 10 ml har också utvecklats för att fylla gapet mellan liter skala bioreaktorer och mikroflödes kemostaten 12,13.
Här presenterar vi utformningen och användningen av en låg kostnad, automatiserad morbidostat för en antibiotisk läkemedelsresistens studien. Den föreslagna Modulen kan användas i en skakinkubator i ett mikrobiologiskt laboratorium med krav minimal hårdvara. Öppen källkod firmware är också lätt anpassas till specifika tillämpningar av adaptiv evolution, såsom metabolisk teknik 3. Slutligen är morbidostat integreras i en multiplexerad mikroflödes plattform för antibiotikakänslighetstestning 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering och pretesting av Morbidostat Device
- Montering av Morbidostat
- Stansa 3 hål på locket av odlingsflaskan med en 18 G sprutnål. Skär tre bitar av polyeten slang ~ 7 cm i längd. Infoga dessa tre bitar av polyeten slang på locket.
- Använd tejp för att linda kanten av locket för att tjäna som gjutna för polydimetylsiloxan (PDMS) blandning. Blanda 5 g av A-komponenten och 0,5 g B-komponenten av PDMS i en 150 ml plastbehållare genom omrörning för hand med en tandpetare. Fyll blandningen i en 10 ml spruta.
- Häll PDMS blandningen på locket med sprutan. Baka hela kapsylen för att bota PDMS under 8 timmar i ugnen vid 70 ° C.
- Löd LED anoden med 24 gauge tråd och LED katod med kolet motstånd med en lödkolv. Löd en 680 Ω kol motstånd med en 24 G tråd. Isolera trådanslutning med eltejp.
- Sålder kollektor fotodetektorn med 24 G tråd och emittern hos fotodetektorn med en 100 kQ kol resistor. Isolera trådanslutning med eltejp.
- Placera den Ijusemitterande dioden i odlingsflaskhållaren. Genom att följa kopplingsschemat i tilläggs figur 2 ansluter lysdiod och ström med en spänning på 5 V. Se till att lysdioden fungerar med hjälp av en digital kamera som kan upptäcka IR (t.ex. en mobiltelefon kamera).
- Placera fotodetektorn i odlingsflaskhållaren. Genom att följa kopplingsschema i Kompletterande Fig 2, ansluter fotodetektor och ström med en spänning på 5 V. Anslut kabeln till båda sidor av fotodetektor motstånden för att mäta spänningen över den elektroniska styrkortet.
- Limma en magnet på axeln från kylfläkten, som fungerar som den magnetiska omröraren enheten. Notera att alignment av axeln av fläkten till odlingsflaskan, och avståndet mellan odlingsflaskan och magneten är mycket kritisk för en korrekt funktion av den magnetiska omrörningsenheten.
- Anslut varje bit av polyetenrör av odlingsflaskan till motsvarande bit silikonslang för mikropumpar, medel flaskor och avfallsflaskan. Slå på pumpen under 1 h och mäta den totala volymen som pumpas från mediet flaskan till odlingsflaskan för att bestämma pumphastigheten. Notera att den typiska pumphastigheten bör vara ~ 4 ml / h, vilket motsvarar den utspädningshastighet D = 0,33 h -1 för en 12 ml arbetsvolym av odlingsflaskan.
- Placera hela enheten på en medelstor (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) skakinkubator.
- Pretesting den Morbidostat
- Ställ in matningsspänning av kall fläkt till 5 V för att börja sin motor för att testa magnetisk omrörarstav. Observera att omrörningsverkan kan inspekteras visuellt. Den spänning som drivers kylningsfläktmotorn är exakt styrd av pulsbreddsmodulering (PWM).
- Bered en serie av vildtyp E. coli-prover med optisk densitet vid 600 nm typiskt sträcker sig från 0,07 till 0,3 för kalibrering. Placera ett test E. coli prov i odlingsflaskan och registrera fotodetektom spänning.
- Plats ~ 100 | il av samma prov i plattläsare och registrera den optiska densiteten. Använda fotodetektorspänning-optiska densitetsdata för att konstruera kalibreringskurvan. Observera att typiskt, en enhet förändring i optisk densitet motsvarar ~ 7,6 V förändring i fotodetektorn med bias system som används här.
2. Köra Morbidostat
- Förberedelse Innan du börjar Daily Experiment
- Förbered kultur flaskan med tre ultra-kemiskt resistenta Tygon slangar med innerdiametern 1/32 tum och ytterdiameter 3/32 tum för inlopp för att bilda enheten som i avsnitt1,1 och i tilläggs Figur 1.
- Förbered M9 minimalt medium (0,2% glukos) och trimetoprim (TMP) läkemedelsinnehållande medium. Sterilisera mediet, mediet flaskan, drogen mediet flaska, avfallsflaskan, och kulturen flaskan i en autoklav vid 121 ° C.
OBS: TMP är en stamlösning som används för att senare uppnå de koncentrationer som anges i tabell 1 och TMP läkemedelsinnehållande medium är inte autoklaveras.
- Kör Morbidostat
- På den första dagen av experimentet, tina 1 ml fryst vildtyp E. coli MG1655-celler för 5 minuter vid rumstemperatur och överföring 120 pl av cellerna till odlingsflaska innehållande ~ 12 ml M9 tillväxtmedium. Efter den första dagen, tina en ml av fryst E. coli celler från föregående dag under 5 minuter och överföring 120 pl av cellerna till en ny kultur flaska innehållande ~ 12 ml M9 odlingsmedium.
- Slå på skakinkubator och ställ in tempe peratur till 30 ° C utan skakning.
- Starta morbidostat processen genom att vrida på mikro-pump, den magnetiska omrörningsenheten, och den optiska densitetsmätning.
OBS: Under operationen är en återkopplingströskelalgoritmen används för att styra läkemedelsinjektion. När den uppmätta optiska densiteten överskrider ett förinställt tröskelvärde, skulle preparatinjektionspumpen slås på och mediet pumpen skulle stängas av. Annars förblir preparatinjektionspumpen av och den mediumpumpen är på. - Övervaka spänningen från tid till annan för att säkerställa att det finns mikrobiell tillväxt.
Obs: På grund av frysningen och upptiningscykel, E. coli celler uppvisar en fördröjning på ~ 4 timmar under varje dag tillväxt. - Efter ~ 23 timmar, stoppa mikropumpen genom att stänga av dess matningsspänning och ta ut odlingsflaskan. Lägg 15% glycerol i odlingsflaskan och frysa provet vid -80 ° C för lagring.
- Upprepa steg 2.2.1 till 2.2.5.
OBS: Utför mätningen tillväxttakten i en plattläsare med en 96 brunnsformat för att bestämma antibiotikamotståndsnivå.
- Tina den dagliga frysta provet vid rumstemperatur under 5 min och överför 15 | il av cellen till odlingsflaska innehållande ~ 15 ml M9-medium. Låt dem växa tills den optiska densiteten vid 600 nm når ~ 0.1. Dela upp de 15 ml i 1 ml flaskor och tillsätt TMP läkemedlet vid detta steg för att erhålla de önskade läkemedelskoncentrationer som visas i Tabell 1.
- Ta 200 pl av provet från steg 3,1 och placera i varje brunn i plattläsare och tillåta dem att växa under 12 h 5. Den optiska densiteten vid våglängden 600 nm registreras automatiskt under mätningen.
OBS: För varje datapunkt är tredubbla mätningar registreras och medelvärdet för att säkerställa konsekvens av data. Uppgifterna om optisk densitet kontra tid kan be används för att erhålla tillväxthastigheten. - Plotta data tillväxttakt jämfört med läkemedelskoncentrationen att få IC 50. Observera att IC 50 definieras som den läkemedelskoncentration vid vilken tillväxttakten är femtio procent av den maximala tillväxten 5.
4. Single cellmorfologin och antibiotikakänslighet Mätning mikrofluidumanordningar
- Utför tillverkning av mikroflödessystem enheter via flerskiktsmjuk litografi från PDMS som beskrivs på annan plats 15.
- Använd fotolitografi för att göra fotoresisten formen för kontroll och flödesskikt. Notera att för kontrollskiktet, använda negativ fotoresist (~ 15 | j, m höjd) och positiv fotoresist (~ 8 ^ m höjd) för att producera en form på en bar kiselskiva.
- Förbereda PDMS blandningar med tvärbindningsförhållanden av 5: 1 och 20: 1 för bekämpning skiktet och flödesskiktet, respektive. Sätta blandningarna in i en torkapparat under vakuum för att avlägsna eventuella bubblor, Under 1 timme.
- Exponera styrlager fotoresist formar på kiselskiva att trimetylklorsilan (TMCS) ånga. Göra kontrollskikt på ~ 6 mm tjocklek genom gjutning av PDMS-blandning (med tvärbindningsförhållande 5: 1) på kiselskivan på styrskiktet fotoresist mögel. Baka kontrollskikt för 40 min vid 80 ° C under en timme i ugnen.
- Göra strömningsskikt genom spinnbeläggning av en PDMS-blandning (med tvärbindningsförhållandet 20: 1, centrifugeringshastighet 3000 varv per minut under 60 sek) på en strömningsskikt fotoresist mögel. Baka strömningsskikt i 30 minuter vid 80 ° C under en timme i ugnen.
- Använda ett rakblad för att skära styrskiktet till den önskade spånstorlek (typiskt 3 cm x 2 cm) och manuellt dra av styrskiktet. Placera styrskikt ovanpå flödesskiktet och anpassa dem under ett stereomikroskop. Härda det inriktade aggregatet vid 80 ° C i ugn över natten. Efteråt, blöt enheten i 250 ml avjoniserat vatten i en plastbehållare för 5 timmar för att lösa kvarvarande TMCS.
- Därefter stansa inloppshålen med 20 g nålar och binda hela elastomeren till en glasskiva belagd med en tom PDMS skikt (PDMS tvärbindningsförhållandet 5: 1, centrifugeringshastighet 2000 rpm under 30 sek) genom luftplasmabehandling under 40 sekunder vid 1,2 Torr lufttryck.
- Genomföra omfattande bakning för 36 timmar vid 80 ° C för att reducera de cytotoxiska effekterna från PDMS. Notera att detta bakningssteg är avgörande för att minimera toxicitet till bakteriecellerna.
- På Chip Tillväxt Experiment
- Före laddning i mikrofluidanordning, spola den med avjoniserat vatten i 1 h och M9-medium under 1 timme.
- Tina den dagliga frysta provet vid rumstemperatur under 5 min och inokulera ett annat provrör med färskt M9-medium. Placera provet i en skakinkubator vid 37 ° C över natten.
- Späd den mikrobiella prov 10 gånger med M9-medium och ladda in den i mikroflödessystem enheten genom att tvinga den mikrobiella provbehållaren vid 5 psi. Sedan ladda TMP drogenmediet i chipet genom att tvinga läkemedlet mediet behållare vid 5 psi. Exekvera blandningen mellan mikroben och läkemedlet genom att manövrera den mikromekaniska ventilen mellan de två kamrarna på mikroflödessystem chip för 15 min.
- Placera mikroflödes chip i mikroskop inkubatorn monterad på inverterat mikroskop. Förvärva cell bilden i tillväxtkammaren varje timme under 8 timmar med CCD-kameran är monterad på inverterat mikroskop.
- Använd anpassat program skript för att beräkna antalet celler genom en tröskelalgoritmen på cellbilddata 18. Observera att cellnummerdata medelvärdes typiskt över tre mikroflödeskammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovan beskrivna morbidostat är schematiserad i Figur 1. De gemensamma morbidostat verksamhet, inklusive experimentell utveckling, antibiotikakänslighet test och cellmorfologin kontroll, validerades i en E. coli MG1655 kultur utsätts för trimetoprim (TMP), ett vanligt använt antibiotikum 5,6. TMP inducerar mycket distinkta stegökningar läkemedelsresistens, och mutationerna är grupperade runt dihydrofolatreduktas (DHFR) genen. Därför är TMP en mycket effektiv standard läkemedel för att validera morbidostat operationen. Varje dag, är mikroben förväntas växa över inställt optiska tröskeldensitet och utlösa preparatinjektions såsom visas i figur 2a. Preparatinjektions förväntas hämma tillväxten och som ett resultat, minskar den optiska densiteten. Flera provkörningar kan behövas för att bestämma den optimala läkemedelskoncentration. Som en tumregel, vi increase koncentrationen av läkemedlet mediet genom 5-faldig efter att ha konstaterat att läkemedelsmediet misslyckas med att undertrycka tillväxten. Efter att hela experimentets förlopp, är dagliga frusna prover tinades och användes för att bestämma IC50, ett kvantitativt mått på läkemedelsmotståndsnivå. Diagrammet i Figur 2b visar den tidsmässiga ökningen av den antibiotiska läkemedelsresistens. Den läkemedelsresistens ökade ungefär 1500 gånger till ~ 1000 pg / ml under ~ 12 dagar, i enlighet med tidigare resultat i laboratorie evolution 5 och kliniska isolat 19. DHFR punktmutationer i den sista dagars mutant mättes genom Sanger-sekvensering och är listade i tabell 2. En mutation kan hittas ligger på promotorregionen och indikerar att enstaka punktmutation i promotorområdet avsevärt kan ändra expressionsnivån av DHFR enzym 20. En annan mutation på plats 49.910 ligger i genregionen av DHFR och är nära till handlingive-stället i DHFR-enzym 21. Förvärv av läkemedelsresistens med multipla mutationer bevisar användbarheten av morbidostat, som valet på läkemedelsinnehållande agarplatta tenderar att förläna endast den enda mutationen.
Som en mer känslig avläsning av cellmorfologin är den encelliga morfologi check med antibiotikakänslighet utförs i ett parallellt, figur 3 visar utformningen av den multiplexerade mikroflödeschip multiplexerade mikrofluidisk plattformen 14.. Mikrofotografier av bakteriecellerna (Figur 5) visar morfologi förändringar i både vildtyp och mutantstammar i under hämmande koncentrationer av TMP. Vilda stammar typ signifikant filamentering medan mutantstammen visar ingen signifikant filamentering. Denna morfologi förändring vid en enda cell nivå kan användas i den snabba diagnostiska av antibiotikaresistens. Figur 4 visar den on-chip tillväxtkurvor vid olika koncentrationer av TMP. Den mutanta prov uppvisar en signifikant ökning i antibiotisk läkemedelsresistens. On-chip tillväxtdata i Figur 4 är också förenligt med IC 50 värde från den plattläsare visas i figur 2b.
Figur 1:. Schematisk ritning av morbidostat Den morbidostat är en kontinuerlig odling anordning som mäter den optiska densiteten hos den mikrobiella populationen, och följaktligen justerar läkemedelskoncentration. Enheten körs i läkemedelsinjektion läge och drogspädläge. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillväxt kurva och ökning av antibiotika resistens nivå (a) representant tillväxtkurva i feedback.. Den mikrobiella tillväxten inhiberas av den antibiotiskt läkemedel, vars injektion utlöses av en tröskelalgoritmen. När den positiva tillväxttakten ökar den optiska densiteten över den förinställda tröskeln (OD TH = 0,086), växlar enheten till läkemedelsinjektion läge. Annars kör enheten i läkemedelsutspädningsläge. Rött och lila pilarna visar byter till drog injektion och läkemedelsutspädnings lägen, respektive. (B) motstånd av cellerna under 12 dagar av exponering för trimetoprim. IC 50 visar en tydlig stegvis ökning av antibiotika resistens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
t = "Bild 3" src = "/ filer / ftp_upload / 54.426 / 54426fig3.jpg" />
Figur 3: Mikrofluidikanordningar för att undersöka cellmorfologin och on-chip antibiotikakänslighet (a) mikroskop av chipet layout.. Gröna och blå fack är tillväxt- och drogmedelkammare, respektive, och den röda layout betecknar kontroll lagret. Dimensionerna hos tillväxtkammaren är 450 | j, m (l) x 400 ^ m (w) x 8 ^ m (h). Odlingskammaren är laddad med bakterierna, och läkemedelskammaren är laddad med TMP. Skalstrecket är 1 cm. (B) Förstorad vy av samma chip. Skalstreck = 500 | j, m. (C) förstorad bild av båda kamrarna före och efter blandning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
"Src =" / filer / ftp_upload / 54.426 / 54426fig4.jpg "/>
Figur 4: on-chip tillväxtkurvor av E. coli exponerades för olika koncentrationer av TMP: (a) vildtyp ancestral stam och (b) mutant stam (vid dag 12). Mutanten provet visar en signifikant ökning i antibiotikaläkemedelsresistens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Encelliga morfologier (a - d) Bright fält bilder av cellen efter behandling med under hämmande nivåer av TMP. Notera betydande filament av vildtyp celler i (b), som är frånvarande i mutanterna (d (e - h) är digitaliserade bilder av (a - d). Alla bakterie bilder togs av en CCD-kamera med en 40X förstoring mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 1:. Måtten och montering av kulturen flaskhållaren Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande Figur 2. Kretsschemat för LED och en fotodetektor Klicka här för att ladda ner filen.
Tilläggskodex. Anpassad skript för att räkna antalet celler från de förvärvade cellbilder från mikroflödessystem chips Klicka här för att ladda ner filen.
| Prov | TMP Drug (^ g / ml) | |||||||||||
| dag 1-3 | 0 | 0,06 | 0,12 | 0,25 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| dag 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| dag 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| dag 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
Tabell 1:. Läkemedelskoncentration användes för att bestämma IC 50 i de koncentrationer Drug plattläsare mätning i enhet ig / ml visas för den dagliga frysta provet. Eftersom cellerna utvecklar högre läkemedelsresistens, är de läkemedelskoncentrationer som används i motsvarande grad.
| Nej | Plats | SNP | Notera |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> A | DHFR-genen |
| 3 | 49795 | C-> T | DHFR-promotorn |
Tabell 2:. Mutation i DHFR identifieras genom Sanger-sekvensering De representativa sekvensdata visar tre DHFR punktmutationer i den sista dagen mutant (dag 12). Promotorn och genregioner innehåller en och 2 SNP, respektive. Framåt- och bakåtriktade primrar som användes i PCR var 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 "och 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5 '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En låg fotavtryck morbidostat enhet från lågkostnadskomponenter demonstreras. Ökningarna i läkemedelsresistens nivå som registrerats av enheten överensstämmer med de tidigare rapporter 5. Designad för evolutionära studier av läkemedelsresistens, är enheten potentiellt tillämpas på många andra experiment. För det första kan fastställas en omfattande databas av läkemedelsinducerade mutationer för ett stort antal kliniskt relevanta antibiotika. Till exempel, kan det evolutionära reaktionsvägen av multipel läkemedelsresistens studeras genom att helt enkelt öka antalet läkemedel som används i experimentet. Den största fördelen med modulen rapporteras här är dess flexibla konfigurerbarhet, vilket möjliggör storskalig, parallella experiment under olika experimentella förhållanden.
Även om konceptet visades i mätningarna mikrofluidik kan utrednings makt förbättras genom att kombinera mikrofluidik med fluidic teknik 23. Kostnaden permätning (stordriftsfördelar) dramatiskt minskas med sänkt reagensförbrukningen och minskad arbetskraft. Här kan en enda cell Morfologiska data extraheras från mikroflödes plattformen. Nyligen har mikroflödes morfologi testning av enskilda celler har framgångsrikt genomförts i kliniska mikrobiologiska laboratorier och utför jämförbart med standard buljong serieutspädningstest 24. Med den ökande tillgången på mikroflödessystem enheter, kommer kombinerad teknik möjliggör storskaliga, hög genomströmning laboratorie evolution experiment.
Flera steg är avgörande för att köra morbidostat. För det första eftersom den magnetiska omrörningsenheten bildas av magneter och en kylfläkt, är det viktigt att anpassa skaftet hos fläkten till odlingsflaskan. Också, är mycket kritisk avståndet mellan odlingsflaskan och magneten för att säkerställa en stabil drift. För det andra att byta till en ny kultur flaskan i början av varje dag experiment är också viktigt attundvika biofilm formation. Annars kan biofilm formation inträffa inom 2 eller 3 dagar. För det tredje, eftersom E. coli-prover tinas dagligen från en fryst prov under varje dag experiment för att säkerställa konsekvens, är det viktigt att ställa in en fördröjning på minst fyra timmar för att undvika en total tvätt av mikroberna. Alternativt kan man välja att inte frysa E. coli-prover och direkt använda provet för att ympa en ny kultur flaskan för att starta en ny kultur.
I en praktisk inställning, måste det nuvarande systemet konstruktion övervinna flera begränsningar för att utöka dess potentiella användningsområden. Volymen av hela systemet är för närvarande begränsad av det medium som konsumeras per dag (under chemostatic drift, förbrukar en kultur ampull approximativt 0,5 L medium per dag på typiska utspädningshastighet av 0,33 h -1). För att minska arbetsvolymen, kan ytterligare optimering uppnås genom noggrann simulering på läkemedels hämmade populationsdynamik med plumbing parametrar 25.
Slutligen är morbidostat lätt kan anpassas till ett brett spektrum av bakteriella odlingsexperiment. Till exempel, genom att fästa en lysdiod, systemet skulle kunna omkonfigureras som ett foto-bioreaktor, som möjliggör den evolutionära övervakning av cyanobakterier eller mikroalger 26. Modulen kan utökas till anaeroba och mikroaerob odling i en gastät behållare med adsorbenter vid trådlös använder enheten i ett batteri. Som ett annat exempel kan koncentrationen av ett toxin ökas gradvis att konstruera stammar som är resistenta mot målet kemiska 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
