Abstract
우리는 항생제 내성의 진화 경로를 특성화 저렴한 비용으로, 구성 morbidostat에 대해 설명합니다. morbidostat 연속적 박테리아 증식을 모니터링하여 동적으로 약물 내성을 획득 진화 항상 세균 도전 약물 농도를 조절하는 세균 배양 장치이다. 이 장치는 ~ 10 ML의 작업 볼륨을 갖추고 있으며, 완전 자동화 및 광학 밀도 측정 및 매체 및 약물 전달 마이크로 펌프가 장착되어 있습니다. 플랫폼의 유효성을 확인하기 위해, 우리는 1655 대장균 MG에서 trimethoprim을 저항의 단계적 취득을 측정하고, 세포 형태 및 항생제 감수성을 조사 할 수있는 멀티 플렉스 미세 유체 플랫폼과 장치를 통합. 접근 방식은 항생제 약물 내성의 실험실 연구를 확장 업 및 대사 공학 및 기타 세균 배양 실험에서 변형 개선을 위해 진화를 적응 적하는 확장 가능한 것입니다 수 있습니다.
Introduction
최초의 항생제 페니실린의 도입 이후, 미생물의 항생제 내성은 세계적인 건강 문제 (1)로 발전하고있다. 항생제 내성의 획득은 생체 내 향적 연구 할 수 있지만, 이러한 실험의 조건들은 전체에 걸쳐 방출이 제어되지 않는다. 이와 달리, 적응 실험실 진화 항생제 약물 (3)로부터 환경 스트레스 또는 선택 압력 하에서 미생물 종의 분자 적 진화를 공개 할 수있다. 최근 항생제 내성 많은 잘 제어 진화 실험은 항생제 내성 출현을 해명 하였다. 예를 들어, 오스틴의 그룹은 적절하게 설계 미세 유체 복실 환경 4의 급속한 출현을 보여 주었다. 최근에 개발 된 약물 morbidostat 선택 압력 하에서 5,6- 체계적 돌연변이를 유도한다. morbidostat, 미생물 SELEC연속적으로 거의 일정한 집단을 유지하기 위해 항생 물질의 농도를 조절 능 장치는 미생물 7,8에서 사용한 변동 테스트에서 큰 전진한다. 변동 시험에서, 항생제 약물을 고농도로 주입하고, 살아남은 돌연변이 스크리닝하고 계산한다. 대신, morbidostat에서 미생물 끊임없이 도전하고 여러 돌연변이를 획득한다.
morbidostat는 chemostat, 미생물 인구 9 희석 동안 지속적으로 영양분을 공급하여 일정한 인구를 유지하고 1950 년 노빅과 Szliard에 의해 발명 문화 장치와 유사하게 작동합니다. 도입 이후, chemostat는 고급 및 개선되었습니다. 현재 마이크로 유체 chemostats은 나노 리터 및 단일 셀 용량에 도달했습니다. 그러나, 이러한 장치는 많은 돌연변이 이벤트 10, 11와 큰 세포 인구를 필요로 적응 진화 실험에 적합하다. 최근, 미니~ 10 ml로 작업 볼륨이 chemostats는 리터 규모의 생물 반응기 및 마이크로 유체 chemostat (12, 13) 사이의 간극을 채우기 위해 개발되었다.
여기에서 우리는 항생제 약물 내성 연구에 대한 설계 및 저가의 사용, 자동 morbidostat을 제시한다. 제안 된 모듈은 최소한의 하드웨어 요구 사항을 가진 미생물 실험실에서 진탕 배양기에서 사용될 수있다. 오픈 소스 펌웨어는 쉽게 대사 공학 3과 적응 진화의 특정 애플리케이션에 맞게 조정된다. 마지막으로, morbidostat 항생제 감수성 검사 (14)에 대한 멀티 플렉스 미세 유체 플랫폼에 통합되어 있습니다.
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Protocol
Morbidostat 장치의 1 조립 및 사전 테스트
- Morbidostat 조립
- 18 G 주사기 바늘 문화 유리 병의 뚜껑에 3 홀 펀치. ~ 길이 7cm를 폴리에틸렌 튜브의 세 가지를 잘라. 캡에 폴리에틸렌 튜브의이 세 가지를 삽입합니다.
- 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 혼합물의 주조로 사용하기 위해 캡의 가장자리를 감싸 테이프를 사용합니다. 이쑤시개 수동으로 교반하여 성분 5 g 및 150 ml의 플라스틱 컨테이너에 PDMS의 B 성분의 0.5 g을 혼합한다. 10 ML의 주사기에 혼합로드합니다.
- 주사기와 캡의 PDMS 혼합물을 붓고. 70 ° C의 오븐에서 8 시간에 대한 PDMS를 경화 전체 캡을 굽는다.
- 납땜 인두와 탄소 저항과 24 게이지 와이어 및 LED 음극과 양극 LED를 납땜. 24 G 와이어와 680 Ω 탄소 저항을 납땜. 전기 테이프를 사용하여 와이어 연결을 절연.
- 그래서24 G 선 및 100 kΩ의 탄소 저항기 검출기의 이미 터와 광 검출기의 콜렉터 lder. 전기 테이프를 사용하여 와이어 연결을 절연.
- 문화 유리 병 홀더에 발광 다이오드를 배치합니다. 부가도 2의 회로도를 수행함으로써, LED는 IR (예를 들어, 이동 전화 카메라)를 검출 할 수있는 디지털 카메라를 사용하여 작동하도록 5 V.의 전원 공급 다이오드와 전원을 발광 연결한다.
- 문화 유리 병 홀더 광 검출기를 배치합니다. 부가도 2의 회로도에 따라, 전자 제어 보드를 가로 지르는 전압을 측정하는 검출기 저항의 양측에 와이어를 연결 5 V.의 전원과 광 검출기 및 전원에 연결.
- 교반기 수단 인 냉각 팬의 축에 자석을 붙인다. alignm합니다배양 병에 팬 및 배양 바이알과 자석 사이의 간격의 축부의 엔트 자기 교반 장치의 적절한 기능에 매우 중요하다.
- 마이크로 펌프, 중간 병, 폐기물 병 실리콘 튜브의 대응 조각으로 배양 병의 폴리에틸렌 튜브의 각 부분을 연결합니다. 1 시간 동안 펌프를 켜고 전체 볼륨이 펌프 속도를 결정하기 위해 문화 유리 병에 매체 병에서 펌핑되는 측정한다. 일반적인 펌핑 속도가 희석 비율 D = 0.33 시간 -1 문화 유리 병의 볼륨을 작동하는 12 ml의 용에 해당 ~ 4 ㎖ / 시간이어야합니다.
- 중간 크기 (34cm X 34cm X 43.5 cm) 진탕 배양기에 전체 어셈블리를 놓습니다.
- Morbidostat을 사전 테스트
- 5 V로 냉각 팬의 집합 전원 전압은 자기 교반 막대를 테스트하기 위해 그 모터를 시작한다. 교반 작용 육안 검사 할 수 있습니다. 구동 전압냉각 팬 모터는 정확히 펄스 폭 변조 (PWM)에 의해 제어된다 s는.
- 야생형 E. 일련의 준비 600에서 광학 밀도를 갖는 대장균 시료는 일반적으로 0.07에서 교정 0.3 nm의 범위. 테스트 E. 배치 배양 병에 대장균 샘플과 검출기 전압을 기록한다.
- 장소 ~ 100 플레이트 판독기에서 동일한 샘플 ㎕의 광학 밀도를 기록한다. 검량선을 플롯 광학 밀도 데이터 대 전압 검출기를 사용한다. 일반적으로, 광학 밀도의 1 단위 변화가 여기에 사용되는 바이어스 방식과 광 검출기에서 ~ 7.6 V 변화에 대응합니다.
2. Morbidostat 실행
- 데일리 실험을 시작하기 전에 준비
- 입구 부에서와 같이 장치를 형성하기 위해 내경이 1/32 인치 외부 직경 3/32 인치 세 울트라 화학성 타이곤 호스와 배양 병을 준비1.1 및 보충 그림 1인치
- M9 최소 배지 (0.2 % 포도당) 및 트리 메소 프림 (TMP) 약물 함유 배지를 준비합니다. 121 ℃에서 오토 클레이브 배지, 배지 병, 약물 매체 병, 폐기물 용기 및 배양 병을 소독.
주 : TMP 나중에 표 1의 농도 및 배지를 함유하는 약물 TMP가 멸균되지을 달성하기 위해 사용되는 원액이다.
- Morbidostat 실행
- 실험 첫날, 냉동 야생형 1 ml의 E. 해동 실온 전송 함유 배양 병에 120 μL 세포에서 5 분간 콜라이 MG1655 ~ M9 세포 성장 배지 12 mL로. 1 일 이후에, 냉동 E. 1 ㎖를 해동 대장균 5 분 및 전송이 포함 된 새로운 문화 유리 병에 세포 120 μL의 전날 셀 ~ M9 성장 배지 12 ml를.
- 진탕 배양기를 켜고 템피을 설정 전혀 흔들림 30 ° C에 rature.
- 마이크로 펌프, 자기 교반 장치 및 광학 밀도 측정 켜서 morbidostat 동작을 시작한다.
주 : 동작 동안, 임계 값 피드백 알고리즘은 약물 주입을 제어하기 위해 사용된다. 측정 된 광학 밀도가 미리 설정된 임계 값을 초과 할 경우, 약물 주입 펌프를 턴온 될 것이고, 매체 펌프가 턴 오프된다. 그렇지 않으면, 약물 주입 펌프는 꺼진 상태로 유지하고, 매체 펌프가 켜져 있습니다. - 미생물 성장이 있는지 확인하기 위해 수시로 전압을 모니터한다.
참고 : 때문에 동결 및 해동주기, E.의 대장균 세포는 매일의 성장시 ~ 4 시간의 지연을 나타낸다. - ~ 23 시간 후, 그것의 공급 전압을 해제하여 마이크로 펌프를 중지하고 문화 유리 병을 꺼내. 문화 유리 병에 15 % 글리세롤을 추가하고 저장을 위해 -80 ° C에서 샘플을 동결.
- 반복 2.2.5에 2.2.1 단계를 반복합니다.
주 : 항생제 내성 수준을 결정하기 위해 96 웰 포맷 플레이트 리더에서 성장 속도 측정을 수행한다.
- 실온에서 5 분 동안 매일 샘플을 냉동 및 해동 ~ 15ml의 M9 배지를 함유하는 바이알에 배양 세포의 15 μl를 옮긴다. 그들을 ~ 0.1에 도달 내지 600 nm에서의 광학 밀도까지 성장 할 수 있습니다. 1 ㎖의 병에 15 mL로 분할하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 원하는 약물 농도를 얻기 위해,이 단계에서 TMP 약물을 추가한다.
- 플레이트 리더에서 잘 각으로 단계 3.1과 장소에서 샘플 200 μl를 가지고 그들을 12 시간 5 성장할 수 있습니다. 파장 600 nm에서의 광학 밀도를 측정하는 동안 자동으로 기록된다.
주 : 각 데이터 포인트에 대해, 삼중 측정 기록 된 데이터의 일관성을 보장하기 위해 평균화된다. 시간에 대한 광학 밀도의 데이터는 수 bE는 성장 속도를 얻기 위해 사용된다. - IC (50)를 획득하기 위해 상기 약물 농도 대 성장 속도 데이터를 플롯. IC (50) 성장 속도가 최대 성장 속도 (5)의 50 %가되는 약물 농도로서 정의된다합니다.
미세 유체 장치 4. 단일 세포 형태와 항생제 감수성 측정
- 다른 곳에서 15 설명한 바와 같이 PDMS에서 다층 소프트 리소그래피를 통해 미세 유체 장치의 제조를 수행합니다.
- 제어 및 흐름 층의 포토 레지스트 몰드를 만들기 위해 포토 리소그래피를 사용합니다. 제어 층에 베어 실리콘 웨이퍼 상에 몰드를 생산하는 네가티브 포토 레지스트 (~ 15㎛의 높이) 및 포지티브 레지스트 (~ 8 ㎛의 높이)를 사용할 수 있습니다.
- 각각의 제어 층과 유동 층, 1 : 1 내지 20 : 5의 비율 가교와 PDMS 혼합물을 준비한다. 모든 거품을 제거하기 위해 진공하에 데시 케이 터에 혼합물을 넣어1 시간 동안.
- (TMCS) 증기 트리메틸 위해 실리콘 웨이퍼 상에 포토 레지스트 층 제어 금형 노출. PDMS의 혼합물을 캐스팅하여 ~ 6mm 두께의 제어 층을 (가교 비율 5 : 1) 제어 층의 포토 리지 스트 몰드에 실리콘 웨이퍼. 오븐에서 1 시간 동안 80 ° C에서 40 분 동안 제어 층을 굽는다.
- (1, 회전 속도가 60 초 동안 3,000 RPM 가교 율 20)와 유동 층 포토 리지 스트 몰드에 PDMS 혼합물을 스핀 코팅에 의해 유동 층을 만든다. 오븐에서 1 시간 동안 80 ° C에서 30 분 동안 유동 층을 굽는다.
- 원하는 칩 사이즈로 제어 층 (통상 3cm X 2cm)을 절단 수동 제어 층을 박리 면도날을 사용한다. 유동 층의 상부에 상기 제어 층을 올려 놓고 입체 현미경을 정렬. 오븐 하룻밤에 80 ° C에서 정렬 된 어셈블리를 치료. 그 후, 잔류 TMCS을 용해하는 5 시간 동안 플라스틱 용기에 탈 이온수 250 ㎖에 조립체를 침지.
- 이어서, 20 G 바늘 유입 구멍을 펀치 (PDMS 간 비율이 5 링크 : 회전 속도 2000 rpm으로 30 초를 들면, 1) 빈 PDMS 층으로 코팅 된 유리 슬라이드를 엘라스토머 전체 접합 40 초에서 공기 플라즈마 처리하여 1.2 토르 공기압.
- PDMS의 세포 독성 효과를 감소시키기 위해 80 ℃에서 36 시간 동안 광범위한 베이킹을 수행. 이러한 베이킹 단계는 상기 세균 세포에 독성을 최소화하는 것이 중요합니다.
- 칩 성장 실험에
- 미세 유체 장치에 넣기 전에 1 시간 동안 1 시간과 M9 매체에 대한 탈 이온수로 세척합니다.
- 실온에서 5 분 동안 매일 샘플을 동결 해동 신선한 M9 배지로 새로운 시험관에 접종. 하룻밤 37 ℃에서 진탕 배양기에서 샘플을 놓습니다.
- M9 매체와 미생물 샘플 10 배 희석하고 5 psi에서 미생물 시료 용기를 압박하여 미세 유체 장치에로드합니다. 그런 다음 TMP 약물을로드5 psi에서 약물 매체 컨테이너를 압박하여 칩에 매체. 15 분 동안 마이크로 유체 칩에 두 개의 챔버 사이에 마이크로 기계식 밸브를 작동하여 미생물 및 약물의 혼합을 실행합니다.
- 거꾸로 현미경에 장착 된 현미경 인큐베이터에있는 마이크로 유체 칩을 놓습니다. CCD 카메라와 8 시간마다 시간이 도립 현미경에 장착 된 성장 챔버 내의 셀 화상을 취득.
- 셀의 영상 데이터 (18)상의 임계 알고리즘을 통하여 세포 수를 계산하기 위해 사용자 정의 프로그램 스크립트를 사용한다. 셀 번호 데이터는 일반적으로 위에 세 미세 유체 챔버 평균을합니다.
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Representative Results
상술 morbidostat은도 1에 도식화한다. 실험 진화 항생제 감수성 시험 및 세포 형태 검사를 포함하는 일반적인 동작을 morbidostat, E.에서 검증 된 (TMP) trimethoprim을 노출 대장균 MG1655 문화, 일반적으로 사용되는 항생제 약물 5,6. TMP는 약물 내성이 매우 독특한 단계적 증가를 유도하고, 돌연변이 디 하이드로 리덕 타제 (DHFR) 유전자 클러스터를 해결한다. 따라서, TMP는 morbidostat 동작을 검증하기위한 매우 효과적인 표준 약물이다. 매일, 상기 미생물은 소정의 광학 밀도가 임계치를 초과하여 증가하고도 2a에 도시 된 바와 같이, 약물 주입을 유발하는 것으로 예상된다. 약물 주입 성장을 억제 할 것으로 예상 결과, 광학 밀도가 감소된다. 몇몇 시험 런은 최적의 약물 농도를 결정하기 위해 필요할 수있다. 엄지 손가락의 규칙으로, 우리는 increasE로 약물 매체의 농도, 약물 매체 성장을 억제하는 것이 실패 찾은 후 5 배. 실험 전체 과정 후, 매일 샘플을 냉동 및 해동 IC (50), 약제 내성 수준의 정량적 측정 값을 결정하기 위해 사용된다. 도 2b에 플롯은 항생제 약물 저항의 일시적인 증가를 보여줍니다. 약물 저항은 1,500 배 정도 증가에 ~ 1,000 μg의 / ㎖ 이상 ~ 12 실험실 진화 5 이전의 연구 결과와 일치 일, 임상 19을 분리합니다. 마지막 날 돌연변이의 DHFR의 점 돌연변이는 생거 시퀀싱에 의해 측정하고, 표 2에 열거되어있다. 하나의 돌연변이가 프로모터 영역에 위치한 프로모터 영역의 단일 점 돌연변이가 크게 DHFR의 발현 수준을 변경할 수 있음을 나타낸다 발견 효소 20. 위치 49910에서 또 다른 돌연변이 DHFR의 유전자 영역에 위치하고 행위에 가깝습니다DHFR의 필자 사이트 (21) 효소. 한천 플레이트를 포함하는 약물의 선택은 오직 하나의 돌연변이를 부여하는 경향으로 다수의 돌연변이와 약제 내성의 인수는 morbidostat의 유용성을 증명한다.
세포 형태를 더 민감 판독 같이, 항생제 감수성 단일 세포 형태 검사가 병렬로 수행되는, 다중 마이크로 유체 플랫폼 (14).도 3은 다중 마이크로 유체 칩의 디자인을 도시한다. 세균 세포의 현미경 사진 (그림 5) TMP의 하위 억제 농도에 따라 형태를 모두 야생형의 변화와 돌연변이 균주를 알 수있다. 돌연변이 균주는 유의 한 filamentation을 보여줍니다 동안 야생형 균주는 상당한 filamentation을 보여줍니다. 단일 세포 수준에서의 형태 변화는 항생제 내성의 신속한 진단에 사용될 수있다. (4)에 표시 치 도표TMP의 다양한 농도에서 페이지의 성장 곡선. 돌연변이 샘플 항생제 저항의 상당한 증가를 나타낸다. 도 4 온칩 성장 데이터는도 2b에 표시된 플레이트 판독기에서 IC 50 값과 일치한다.
그림 1. morbidostat의 설계도 morbidostat은 미생물 집단의 광학 밀도를 측정하고, 따라서 약물의 농도를 조절하는 연속 배양 장치이다. 이 장치는 약물 주입 모드와 약물 희석 모드에서 실행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 성장 곡선 및 항생제 저항성 수준의 증가 피드백에서 (a) 대표 성장 곡선.. 미생물 성장은 그 주입 임계 값 알고리즘에 의해 트리거되는 항생제에 의해 억제된다. 양의 증가 속도가 미리 설정된 임계치 이상의 광학 농도 (OD TH = 0.086)를 제기 할 때, 약물 주입 모드로 전환 장치. 그렇지 않으면, 장치는 약 희석 모드에서 실행. 빨간색과 보라색 화살표는 각각 약물 주사 및 약물 희석 모드로 전환 나타냅니다. (b) 노출 trimethoprim을 12 일 동안 셀 저항 레벨. 이 IC (50)는 항생제 약물 내성의 별개의 단계적 증가를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 세포 형태 및 온 - 칩 항생제 감수성 조사를위한 미세 유체 장치 칩 레이아웃 (가) 현미경 사진.. 녹색 및 청색 구획 각각 성장 및 약물 배지 챔버, 그리고 적색 레이아웃 제어 계층을 나타낸다. 성장 챔버의 크기는 450 μm의 (난) 400 μm의 (w)는 8 μm의 (시간을) X X입니다. 성장 챔버 균로드와 약물 챔버는 TMP로 로딩된다. 스케일 바는 1cm입니다. (b) 동일한 칩의 뷰를 확대. 스케일 바 = 500 μm의. (다) 전 양원의보기를 확대하고 혼합 한 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4 : E.의 온 - 칩 성장 곡선 (a) 야생형 선조 균주 및 (일 12시) (b) 돌연변이 균주 : 대장균 TMP의 다양한 농도에 노출. 돌연변이 샘플은 항생제 약물 저항의 상당한 증가를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 단일 세포 형태 학적 (A - D) TMP의 서브 억제 수준의 치료 후 셀의 밝은 필드 이미지. (d 돌연변이의 부재에서 야생형 세포의 상당한 filamentation (b)를 참고 (전자 - h를) (- D A)의 디지털화 된 이미지입니다. 모든 세균 이미지가 40X 배율 목적으로 CCD 카메라에 의해 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 :. 치수 및 문화 유리 병 홀더의 조립 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 :. LED와 광 검출기의 회로도 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
부가 코드 :. 미세 유체 칩에서 얻은 세포 이미지에서 세포 수를 계산하는 사용자 정의 스크립트 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 견본 | TMP 약물 (μg의 / ㎖) | |||||||||||
| 하루 1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 이 | 4 | 8 | (16) | (32) | |
| 4 일 | 0 | 1 | 이 | 삼 | (5) | (10) | (20) | (40) | (80) | (160) | (320) | |
| 하루 5-7 | 0 | 이 | 4 | 8 | <TD> (15)(30) | (60) | (120) | (240) | 480 | 960 | ||
| 하루 8 ~ 12 | 0 | 삼 | (7) | (15) | (30) | (60) | (125) | (250) | (500) | 1,000 | 2,000 | |
표 1. μg의 / ㎖ 단위로 측정 플레이트 판독기 약물 농도에 IC (50)를 결정하는 데 사용 약물 농도는 매일 냉동 샘플에 대해 표시된다. 세포가 높은 약품 내성을 같이 사용 된 약물 농도는 그에 따라 증가한다.
| 아니 | 위치 | SNP | 노트 |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 이 | 49910 | T->를 | DHFR 유전자 |
| 삼 | 49795 | C-> T | DHFR 프로모터 |
표 2. 생거 시퀀싱에 의해 식별 DHFR 변이 대표적인 시퀀스 데이터는 마지막 날 돌연변이 (12 일)의 3 DHFR 점 돌연변이를 나타낸다. 프로모터 유전자 영역은 각각 하나와 2 개의 SNP를 포함한다. PCR을에 사용되는 순방향 및 역방향 프라이머 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 '와 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'이었다.
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Discussion
저가의 구성 요소에서 낮은 풋 프린트 morbidostat 장치가 설명된다. 장치 등록 약제 내성 수준의 증가는 이전보고 5의 것과 일치한다. 약물 내성의 진화 연구를 위해 설계된 장치는 다른 많은 실험에 잠재적으로 적용 할 수있다. 첫째, 약물 - 유도 된 돌연변이의 광범위한 데이터베이스 임상 적 항생제의 큰 세트에 설정 될 수있다. 예를 들어 다제 내성의 진화 경로 단순히 실험에 사용 된 약물의 수를 증가시킴으로써 조사 될 수있다. 여기에보고 모듈의 주요 장점은 다양한 실험 조건 하에서 대규모 병렬 실험 있도록 유연한 구성 가능성이다.
개념은 마이크로 유체 측정에서 설명되었다하더라도, 조사 파워는 유체 기술은 마이크로 유체 (23)를 결합함으로써 개선 될 수있다. 당 비용측정 (규모의 경제)이 극적으로 감소 시약 소비 감소 노동에 의해 감소된다. 여기서, 하나의 세포 형태 데이터는 미세 유체 플랫폼으로부터 추출 될 수있다. 최근에, 단셀의 미세 형태 테스트가 성공적 미생물학 임상 실험실에서 구현되었으며, 표준 직렬 국물 희석 시험 (24)에 상대적으로 행한다. 미세 유체 장치의 가용성 증가, 결합 기술은 대규모 높은 처리량 실험실 진화 실험을 가능하게한다.
몇 가지 단계는 morbidostat을 실행하는 것이 중요하다. 자기 교반 장치는 자석과 냉각 팬으로 형성되어 있기 때문에, 우선, 그 배양 병에 대한 팬의 축 정렬하기 위해 매우 중요하다. 또한, 배양 바이알과 자석 사이의 간격은 안정된 동작을 보장하는 것이 매우 중요하다. 둘째, 매일의 실험의 시작 부분에서 새로운 문화 바이알로 전환하는 것도 중요하다생물막 형성을 피할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 생물막 형성은 2 ~ 3 일 이내에 발생할 수 있습니다. 셋째, 때문에 E. 대장균 시료 일관성을 보장하기 위해 매일의 실험 기간 동안 고정 된 샘플 매일 해동, 상기 미생물로부터 총 세탁을 방지하기 위해 적어도 4 시간의 지연 시간을 설정하는 것이 중요하다. 또한, 하나는 E.을 동결하지 않도록 선택할 수 있습니다 직접 대장균 샘플과 새로운 문화를 시작하는 새로운 문화의 병을 접종 샘플을 사용합니다.
실제적인 세팅에서, 현재의 시스템 설계는 잠재적 용도를 확장하는 여러 한계를 극복해야한다. 전체 시스템의 부피가 현재 하루 소비 매체에 의해 제한된다 (chemostatic 동작 동안, 하나의 배양 바이알은 0.33 시간 -1의 전형적인 희석율에서 하루 중 약 0.5 L를 소비한다). 작업 부피를 줄이기 위해 더욱 최적화 plumbi와 약물 억제 인구 역학 조심 시뮬레이션에 의해 달성 될 수있다NG 25 매개 변수.
마지막 morbidostat 세균 배양 실험 광범위한 분야에 쉽게 적용된다. 예를 들면, 발광 다이오드를 부착함으로써, 시스템은 박테리아 또는 미세 조류 (26)의 진화 모니터링을 가능하게하는 광 생물 반응기로서 재구성 될 수있다. 모듈은 무선 배터리 팩 장치를 조작하여 흡착제로 기밀 용기에서 혐기성 및 호기성 배양을 확장 할 수있다. 다른 예로서, 독소의 농도는 서서히 목표 화학적 27 내성 균주 엔지니어 증가 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
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