Abstract
Descriviamo un basso costo, morbidostat configurabile per caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici. Il morbidostat è un dispositivo di coltura batterica che controlla continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di farmaco di sfidare costantemente i batteri si evolvono per acquisire resistenza ai farmaci. Il dispositivo è dotato di un volume di lavoro di ~ 10 ml ed è completamente automatizzato e dotato di misura della densità ottica e micro-pompe per medio e la somministrazione di farmaci. Per convalidare la piattaforma, abbiamo misurato l'acquisizione graduale della resistenza trimetoprim in Escherichia coli MG 1655, e integrato il dispositivo con una piattaforma microfluidica multiplex per indagare la morfologia cellulare e sensibilità agli antibiotici. L'approccio può essere up-scalata a studi di laboratorio di resistenza ai farmaci antibiotici, ed è estendibile a adattivo evoluzione per i miglioramenti di deformazione in ingegneria metabolica e altri esperimenti di coltura batterica.
Introduction
Dal momento che l'introduzione del primo penicillina antibiotico, microbica resistenza agli antibiotici è trasformata in un problema di salute globale 1. Sebbene l'acquisizione di resistenza agli antibiotici può essere studiato retrospettivamente in vivo, le condizioni di questi esperimenti sono spesso non controllati durante l'intera evoluzione 2. In alternativa, adaptive evoluzione di laboratorio può rivelare l'evoluzione molecolare di una specie microbiche sotto stress ambientali o pressione selettiva da un farmaco antibiotico 3. Recentemente, molti esperimenti evolutivi ben controllati di resistenza ai farmaci antibiotici hanno chiarito la comparsa di resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, il gruppo di Austin ha dimostrato rapido emergere in un microfluidica correttamente progettato ambiente compartimenti 4. Il morbidostat recentemente sviluppato induce mutazioni sistematiche sotto farmaco pressione selettiva 5,6. Il morbidostat, un Selec microbicaDispositivo zione che regola continuamente la concentrazione di antibiotico per mantenere una popolazione quasi costante, è un importante progresso dal test di fluttuazione utilizzato in microbiologia 7,8. Nel test di fluttuazione, un antibiotico viene iniettato ad alta concentrazione, ei mutanti sopravvissuti sono schermate e contati. Invece, i microbi in un morbidostat sono costantemente in discussione e acquisiscono mutazioni multiple.
Il morbidostat funziona in modo simile al chemostat, un dispositivo di cultura inventato da Novick e Szliard nel 1950 che mantiene una popolazione costante fornendo continuamente nutrienti mentre diluendo la popolazione microbica 9. Fin dalla sua introduzione, il chemostat è stata avanzata e migliorata. Attuali chemostati microfluidica hanno raggiunto capacità nanolitri e unicellulari. Tuttavia, questi dispositivi non sono adatti per esperimenti evoluzione adattativa, che richiedono una grande popolazione di cellule con molti eventi mutazione 10,11. Recentemente, mini-chemostati con volumi di lavoro del ~ 10 ml sono stati sviluppati per colmare il divario tra bioreattori scala litri e la microfluidica chemostat 12,13.
Qui vi presentiamo la progettazione e l'utilizzo di un basso costo, morbidostat automatizzato per uno studio della resistenza ai farmaci antibiotici. Il modulo proposto può essere impiegato in un incubatore shaker in un laboratorio di microbiologia con requisiti hardware minimi. Il firmware open-source è anche facilmente su misura per applicazioni specifiche di evoluzione adattativa, come l'ingegneria metabolica 3. Infine, il morbidostat è integrato in una piattaforma microfluidica multiplato per i test di suscettibilità antibiotica 14.
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Protocol
1. Montaggio e Pretesting del dispositivo Morbidostat
- Assemblea della Morbidostat
- Punzone 3 fori sul tappo del flacone di coltura con una siringa 18 G. Tagliare tre pezzi di tubo di polietilene ~ 7 cm di lunghezza. Inserire questi tre pezzi di tubo di polietilene sul tappo.
- Utilizzare nastro per avvolgere il bordo della calotta per servire come il cast per la miscela polidimetilsilossano (PDMS). Miscelare 5 g di un componente e 0,5 g di componente B dei PDMS in un contenitore di plastica 150 ml agitando manualmente con uno stuzzicadenti. Caricare il composto in una siringa da 10 ml.
- Versare il composto PDMS sul tappo con la siringa. Cuocere tutto il tappo per curare il PDMS per 8 ore in forno a 70 ° C.
- Saldare l'anodo LED con il filo calibro 24 e catodo LED con il resistore carbonio con un saldatore. Saldare una resistenza di 680 Ω carbonio con un filo di 24 g. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante.
- Cosìlder collettore del fotorivelatore con il filo 24 G e l'emettitore del fotorivelatore con una resistenza di carbonio 100 k. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante.
- Posizionare il diodo emettitore di luce nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema del circuito di Figura integrativa 2, collegare il diodo emettitore di luce e potenza con una alimentazione di 5 V. Assicurarsi che il LED funziona utilizzando una fotocamera digitale in grado di rilevare IR (ad esempio, una fotocamera del cellulare).
- Posizionare il fotorivelatore nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema circuitale di figura integrativa 2, collegare il fotorivelatore e potenza con una alimentazione di 5 V. Collegare il filo su entrambi i lati dei resistori fotorivelatori per misurare la tensione attraverso la scheda elettronica di controllo.
- Colla un magnete sull'albero della ventola di raffreddamento, che serve come unità di agitatore magnetico. Si noti che il alignment dell'albero del ventilatore alla fiala coltura, e la distanza tra il flaconcino coltura e il magnete è molto critico per il corretto funzionamento dell'unità agitazione magnetica.
- Collegare ogni pezzo di tubo in polietilene del flaconcino cultura nel corrispondente pezzo di tubo in silicone per le micro-pompe, bottiglie medie, e di scarto. Accendere la pompa per 1 ora e misurare il volume totale pompato dalla bottiglia mezzo al flaconcino coltura per determinare la velocità della pompa. Notare che la velocità di pompaggio tipica dovrebbe essere ~ 4 ml / hr, che corrisponde al grado di diluizione D = 0.33 h -1 per 12 ml di volume del flacone coltura lavorativi.
- Mettere il tutto in una di medie dimensioni (34 cm x 34 cm x 43,5 centimetri) agitatore incubatore.
- Pretesting il Morbidostat
- Imposta la tensione di alimentazione del ventilatore freddo a 5 V per iniziare il suo motore di testare la barra di agitazione magnetica. Si noti che l'azione di agitazione può essere ispezionato visivamente. La tensione che guidanos il motore della ventola di raffreddamento è controllato con precisione da modulazione di larghezza di impulso (PWM).
- Preparare una serie di wild type E. campioni coli con densità ottica a 600 nm in genere vanno 0,07-0,3 per la calibrazione. Posizionare un test E. campione coli nella fiala cultura e registrare la tensione cellula fotoelettrica.
- Inserire ~ 100 microlitri dello stesso campione nel lettore di piastre e registrare la densità ottica. Utilizzare la tensione fotorilevatore contro i dati della densità ottica per tracciare la curva di calibrazione. Si noti che in genere, una variazione unitaria di densità ottica corrisponde a ~ 7,6 V cambiamento nella cellula fotoelettrica con lo schema di polarizzazione usato qui.
2. L'esecuzione del Morbidostat
- Preparazione Prima di iniziare l'esperimento giornaliera
- Preparare la fiala cultura con tre resistenti tubi ultra-chimici TYGON con diametro interno 1/32 pollici e diametro esterno 3/32 di pollice per ingressi per formare il dispositivo come nella sezione1.1 e nella Figura 1 supplementare.
- Preparare il supporto M9 minima (0,2% di glucosio) e trimetoprim (TMP) farmaco contenente mezzo. Sterilizzare il mezzo, la bottiglia mezzo, la bottiglia mezzo droga, la bottiglia degli scarti e la fiala coltura in autoclave a 121 ° C.
NOTA: Il TMP è una soluzione madre che viene utilizzato per realizzare successivamente le concentrazioni in tabella 1 e il farmaco contenente TMP mezzo non è autoclave.
- Esecuzione del Morbidostat
- Il primo giorno dell'esperimento, scongelare 1 ml di tipo selvaggio congelato E. cellule coli MG1655 per 5 min a temperatura ambiente e trasferimento 120 ml di cellule al flacone di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9. Dopo il primo giorno, scongelare 1 ml di E. congelati coli cellule dal giorno precedente per 5 minuti e il trasferimento 120 ml di cellule ad una nuova fiala di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9.
- Accendere l'incubatore shaker e impostare la tempe ratura di 30 ° C senza agitazione.
- Avviare l'operazione morbidostat accendendo la micro-pompa, l'unità di agitazione magnetica, e la misurazione della densità ottica.
NOTA: Durante il funzionamento, un algoritmo di soglia di feedback è utilizzato per controllare l'iniezione di droga. Quando la densità ottica misurata supera una soglia prefissata, la pompa di iniezione farmaco potrebbe essere attivata e la pompa mezzo verrebbe disattivata. Altrimenti, la pompa di iniezione di droga rimane spento e la pompa del mezzo è acceso. - Monitorare la tensione di volta in volta a garantire il crescita microbica.
Nota: A causa del gelo e disgelo, E. coli cellule mostrano un ritardo di ~ 4 ore durante la crescita di ogni giorno. - Dopo ~ 23 ore, fermare la micro-pompa disattivando la sua tensione di alimentazione ed estrarre la fiala cultura. Aggiungere 15% glicerolo nel flaconcino coltura e congelare il campione a -80 ° C per la conservazione.
- Ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5.
NOTA: Eseguire la misurazione tasso di crescita in un lettore di piastre con un formato ben 96 per determinare il livello di resistenza agli antibiotici.
- Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e trasferire 15 microlitri della cella alla fiala di coltura contenente ~ 15 ml M9 medie. Consentire loro di crescere fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge ~ 0.1. Dividere i 15 ml in 1 ml flaconi e aggiungere il farmaco TMP in questa fase per ottenere le concentrazioni di farmaco desiderati come mostrato nella Tabella 1.
- Prendete 200 ml di campione dal punto 3.1 e il luogo in ciascun bene nel lettore di piastre e permettere loro di crescere per 12 ore 5. La densità ottica alla lunghezza d'onda di 600 nm viene registrato automaticamente durante la misurazione.
NOTA: Per ogni punto di dati, le misurazioni triplice copia sono registrati e una media per garantire la coerenza dei dati. I dati sulla densità ottica in funzione del tempo può be utilizzato per ottenere il tasso di crescita. - Tracciare i dati tasso di crescita rispetto al concentrazione di farmaco per ottenere IC50. Notare che IC 50 è definita come la concentrazione di farmaco in cui la velocità di crescita è il cinquanta per cento del tasso di crescita massimo 5.
4. Single Cell Morfologia ed un antibiotico suscettibilità di misura in dispositivi microfluidici
- Eseguire la fabbricazione dei dispositivi microfluidici tramite litografia soft multistrato da PDMS come descritto altrove 15.
- Utilizzare fotolitografia per fare lo stampo photoresist per gli strati di controllo e di flusso. Si noti che per il livello di controllo, utilizzare fotoresist negativo (~ 15 micron altezza) e photoresist positivo (~ 8 micron altezza) per produrre uno stampo su un wafer di silicio nudo.
- Preparare miscele PDMS con rapporti reticolazione 5: 1 e 20: 1 per il livello di controllo e lo strato flusso rispettivamente. Mettere le miscele in un essiccatore sotto vuoto per eliminare eventuali bolle, Per 1 ora.
- Esporre i controllo stampi strato di resina fotosensibile su wafer di silicio per trimetilclorosilano (TMCS) vapore. Rendere il livello di controllo dello spessore ~ 6 mm con colata la miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 5: 1) sul wafer di silicio sullo stampo di controllo strato di resina fotosensibile. Cuocere il livello di controllo per 40 min a 80 ° C per 1 ora in forno.
- Rendere lo strato flusso mediante centrifuga rivestendo una miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 20: 1, velocità di centrifuga 3000 rpm per 60 sec) su uno stampo photoresist strato di flusso. Cuocere il livello di flusso per 30 min a 80 ° C per 1 ora in forno.
- Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il livello di controllo nella dimensione del chip desiderato (in genere tre centimetri x 2 cm) e staccare manualmente il livello di controllo. Posizionare il livello di controllo sulla parte superiore dello strato flusso e allinearli allo stereomicroscopio. Curare il gruppo allineato a 80 ° C nella notte forno. Successivamente, immergere l'assemblaggio in 250 ml di acqua deionizzata in un contenitore di plastica per 5 ore per sciogliere il residuo TMCS.
- Successivamente, perforare i fori di ingresso con 20 aghi G e legare l'intera elastomero su un vetrino rivestito con uno strato PDMS vuoto (PDMS reticolazione rapporto 5: 1, velocità di centrifuga di 2000 rpm per 30 sec) mediante trattamento plasma ad aria per 40 sec a 1.2 pressione dell'aria Torr.
- Effettuare vasta cottura per 36 ore a 80 ° C per ridurre gli effetti citotossici di PDMS. Si noti che questa fase di cottura è fondamentale per minimizzare la tossicità per le cellule batteriche.
- On Chip crescita Experiment
- Prima di caricare nel dispositivo microfluidica, lavare con acqua deionizzata per 1 ora e mezzo di M9 per 1 ora.
- Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e inoculare una nuova provetta con terreno M9 fresco. Trasferire il campione in un incubatore shaker a 37 ° C durante la notte.
- Diluire il microbica campione di 10 volte con media M9 e caricarlo nel dispositivo microfluidica facendo pressioni il contenitore del campione microbica a 5 psi. Quindi caricare il farmaco TMPmedio nel chip facendo pressioni contenitore mezzo farmaco a 5 psi. Eseguire la miscelazione tra microbi e droga azionando la valvola micromeccanico tra le due camere sul chip microfluidico per 15 min.
- Posizionare il chip microfluidico nell'incubatore microscopio montato sul microscopio invertito. Acquisire l'immagine cellule nella camera di crescita ogni ora per 8 ore con la camera CCD montata sul microscopio invertito.
- Utilizzare lo script programma personalizzato per calcolare i numeri di cellulare attraverso un algoritmo di soglia sui dati di immagine cellule 18. Si noti che i dati numerici delle cellule sono in media in genere oltre tre camere microfluidica.
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Representative Results
Il morbidostat sopra descritto è schematizzato in Figura 1. Le operazioni morbidostat comuni, tra evoluzione sperimentale, test di sensibilità agli antibiotici e controllo della morfologia cellulare, sono stati convalidati in E. cultura coli MG1655 esposti a trimetoprim (TMP), un antibiotico comunemente usato 5,6. TMP induce molto particolari graduali aumenti di resistenza ai farmaci, e le mutazioni sono raggruppati intorno al gene diidrofolato reduttasi (DHFR). Pertanto, TMP è un farmaco standard altamente efficace per convalidare l'operazione morbidostat. Ogni giorno, il microbo è destinato a crescere sopra della soglia di densità ottica preselezione e comandare l'iniezione di droga, come mostrato in Figura 2a. L'iniezione farmaco dovrebbe inibire la crescita e, di conseguenza, ridurre la densità ottica. Diverse corse di prova possono essere necessari per determinare la concentrazione ottimale di droga. Come regola generale, si increase la concentrazione del mezzo di droga da 5-piega avendo constatato che il mezzo farmaco non riesce a sopprimere la crescita. Dopo l'intero corso dell'esperimento, campioni congelati giornalieri vengono scongelati e utilizzati per determinare IC 50, una misura quantitativa del livello di resistenza ai farmaci. La trama in Figura 2b mostra l'aumento temporale nella resistenza ai farmaci antibiotici. La resistenza ai farmaci è aumentato di circa 1.500 volte per ~ 1.000 mg / ml sopra ~ 12 giorni, in linea con i precedenti risultati in laboratorio evoluzione 5 e gli isolati clinici 19. Le mutazioni puntiformi DHFR nell'ultimo giorno mutante sono state misurate mediante sequenziamento Sanger e sono elencati nella Tabella 2. Una mutazione è trovato trova sulla regione promotore e indica che singola mutazione puntiforme nella regione del promotore può cambiare significativamente il livello di espressione della DHFR enzimi 20. Un'altra mutazione nella posizione 49.910 si trova nella regione del gene del DHFR ed è vicino a l'attoive sito della DHFR enzima 21. L'acquisizione di resistenza ai farmaci con mutazioni multiple dimostra l'utilità del morbidostat, come la selezione sul farmaco contenente piastra di agar tende a conferire solo la singola mutazione.
Come una lettura più sensibile della morfologia cellulare, il controllo della morfologia cella singola con sensibilità agli antibiotici viene effettuata in parallelo, multiplato piattaforma microfluidica 14. La Figura 3 mostra la struttura del chip microfluidico multiplato. Micrografie delle cellule batteriche (Figura 5) rivelano cambiamenti morfologia sia wild type e mutanti sotto concentrazioni sub-inibitorio di TMP. Tipo ceppi selvatici mostrano una significativa filamentazione mentre il ceppo mutante mostra alcun filamentazione significativo. Questo cambiamento morfologia a livello di singola cellula può essere utilizzato nella diagnosi rapida della resistenza agli antibiotici. Figura 4 mostra la on-chicurve di crescita p a varie concentrazioni di TMP. Il campione mutante mostra un aumento significativo nella resistenza ai farmaci antibiotici. I dati di crescita on-chip in figura 4 è anche coerente con il valore IC50 dal lettore di piastre mostrata nella Figura 2b.
Figura 1:. Schematica della morbidostat Il morbidostat è un dispositivo coltura continua che misura la densità ottica della popolazione microbica, e quindi regola la concentrazione di farmaco. L'apparecchio funziona in modalità modalità di droga-iniezione e droga di diluizione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curva crescita e l'aumento del livello di resistenza ai farmaci antibiotici (a) curva di crescita Rappresentante sotto feedback.. La crescita microbica è inibita dal farmaco antibiotico, la cui iniezione è innescata da un algoritmo di soglia. Quando il tasso di crescita positivo solleva la densità ottica di sopra della soglia prefissata (OD TH = 0,086), il dispositivo passa alla modalità di droga-iniezione. In caso contrario, il dispositivo viene eseguito in modalità di droga-diluizione. Frecce rosse e viola indicano il passaggio in modalità di iniezione di droga e di diluizione della droga, rispettivamente. (B) il livello di resistenza delle cellule durante 12 giorni di esposizione al trimetoprim. L'IC 50 mostra un netto aumento graduale della resistenza ai farmaci antibiotici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: dispositivi microfluidici per indagare morfologia cellulare e on-chip sensibilità agli antibiotici (a) Micrografia del layout chip.. scomparti verde e blu sono le camere di crescita e medie di droga, rispettivamente, e il layout rosso denota il livello di controllo. Le dimensioni della camera di crescita sono 450 micron (l) x 400 micron (w) x 8 micron (h). La camera di crescita è caricato con i batteri, e la camera farmaco viene caricato con TMP. Barra di scala è 1 cm. (B) vista lo stesso chip ingrandita. Barra di scala = 500 micron. (C) ingrandita vista di entrambe le camere prima e dopo la miscelazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4: on-chip curve di crescita di E. coli esposta a varie concentrazioni di TMP: (a) il ceppo selvatico ancestrale e (b) ceppo mutante (a giorno 12). Il campione mutante mostra un significativo aumento della resistenza ai farmaci antibiotici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Single-cell morfologie (A - d) immagini in campo chiaro del cellulare dopo trattamento con livelli sub-inibitorio di TMP. Notare la filamentazione significativa delle cellule wild type in (b), che è assente nei mutanti (d (e - h) sono immagini digitalizzate di (a - d). Tutte le immagini batteriche sono state scattate da una telecamera CCD con un obiettivo di ingrandimento 40X. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare:. Le dimensioni e il montaggio del porta cultura flacone Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura integrativa 2:. Lo schema elettrico per il LED e un fotodetettore Cliccate qui per scaricare questo file.
Codice supplementare:. script personalizzato per contare il numero di cellule dalle immagini acquisite dalle cellule chip microfluidica Cliccate qui per scaricare questo file.
| Campione | TMP farmaco (mg / ml) | |||||||||||
| giorno 1-3 | 0 | 0.06 | 0,12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| 4 ° giorno | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| giorno 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| giorno 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1.000 | 2.000 | |
Tabella 1:. La concentrazione del farmaco utilizzato per determinare IC 50 in concentrazioni farmacologiche plate reader misura in unità di g / ml vengono visualizzati per il campione surgelato giornaliera. Come le cellule si sviluppano maggiore resistenza ai farmaci, le concentrazioni di farmaco utilizzati sono aumentati di conseguenza.
| No | luogo | SNP | Nota |
| 1 | 49.894 | C-> T | |
| 2 | 49.910 | T-> A | gene DHFR |
| 3 | 49.795 | C-> T | DHFR promotore |
Tabella 2:. Mutation in DHFR individuato da Sanger sequenziamento I dati di sequenza rappresentativi mostrano le tre mutazioni puntiformi DHFR nell'ultimo giorno mutante (giorno 12). Le regioni promotrici e geni contengono uno e 2 SNP, rispettivamente. I primer avanti e inversa utilizzato nel PCR erano 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'e 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
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Discussion
Un dispositivo morbidostat a basso impatto da componenti a basso costo è dimostrata. Gli aumenti di livello resistenza ai farmaci registrati dal dispositivo sono coerenti con quelli di precedenti rapporti di 5. Progettato per gli studi evolutivi di resistenza ai farmaci, il dispositivo è potenzialmente applicabile a molti altri esperimenti. In primo luogo, un database completo di mutazioni indotte da farmaci può essere stabilita per un ampio insieme di antibiotici clinicamente rilevanti. Ad esempio, il percorso evolutivo della resistenza multifarmaco può essere studiato semplicemente aumentando il numero di farmaci usati nell'esperimento. Il vantaggio principale del modulo qui riportato è la configurabilità flessibile, consentendo larga scala, esperimenti paralleli in diverse condizioni sperimentali.
Anche se il concetto è stato dimostrato nelle misure microfluidica, la potenza di indagine può essere migliorata combinando microfluidica con tecnologia fluidica 23. Il costo permisura (economia di scala) è drasticamente ridotto consumo di reagente abbassata e manodopera ridotta. Qui, i dati singola morfologia delle cellule possono essere estratte dalla piattaforma microfluidica. Recentemente, microfluidica test morfologia delle singole cellule è stata implementata con successo nei laboratori di microbiologia clinica, ed esegue paragonabile a brodo standard di test di diluizione in serie 24. Con la crescente disponibilità di dispositivi microfluidici, tecnologie combinate consentiranno di grandi dimensioni, high-throughput esperimenti di laboratorio evoluzione.
Diversi passaggi sono fondamentali per eseguire il morbidostat. In primo luogo, perché l'unità agitazione magnetica è formato da magneti e una ventola di raffreddamento, è fondamentale per allineare l'albero della ventola al flaconcino cultura. Inoltre, la distanza tra il flaconcino coltura e il magnete è molto critica per garantire un funzionamento stabile. In secondo luogo, il passaggio a una nuova fiala coltura all'inizio dell'esperimento ogni giorno è anche importanteevitare la formazione di biofilm. Altrimenti, la formazione di biofilm può avvenire entro 2 o 3 giorni. In terzo luogo, perché E. campioni coli sono scongelati tutti i giorni da un campione congelato durante l'esperimento di ogni giorno per garantire la coerenza, è importante impostare un periodo di ritardo di almeno 4 ore per evitare un lavaggio totale di microbi. In alternativa, si può scegliere di non congelare E. campioni coli e utilizzare direttamente il campione per inoculare un nuovo flacone cultura per iniziare una nuova cultura.
In un ambiente pratico, il design attuale sistema deve superare diverse limitazioni di estendere i suoi potenziali usi. Il volume di tutto il sistema è attualmente limitata dal mezzo consumata al giorno (durante il funzionamento chemostatic, un flaconcino cultura consuma circa 0,5 L di terreno al giorno al tasso di diluizione tipica di 0.33 ore -1). Per ridurre il volume di lavoro, un'ulteriore ottimizzazione può essere ottenuto attraverso un'accurata simulazione dinamica della popolazione droga inibito con Plumbing parametri 25.
Infine, il morbidostat è facilmente adattabile ad una vasta gamma di esperimenti di coltura batterica. Ad esempio, collegando un diodo che emette luce, il sistema può essere riconfigurato come fotobioreattore, consentendo il monitoraggio evolutivo di cianobatteri o microalghe 26. Il modulo può essere esteso a anaerobica e la coltivazione microaerobica in un contenitore a tenuta di gas con adsorbenti dal wireless funzionamento del dispositivo in una batteria. Come altro esempio, la concentrazione di una tossina potrebbe essere aumentata gradualmente per ingegnere ceppi resistenti alla chimica di destinazione 27.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
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