Abstract
Мы описываем низкой стоимости, конфигурируемый morbidostat для характеристики эволюционный путь устойчивости к антибиотикам. Morbidostat представляет собой бактериальную культуру устройства, который непрерывно контролирует рост бактерий и динамически регулирует концентрацию лекарственного средства, чтобы постоянно вызов бактерии, как они эволюционируют приобретать устойчивость к лекарству. Устройство имеет рабочий объем ~ 10 мл и полностью автоматизирована и оснащена измерения оптической плотности и микро-насосы для средних и доставки лекарственных средств. Для проверки платформы, мы измерили ступенчатое приобретение устойчивости к триметоприму в кишечной палочки MG 1655, и интегрировать устройство с мультиплексной микрожидком платформой для изучения морфологии клеток и чувствительности к антибиотикам. Такой подход может быть до-масштабируется для лабораторных исследований лекарственной устойчивости к антибиотикам, и продолжимо к адаптивной эволюции для улучшения деформаций в метаболической инженерии и других экспериментов бактериальной культуры.
Introduction
С момента введения первого антибиотика пенициллина наркотиков, бактериальная резистентность к антибиотикам превратилась в глобальную проблему здравоохранения 1. Хотя приобретение устойчивости к антибиотикам могут быть ретроспективно изучены в естественных условиях, условия этих экспериментов часто не контролируются на протяжении всей эволюции 2. В качестве альтернативы, эволюция адаптивной лаборатория может выявить молекулярную эволюцию видов микроорганизмов под экологическим стрессам или давлением отбора из препарата антибиотика 3. В последнее время многие хорошо контролируемых эволюционные эксперименты к антибиотикам лекарственной устойчивости прояснили появление антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Например, группа Остин продемонстрировал быстрое появление в правильной инженерии микрожидком секционный среды 4. Недавно разработанный morbidostat вызывает систематические мутации под давлением 5,6 выбора лекарственного средства. Morbidostat, микробный Селецции устройство , которое непрерывно регулирует концентрацию антибиотика поддерживать почти постоянное население, является важным шагом вперед от теста флуктуации , используемого в микробиологии 7,8. В тесте флуктуационном, препаратом антибиотиком вводят при высокой концентрации, и выжившие мутанты подвергают скринингу и подсчитывали. Вместо этого, микробы в morbidostat постоянно ставится под сомнение и приобретают множественные мутации.
Morbidostat работает аналогично хемостате, устройство культуры , изобретенной Новика и Szliard в 1950 году , который поддерживает постоянное население путем непрерывной подачи питательных веществ , в то время как разбавление микробной популяции 9. С момента своего появления, хемостатическую было переработано и улучшено. В настоящее время микрофлюидальные Хемостаты достигли nanoliter и одноклеточные потенциала. Однако эти устройства не подходят для адаптивных экспериментов эволюции, которые требуют большой популяции клеток с большим количеством мутаций событий 10,11. В последнее время, мини-Хемостаты с рабочими объемами ~ 10 мл также были разработаны , чтобы заполнить разрыв между литровых биореакторы и микрожидком хемостатной 12,13.
Здесь мы представляем дизайн и использование недорогой, автоматизированный morbidostat для исследовании антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Предлагаемый модуль может быть использован в шейкере инкубаторе в микробиологической лаборатории с минимальным требованием аппаратных средств. Встроенное программное обеспечение с открытым исходным кодом также легко адаптированы к конкретным областям применения адаптивной эволюции, такие как метаболической инженерии 3. И, наконец, morbidostat интегрирован в мультиплексированный микрожидком платформу для тестирования чувствительности к антибиотикам 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Монтаж и Предварительное тестирование из устройства Morbidostat
- Сборка Morbidostat
- Пуансона 3 отверстия, расположенные на крышке флакона культуры с иглой шприца 18 G. Отрежьте три куска полиэтиленовой трубы ~ 7 см в длину. Вставьте эти три куска полиэтиленовой трубы на крышке.
- Используйте ленту, чтобы обернуть край крышки, чтобы служить в качестве гипсе полидиметилсилоксана (ПДМС) смеси. Смешайте 5 г компонента и 0,5 г компонента B из PDMS в пластиковом контейнере емкостью 150 мл при перемешивании вручную с помощью зубочистки. Загрузите смесь в шприц объемом 10 мл.
- Вылейте смесь PDMS на крышке с шприца. Запекать всю крышку, чтобы вылечить PDMS в течение 8 часов в печи при 70 ° C.
- Припой LED анод с 24 калибра проволоки и LED катода с углеродным резистор с паяльником. Припой 680 Ω углеродный резистор с 24 G провода. Изолировать соединение проволоки с помощью изоленты.
- Такlder коллектору фотодетектора с 24 г проволоки и эмиттером фотодетектора с 100 кОм углеродного резистора. Изолировать соединение проволоки с помощью изоленты.
- Поместите светоизлучающий диод в держателе флакона культуры. Следуя схеме на дополнительном рисунке 2, подключите светоизлучающий диод и включите его с источником питания 5 В. Убедитесь , что светодиод работает с помощью цифровой камеры , которая может обнаружить ИК (например, камеры мобильного телефона).
- Поместите фотодетектор в держатель флакона культуры. Следуя схеме на дополнительном рисунке 2, соедините фотодетектор и власть его с источником питания 5 В. Подключите провод к обеим сторонам фотоприемных резисторов для измерения напряжения на электронной плате управления.
- Клей магнит на валу вентилятора, который служит в качестве магнитного блока мешалке. Обратите внимание, что в alignmлор вала вентилятора к ампуле культуры, а также расстояние между ампуле культурой и магнит имеет очень важное значение для правильной работы магнитного блока перемешивания.
- Соедините каждый кусок полиэтиленовой трубы флакона культуры в соответствующий кусок силиконовой трубки для микро-насосов, средних бутылки, и бутылка отходов. Включите насос в течение 1 ч и измеряют общий объем перекачиваемой из среды для бутылки к ампуле культуры, чтобы определить скорость насоса. Обратите внимание , что типичная скорость откачки должна быть ~ 4 мл / ч, что соответствует скорости разбавления D = 0,33 ч - 1 на 12 мл рабочего объема флакона культуры.
- Поместите всю сборку на среднего размера (34 см х 34 см х 43,5 см) шейкера инкубатора.
- Предварительное тестирование на Morbidostat
- Установить напряжение питания вентилятора прохладного до 5 В, чтобы начать свой двигатель для проверки магнитной мешалки. Следует отметить, что перемешивание действие можно проверить визуально. Напряжение, которое приводы двигатель вентилятора охлаждения точно регулируется с помощью широтно-импульсной модуляции (ШИМ).
- Приготовьте серию дикого типа E. палочки образцы с оптической плотностью при 600 нм обычно в диапазоне от 0,07 до 0,3 для калибровки. Поместите тест E. палочки образца в пробирке культуры и записать напряжение фотоприемника.
- Место ~ 100 мкл того же образца в планшет-ридере и записывать оптическую плотность. Используйте напряжение фотодетекторов в сравнении с данными оптической плотности для построения калибровочной кривой. Следует отметить, что, как правило, одно изменение единицы оптической плотности соответствует ~ 7,6 V изменения в фотодетектор со схемой смещения, используемого здесь.
2. Запуск Morbidostat
- Подготовка Перед началом ежедневного эксперимента
- Подготовьте флакон культуры с тремя ультра-химической стойкости тюбингов TYGON с внутренним диаметром 1/32 дюйма и наружным диаметром 3/32 дюйма для испарителей, чтобы сформировать устройство, как и в разделе1.1 и в дополнительном рисунке 1.
- Приготовьте минимальной среде М9 (0,2% глюкозы) и триметоприм (TMP) лекарственного средства, содержащего среду. Стерилизовать среда, среда бутылку, среда бутылку наркотиков, бутылку отходов и флакон культуры в автоклаве при температуре 121 ° С.
Примечание: ТМП представляет собой маточный раствор , который используется для позже достижения концентрации в таблице 1 , и препарат , содержащий ТМП среда не автоклавируют.
- Запуск Morbidostat
- В первый день эксперимента, разморозить 1 мл замороженного дикого типа E. Клетки палочки 1655 в течение 5 мин при комнатной температуре и передачи 120 мкл клеток в культуральную пробирку , содержащую ~ 12 мл ростовой среды M9. После того, как в первый день, разморозить 1 мл замороженного E. палочка клетки из предыдущего дня в течение 5 мин и передачи 120 мкл клеток к новой культуре флакон , содержащий ~ 12 мл ростовой среды М9.
- Включите шейкер инкубатор и установить Темпе ратура до 30 ° C, без встряхивания.
- Начало операции morbidostat поворотом на микро-насос, магнитный блок для перемешивания и измерения оптической плотности.
Примечание: Во время операции порог обратной связи алгоритм используется для управления инъекции лекарственного средства. Когда измеренная оптическая плотность превышает заданный порог, инъекции препарат насос будет включен, и среда насос будет выключен. В противном случае, насос впрыска наркотиков остается выключенным, а средний насос включен. - Монитор напряжения время от времени, чтобы обеспечить там микробный рост.
Примечание: Из-за замораживании и оттаивании цикла, E. палочка клетки обнаруживают задержку ~ 4 часа во время роста каждого дня. - После ~ 23 ч, остановите микро-насос, выключив его напряжение питания и вынуть флакон культуры. Добавить 15% глицерина в пузырек с культурой и замораживать образца при -80 ° C для хранения.
- Повторите шаги 2.2.1 2.2.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните измерение скорости роста в ридере с 96-луночного для определения уровня сопротивления антибиотикам.
- Растаяйте суточную замороженную пробу при комнатной температуре в течение 5 мин и переносят по 15 мкл клетки в культуральный флакон, содержащий ~ 15 мл среды М9. Дайте им расти до оптической плотности при 600 нм не достигает ~ 0,1. Разделить 15 мл в 1 мл флаконах и добавить препарат TMP на этом этапе , чтобы получить требуемые концентрации лекарственного средства , как показано в таблице 1.
- Возьмите 200 мкл образца из шага 3.1 и место в каждую лунку в ридере и дать им возможность расти в течение 12 часов 5. Оптическая плотность при длине волны 600 нм, записывается автоматически во время измерения.
Примечание: Для каждой точки данных, тройные измерения регистрируются и усредняются для обеспечения согласованности данных. Данные по оптической плотности в зависимости от времени можно бе используется для получения скорости роста. - Изобразите данные о скорости роста в зависимости от концентрации лекарственного средства для получения IC 50. Обратите внимание , что ИК 50 определяют как концентрацию лекарственного средства , при которой скорость роста составляет пятьдесят процентов от максимальной скорости роста 5.
4. Single Cell Морфология и Антибиотик Восприимчивость Измерение в микрожидком устройств
- Выполните изготовление микрожидкостных устройств с помощью многослойной мягкой литографии из PDMS , как описано в другом месте 15.
- Используйте фотолитографии, чтобы сделать пресс-форму для фоторезиста слоев управления и потока. Обратите внимание, что для уровня управления, использование негативного фоторезиста (~ высота 15 мкм) и позитивного фоторезиста (~ высота 8 мкм), чтобы получить форму на голой кремниевой пластины.
- Подготовка PDMS смесей с перекрестными коэффициентами зацепления 5: 1 и 20: 1 для слоя управления и слоя потока соответственно. Помещенный смеси в эксикаторе под вакуумом, чтобы удалить пузырьки, В течение 1 часа.
- Вынести управления слой фоторезиста формы на кремниевой пластине с помощью триметилхлорсилана пар (ТМЦ). Сделать контрольный слой ~ толщиной 6 мм путем литья смеси PDMS (с поперечным соотношением связующей 5: 1) на кремниевой подложке на контрольный слой фоторезиста пресс-форме. Выпекать контрольный слой в течение 40 мин при 80 ° С в течение 1 ч в печи.
- Сделать слой потока методом центрифугирования смеси PDMS (с коэффициентом трансформации сшивающего 20: 1, скорости отжима 3000 оборотов в минуту в течение 60 с) на слое фоторезиста потока пресс-формы. Выпекать слой потока в течение 30 мин при 80 ° С в течение 1 ч в печи.
- Используйте лезвие, чтобы сократить уровень управления в нужный размер чипа (обычно 3 см х 2 см) и вручную снимите слой управления. Поместите слой управления на верхней части слоя потока и выравнивать их под стереомикроскопа. Отверждение выровненный сборки при 80 ° С в печи в течение ночи. Затем пропитать сборку в 250 мл деионизированной воды в пластиковом контейнере в течение 5 часов, чтобы растворить остаточного ТМС,
- Впоследствии пробивать впускные отверстия 20 г игл и скрепить весь эластомер на предметное стекло с покрытием с пустым PDMS слоем (кросс ПДМС соединение соотношение 5: 1, скорость отжима 2000 оборотов в минуту в течение 30 сек) путем плазменной обработки воздуха в течение 40 сек при 1.2 давление воздуха торр.
- Провести обширные выпечки в течение 36 ч при 80 ° С, чтобы уменьшить цитотоксические эффекты от PDMS. Обратите внимание, что этот шаг выпечки важно свести к минимуму токсичность по отношению к бактериальным клеткам.
- На эксперименте Чип роста
- Перед загрузкой в микрожидком устройства, промойте его деионизованной водой в течение 1 ч и среде М9 в течение 1 часа.
- Растаяйте суточную замороженную пробу при комнатной температуре в течение 5 мин и прививают новую пробирку со свежей средой М9. Поместите образец в шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Развести микробной образец 10-кратно среде М9 и загрузить его в микрожидкостных устройство с опрессовкой микробной контейнер для пробы на 5 фунтов на квадратный дюйм. Затем загрузите препарат TMPсреда в чип с опрессовкой контейнер лекарственного средства среде при 5 фунтов на квадратный дюйм. Выполните смешивание между микробом и лекарственного средства путем приведения в действие микромеханическую клапан между двумя камерами на микрожидком чипа в течение 15 мин.
- Поместите микрожидкостных чип в микроскоп инкубатор, установленный на инвертированный микроскоп. В него изображение клеток в ростовой камере каждый час в течение 8 часов с ПЗС-камерой, установленной на инвертированный микроскоп.
- Используйте скрипт пользовательскую программу для вычисления числа клеток с помощью порогового алгоритма на данных 18 ячейки изображения. Обратите внимание, что данные числа клеток усредняются, как правило, в течение трех микрожидкостных камер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный выше morbidostat схематизировано на рисунке 1. Распространенное операции morbidostat, в том числе экспериментальной эволюции, антибиотик тест на чувствительность и проверки морфологии клеток, были подтверждены в E. палочки 1655 культура подвергается воздействию триметоприма (ТМП), обычно используемый антибиотик 5,6. TMP вызывает очень характерный ступенчато увеличивается в лекарственной устойчивости, а также мутации группируются вокруг гена дигидрофолатредуктазы (DHFR). Таким образом, ТМП является весьма эффективным стандартным лекарственным средством для проверки функционирования morbidostat. Каждый день, микроб , как ожидается, вырастет выше порога заданной оптической плотности и вызвать инъекцию лекарственного средства , как показано на рисунке 2а. Инъекционный препарат, как ожидается, для ингибирования роста и, как следствие, уменьшить оптическую плотность. Несколько трасс испытаний могут быть необходимы для определения оптимальной концентрации лекарственного средства. Как правило, мы повые концентрация носителя лекарственного средства на 5-кратно после того, как обнаружили, что носитель лекарственного средства не может подавить рост. После того, как весь ход эксперимента, ежедневные замороженные образцы оттаивают и используются для определения IC 50, количественную меру уровня устойчивости к лекарственному средству. График на рисунке 2b показывает временное увеличение антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Устойчивость к лекарственным препаратам увеличилась примерно в 1500 раз до ~ 1000 мкг / мл в течение ~ 12 дней, в соответствии с предыдущими результатами в лаборатории эволюции 5 и 19 Клинические изоляты. Точечные мутации DHFR в последней день мутанта были измерены с помощью Sanger секвенирования и приведены в таблице 2. Одна мутаци расположена на промоторной области и указывает на то, что одной мутации точки в области промотора , может значительно изменить уровень экспрессии DHFR фермент 20. Еще одна мутация в месте 49,910 находится в области гена DHFR и близка к актуАйв сайт DHFR фермента 21. Приобретение лекарственной устойчивости с множественными мутациями доказывает полезность morbidostat, как отбор на наркосодержащих агаризованной, как правило, придают только единственную мутацию.
В качестве более чувствительного считыванием морфологии клеток, то одноклеточный проверка морфологии с чувствительности к антибиотикам проводят в параллель, мультиплексированный Микрожидкостных платформа 14. На рисунке 3 показана конструкция мультиплексной микрожидком чипа. Микрофотографии бактериальных клеток (рисунок 5) выявить изменения морфологии как дикого типа и мутантные штаммы , согласно подразделу подавляющей концентрации ТМП. штаммы дикого типа показывают значительную филаментацию в то время как мутантный штамм не проявляет существенного филаментацию. Это изменение морфологии на уровне одной клетки могут быть использованы в быстрой диагностики устойчивости к антибиотикам. 4 представлена на чиКривые роста р при различных концентрациях TMP. Мутант пример показывает значительное увеличение антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Данные роста на кристалле на фиг.4 , также согласуется со значением IC 50 от ридере показанной на рисунке 2b.
Рисунок 1:. Схема morbidostat morbidostat является непрерывным устройством культуры , который измеряет оптическую плотность микробной популяции, и , соответственно , регулирует концентрацию лекарственного средства. Устройство работает в режиме наркотиков инъекции наркотиков и разбавлением режиме. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Кривая роста и повышение уровня антибактериальной резистентности к лекарственным средствам (а) представитель кривой роста при обратной связи.. Микробный рост тормозится антибиотического препарата, чья инъекция инициируется порогового алгоритма. Когда положительный темп роста повышает оптическую плотность выше установленного порога (OD TH = 0,086), устройство переключается в режим лекарственно-инъекции. В противном случае устройство работает в режиме наркотиков разбавления. Красные и фиолетовые стрелки указывают на переключение в режимы употребления наркотиков путем инъекций и разбавления лекарственного средства, соответственно. (Б) уровень сопротивления клеток в течение 12 дней воздействия триметоприма. IC 50 показывает ярко выраженный скачкообразное увеличение антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
т = "Рисунок 3" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54426 / 54426fig3.jpg" />
Рисунок 3: микрожидком устройства для исследования морфологии клеток и чувствительности к антибиотикам на кристалле (а) Микрофотография макета чипа.. Зеленые и синие отсеки роста и среднего наркотиками камеры, соответственно, а красный макет обозначает слой управления. Размеры камеры роста 450 мкм (л) х 400 мкм (Ш) х 8 мкм (час). Камера роста загружается с бактериями, а камера лекарственного средства загружена TMP. Шкала бар составляет 1 см. (Б) Увеличенный вид на том же чипе. Шкала бар = 500 мкм. (С) Увеличенный вид обеих камер до и после смешивания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
"SRC =" / файлы / ftp_upload / 54426 / 54426fig4.jpg "/>
Рисунок 4: На чипе кривые роста E. палочка подвергается воздействию различных концентраций ТМП: наследственный деформации (а) дикого типа и (б) мутантного штамма (на 12 -й день). Мутант пример показывает значительное увеличение антибактериальной резистентности к лекарственным средствам. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Одноклеточные Морфология (а - г) Светлое поле изображения ячейки после обработки суб-ингибирующее уровней TMP. Обратите внимание на значительное филаментацию клеток дикого типа в (б), который отсутствует у мутантов (d (е - з) являются оцифрованные образы (а - г). Все бактериальные снимки были сделаны с помощью ПЗС - камеры с объективом 40 - кратном увеличении. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительное Рисунок 1:. Размеры и монтаж держателя флакона культуры Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл.
Дополнительный Рис . 2: Принципиальная схема для СИД и фотодетектор Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный код:. Пользовательский скрипт для подсчета количества клеток из полученных изображений клеток из микрожидкостных чипов Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
| Образец | TMP наркотическими средствами (мкг / мл) | |||||||||||
| День 1-3 | 0 | 0.06 | 0,12 | 0,25 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| 4-й день | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| День 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <TD> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| День 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
Таблица 1:. Концентрация лекарственного вещества используется для определения IC 50 в концентрации лекарственного средства ридер измерения в единицах мкг / мл отображаются для ежедневного замороженного образца. По мере того как клетки развиваются более высокую устойчивость к лекарственным средствам, концентрации лекарственного средства, используемые увеличиваются соответственно.
| Нет | Место нахождения | SNP | Заметка |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> а | ген DHFR |
| 3 | 49795 | C-> T | DHFR промотор |
Таблица 2:. Мутации в DHFR идентифицируются Sanger секвенирования Данные представительные последовательности показывают три точечные мутации DHFR в последней день мутанта (день 12). Промотором и генные области содержат один и 2 ОНП, соответственно. Прямого и обратного праймеров, используемые в ПЦР были 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'и 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Невысокое след morbidostat устройство от недорогих компонентов демонстрируется. Увеличения уровня резистентности к лекарственным средствам , зарегистрированных в устройстве согласуются с данными предыдущих докладов 5. Предназначен для эволюционных исследований лекарственной устойчивости, устройство потенциально применима ко многим другим опытам. Во-первых, обширная база данных мутаций, вызванных препаратами может быть установлена для большого набора клинически значимых антибиотиков. Например, эволюционный путь множественной лекарственной устойчивости может быть изучена путем простого увеличения количества лекарственных средств, используемых в эксперименте. Основное преимущество модуля сообщается здесь является гибкая настраиваемость, что позволяет крупномасштабные, параллельные эксперименты при различных экспериментальных условиях.
Хотя эта концепция была продемонстрирована в измерениях микрофлюидики, следственным мощность может быть улучшена путем комбинирования микрофлюидики с технологией струйного 23. Стоимостьизмерение (экономия от масштаба) резко снижается по пониженным потреблением реагентов и снижение рабочей силы. Здесь данные единая морфология клеток могут быть извлечены из микрожидком платформы. Недавно Микрожидкостных морфология тестирование отдельных клеток была успешно реализована в клинических микробиологических лабораториях, и выполняет сравнительно со стандартными бульонных серийного разведения испытаний 24. С увеличением доступности микрофлюидальных устройств, комбинированные технологии позволит крупномасштабные, с высокой пропускной способностью экспериментов лаборатории эволюции.
Несколько шагов имеют решающее значение для запуска morbidostat. Во-первых, так как магнитное перемешивание блок формируется из магнитов и охлаждающего вентилятора, крайне важно, чтобы выровнять вал вентилятора на флаконе культуры. Кроме того, расстояние между ампуле культурой и магнит имеет очень важное значение для обеспечения стабильной работы. Во-вторых, переход на новый флакон культуры в начале эксперимента каждый день также имеет важное значение дляВо избежание образования биопленки. В противном случае, образование биопленки может произойти в течение 2-х или 3-х дней. В- третьих, потому что Е. Образцы палочки размораживают ежедневно из замороженного образца в ходе эксперимента каждый день , чтобы обеспечить согласованность, важно установить период задержки , по меньшей мере , 4 часа , чтобы избежать полного вымывания микробов. В качестве альтернативы можно выбрать не замерзнуть E. палочки образцы и использовать непосредственно образец для инокуляции нового флакона культуры , чтобы начать новую культуру.
В практических условиях, текущая конструкция системы должна преодолеть ряд ограничений для расширения своих потенциальных использований. Объем всей системы в настоящее время ограничена средой потребленный в день ( в течение chemostatic операции, одна пробирка культура потребляет примерно 0,5 л среды в сутки при типичной скорости разбавления 0,33 ч -1). Для уменьшения рабочего объема, дальнейшая оптимизация может быть достигнута путем тщательного моделирования на лекарственно-тормозится динамики населения с plumbiнг параметры 25.
И, наконец, morbidostat легко адаптируется к широкому спектру экспериментов бактериальной культуры. Например, путем присоединения светоизлучающий диод, то система может быть изменена , как фото-биореактора, что позволяет эволюционный мониторинг цианобактерий или микроводорослей 26. Модуль может быть расширен до анаэробного и микроаэробной выращивания в газонепроницаемой емкости с адсорбентов беспроводным способом работы с устройством в аккумуляторной батарее. В качестве другого примера, концентрация токсина может быть постепенно увеличена , чтобы спроектировать штаммы, устойчивые к целевому химиката 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
