Summary
この記事では、グリア単層の上に反転したカバーガラス上で成長する低密度初代海馬神経細胞を培養するためのプロトコルを記述しています。ニューロンとグリアの層は、パラフィンワックスビーズで分離されています。この方法によって成長させた神経細胞は、高分解能光学イメージングおよび機能アッセイに適しています。
Abstract
文化の中で、個々の神経細胞の構造と生理をプローブする能力は、神経生物学の研究に不可欠である、そして個々のセルまたは定義されたネットワークの遺伝的および化学的操作の柔軟性が可能になります。無傷の脳組織と比較した場合、操作のような容易さは減少培養系で簡単です。これらの一次ニューロンの単離および増殖のための多くの方法が存在するが、それぞれが独自の制限を有します。このプロトコルは、次に、グリア細胞の単層上に懸架されたガラスカバースリップ上に低密度および高純度齧歯類胚の海馬ニューロンを培養するための方法を記載しています。根底にあるグリア単層からの栄養支持を可能にしながらこの「サンドイッチ文化は」ニューロンの人口の排他的な長期的成長が可能になります。ニューロンは十分な年齢や成熟度レベルである場合、ニューロンカバースリップは、グリア皿のアウト反転及びイメージング又は機能的アッセイに使用することができます。ニューロングラムこの方法によるrownは、典型的には、数週間のために生き残るためには、大規模なアーバー、シナプス結合、およびネットワークプロパティを開発しています。
Introduction
脳は、神経細胞の複雑なネットワークに編成されます。ネットワークアクティビティと脳機能への個々のニューロンの寄与は、それらの分子組成およびそれらの生理学的特性の摂動を選択的に変更することによって研究することができます。個々の神経細胞の遺伝的および化学的操作は、後者の細胞の不均一性と複雑さによって邪魔されない、完全な脳組織よりも培養ニューロンで間違いなく簡単です。培養中のニューロンは、明確に定義された軸索及び樹状アーバを開発し、互いに広範囲シナプス結合を形成します。
成体動物から、または神経系の他の領域からニューロン培養は可能であるが、胚海馬培養物は、しばしば、それらの定義された錐体細胞集団と比較的低いグリア密度1,2に好ましいです。培養物中の低密度で成長させた海馬神経細胞は、特にAMEあります細胞内局在、タンパク質輸送、神経細胞の極性とシナプスの開発の研究にNABLE。培養中のニューロンはまた、広範囲シナプス可塑3、4、5、6分子プロセスを研究に使用されてきました。出生後生存しないグローバルな遺伝的欠失を有するマウスからの神経細胞培養物は、特定の遺伝子7の細胞とシナプスの役割を研究する際に特に有用でした。
脳のように、培養海馬神経細胞はグリア細胞からの栄養支持に依存しています。これは、彼らの文化を複雑にし、このサポートが供給されることにより、いくつかの異なる方法の開発につながっています。 1つの一般的に使用される方法は、グリア細胞8の単層上に直接ニューロンをメッキ、又は取得したヒップから汚染グリア細胞を許すことを含みますocampal組織が増殖し、ニューロン9の下の単層を形成します。この方法はある程度の成功を発見したが、得られた神経細胞培養物の不純物は、画像化実験のために不利です。ニューロン培養物の別の一般的に使用される方法は、完全グリアフィーダー層を、除外し、代わりに定義された成長媒体10の形態の栄養サポートを提供することです。
ここでは、「サンドイッチ」またはニューロン文化2、11の「バンカー」の方法について説明します。この方法は、次いで、パラフィンワックスビーズにより分離グリア細胞の単層上に懸架されたガラスカバースリップ上の海馬ニューロンをめっきすることを含みます。これは、基礎となるグリア単層からの栄養支持を可能にしながらグリアを汚染することなく、ニューロンの均一な集団の長期培養を容易にします。ニューロンは十分な年齢や成熟度レベルである場合には、ニューロンカバースリップは、グリア皿のアウト反転及びイメージング又は機能的アッセイに使用することができます。
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Protocol
全ての実験と実験動物を使用したプロトコルは、マニトバ大学の動物倫理委員会によって承認され、動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに準拠してありました。
楽器、バッファーおよび溶液の調製
- すべての解剖器具、ガラスパスツールピペット、ピペットチップ、フィルタ装置、及び脱イオン水をオートクレーブで滅菌します。
- 脱イオン水及びフィルター滅菌でストックグルコース溶液; 20％（1.1 M W / V）を調製します。 4°Cで保存。
- 脱イオン水中の100mMのピルビン酸ナトリウム溶液を調製し、フィルタ - 滅菌。 4°Cで保存。
- 脱イオン水中で10％HBSS（10X）、10mMのHEPES、100 U / mLペニシリン - ストレプトマイシンの溶液を作ることによって、カルシウム及びマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（CMF-HBSS）を準備。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で保存してください。
- 、CMF-HBSS中10mg / mLのデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼ）を調製そして、その後のフィルター滅菌し、-20℃で保存。
- （無菌溶液から）30 mMグルコースの溶液を作ることによってグリア培地を調製、95 U / mLのペニシリン - ストレプトマイシン、および最小必須培地（MEM）で10〜15％ウシ増殖血清（BGS）。
注：プロトコルに示されているように必要に応じて、5％BGSの溶液は、細胞増殖を遅くするために使用することができます。ウマ血清ではなく、BGSの使用が、各バッチが原因バッチ間変動に使用する前にテストしなければならないことに注意することができます。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で調製した溶液を保管してください。多くの研究室は、FBSを使用していますが、我々は一貫してBGSにおけるグリア成長がFBSほど堅牢であることを観察しました。 BGSは、化学的に定義されたコンポーネントで補足されたウシ胎児血清由来です。また、BGSは、FBSよりも実質的に経済的です。 - 1×B27サプリメントの溶液を作ることによって、ニューロンの成長および維持培地（神経基礎-B27、NBG）を準備した500mLたNeurobasalメディで0.5mMのL-グルタミンええと。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で保存してください。 L-グルタミンは、成長培地中でより安定であることが示唆されているのGlutaMAXで置換することができます。
- MEMに（滅菌溶液から）30 mMグルコース（滅菌溶液から）、1mMピルビン酸ナトリウム、および10％BGSの溶液を作ることによって媒体メッキニューロンを準備します。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で保存してください。
- 1mMのシタラビン（ARA-C）の溶液を調製し、フィルタ - 滅菌。 -20℃で1mlの部分にアリコートとストア。
- 100 MNフィルター滅菌NaOH中の100mM APVの溶液を調製します。 -20℃で保管してください。
- ホウ酸緩衝液、pH 8.5（50 mMのホウ酸及び12ミリモルのホウ砂）とフィルター滅菌中1mg / mLのポリ-L-リジンを溶解します。 -20℃で小分けして保存。代わりに、ポリ-L-リジン、一方が細胞に対して低毒性であってもよいポリ-L-オルニチンを使用することができます。
2.グリア文化の準備
- 皮質アストログリア細胞培養物を準備します
- 70％エタノールで子犬をスプレーし、それらを刎ねます。
- 15 mLのCMF-HBSSを含有する氷上で100mmの皿に頭部を置き。
- 、頭皮を切断する頭蓋骨を開いて、脳幹を切断し、次いで3mLのCMF-HBSSを含有する氷上で60 ム・ペトリ皿に脳を転送することにより、各脳を解剖。
- 海馬から大脳半球を分離し、それらを囲む髄膜を剥ぎ取ります。髄膜線維芽細胞からの最小限の汚染を確実にするために、適切な予防措置を行使する。文化の中で髄膜線維芽細胞は、成長のためのグリアと競合し、ニューロンの健康のために有害となる可能性があります。 5mLのCMF-HBSSを含有する氷上で60 ム・ペトリ皿内のすべての大脳半球を収集します。
- CMF-HBSSを除去した後、マイクロ切開バネはさみを用いて細かくできるだけ収集皮質組織をミンチ。
- チョップに十分なCMF-HBSSを追加PED組織。ガラスパスツールピペットを使用して、15mLのチューブに組織片を移します。 CMF-HBSSを添加することによって12mLの総容積をもたらします。
- 1.5ミリリットルを2.5％トリプシンおよび10mg / mLのDNase溶液の各々を加えます。 12分間水浴中で37℃で得られた混合物をインキュベートします。
- ガラスパスツールピペットを用いて組織を10〜15回トリチュレートし、そしてさらに3分間37℃の水浴中でインキュベートします。
- BGSの5 mLを含む50 mLチューブにレンズ紙またはフィルターメッシュを通して上澄みを濾過します。これは、解離していない組織の塊を取り除くために行われます。また、市販の細胞ストレーナーを使用しています。
- 残りの組織片を含むチューブにCMF-HBSS、2.5％トリプシンの1.5 mLの13.5 mLを加え、さらに追加の10分間、水浴中で37°Cでそれをインキュベートします。
- もう一度、残りの組織をトリチュレートし、次いで初期ろ液を含む50 mLチューブに再び懸濁液をフィルタリングします。次に、すすぎルBGSの3mlでNS紙。最終容積は、約38ミリリットルであるべきです。
- 遠心分離機130×gで6分間解離グリア細胞を含む懸濁液。慎重にガラスパスツールピペットを用いて上清を捨てます。底にペレット化した細胞が乱されていないことを確認してください。ペレットの下部には、血液成分を含むやや赤みがかっを表示されます。
- ペレットの赤みがかった部分を乱さないように注意しながら、新しいチューブにグリア培地1mL中のグリア細胞を移します。
- グリア細胞を解離合成再懸濁する子犬あたりグリア培地2 mlまで加えます。例えば、もし10匹の仔を使用した後、総再懸濁体積を20mLあろう。
- 子犬あたり1 75cm 2の細胞培養フラスコを準備します。各フラスコに18mLの予め温めグリア培地を加えます。
- 各フラスコに移し、細胞懸濁液の2mLのを、37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートします。
- 1日後、20 mLのグリアmに置き換えますedium。この段階で、培養は、グリアおよび他の望ましくない細胞型の混合物です。
- 四日間細胞を播種した後、精力的に非アストロサイト細胞を取り除くために、フラスコを振ります。これを行うために、CMF-HBSSで一回フラスコをすすぎ、そして次に各フラスコに10mLの新鮮CMF-HBSSを加えます。精力的に5-10回フラスコを振って、その後、CMF-HBSSを吸引します。 CMF-HBSSで二回すすぎ、その後、20 mLのにグリアメディアを追加します。
注：この手順は、非標的細胞型の除去を確実にするために重要であり、そして所望のアストロサイトの損失をもたらすべきではありません。 - 細胞がコンフルエント（ 図1）になるまで週に2回、新鮮なグリア培地で置き換えます。
- 凍結グリア
- 培養物を合流された後、培地をオフに吸引し、10mLのCMF-HBSSで細胞単層を洗浄します。
- 各フラスコに0.25％トリプシン/ EDTAの10 mLを加え、3分間37℃でインキュベートします。
- 細胞を取り除くために、優しくフラスコをタップします。 1 mLのBGSトンを追加各フラスコOおよび15mLのチューブに細胞懸濁液を転送します。
- 6分間、130×gでチューブを遠心します。得られた上清を捨てます。
- 2mLのグリア培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
- グリア凍結培地（1部のジメチルスルホキシド、4-部品BGS）を準備。フラスコ当たり4つの極低温バイアルの各々にこの溶液0.5mlを加えます。
- 各バイアルに細胞懸濁液0.5mLのを転送し、その後、一晩-80℃の冷凍庫に断熱容器内にバイアルを配置することによって、ゆっくりと細胞を凍結します。 1日後、長期保存のために液体窒素冷凍庫にバイアルを移します。
- めっきは、グリアを復活させました
- プレートグリアニューロン文化の日の前に1〜2週間。
- mLのグリア培地を温め10と50 mLのチューブを準備します。
- 2-3分間37℃の水浴中でグリアの1つの凍結バイアルを解凍します。
- 10mLのグリア細胞培地を含む50 mLチューブにバイアルの内容物を移します。
- 遠心機上清オフ130 XG及び吸引で5分間の電子管。
- 20mLのグリア培地中でペレットを再懸濁。
- 培養皿（60ミリメートル）のそれぞれに3 mLの新鮮グリア培地を追加し、各ディッシュに細胞懸濁液1mlを転送します。 37°C、5％CO 2インキュベーター内で培養物をインキュベートします。
- 週2回の細胞を養います。細胞密度がニューロン培養日前にウェル50％コンフルエンスに達した場合、グリア成長速度を遅くするBGS 5％グリア培地に切り替えます。 70％ - ニューロン培養グリア単層の所望の合流は50％です。
- 1~2日ニューロン培養前NBG培地でグリア培地（6ミリリットル/皿）を置き換えます。
3.カバースリップの調製
- クリーニングとパラフィンビーズの調製
- 濃硝酸（70％重量/重量;注意：非常に腐食性）でカバースリップを水没し、室温で30分間、それらを超音波処理します。他の研究室がfを持っていますoundそれは有益代わりに室温で12〜24時間セラミックラックに70％硝酸中にカバースリップをインキュベートします。
- 注意深く機関のガイドラインに従った指定化学換気フード中の硝酸を破棄する。脱イオン水でカバーグラスに3-5回すすいでください。
- （別の方法を以下の場合はスキップ）を脱イオン水でカバースリップを沈め、30分間再度超音波処理。
- 脱イオン水を除去し、カバーグラスに別の3回すすいでください。
- 50 mLの脱イオン水でカバースリップを水没し、オートクレーブでそれらを滅菌します。あるいは、6時間オーブン中で225°Cでカバースリップを滅菌します。この代替アプローチを使用している場合は、3.1.9に進みます。
- オートクレーブ後、次のステップのための滅菌層流フードにカバースリップを転送します。
- 脱イオン水を除去し、100％エタノール20~30 mLでリンス。
- 100％エタノールの20〜30ミリリットルを追加し、カバースリップを転送し、100ミリメートルペトリ皿にエタノール。
- 次いで、60 ム・ペトリ皿、皿当たり4-5カバーガラス、及びそれらを空気乾燥皿の縁に対して、カバースリップを傾倒することによってできるようにカバースリップを転送するために鈍いピンセットを使用します。エタノールが蒸発した後、表面上に平らにカバーグラスを置きます。
- 適切な耐熱ガラスボトルに10gのパラフィンを転送します。パラフィンを溶融し、少なくとも1時間、ホットプレート上で約150〜200℃でそれを維持します。パラフィンを加熱すべき理想的な温度は、いくつかの調整がかかる場合があります。非理想的な温度は、パラフィンビーズの正しいサイズを生産する難しさにつながることができます。溶融後の待機期間は、液体全体に一貫した温度を確保するのに役立ちます。
- パラフィンにパスツールピペットを浸し、次いで急速に各カバースリップの縁の近くに3つのスポット（各スポットは離れて約120°である）にそれをタッチ。滴は約0.3〜0.5ミリメートル、高ビーズとDIAMで1.0〜2.0ミリメートルに凝固しますETERは、カバースリップ上のニューロンおよびグリア以下単層（ 図2）との間に空間を提供するように機能すると。
- 30分間UV光下でディッシュを滅菌し、次いで室温でアルミ箔とストアとそれらをカバー。準備されたカバーガラスを保存し、1ヶ月までのために使用することができます。パラフィンビーズは使用前に少なくとも1週間カバーグラスに付着させるべきです。これは、プロトコルの残りのステップの間に離脱からパラフィンを防ぐことができます。
- ポリ-L-リジンでコーティングしたカバー
- パラフィンビーズと先に調製したカバースリップを含むペトリ皿を取得します。
- 各カバーグラスの表面にホウ酸緩衝液中のポリ-L-リジンの200μLを加え、溶液を室温で、カバーされ、一晩カバースリップ上に座ってみましょう。コートパラフィンビーズが配置されているものと同じ表面。適切に洗浄あれば、ポリ-L-リジンが容易に拡散する必要があることに注意してくださいカバーグラスの表面を覆います。
- 1日後、2時間毎時間の滅菌脱イオン水に浸漬することによって二回カバースリップを洗浄します。最終洗浄後、皿当たり神経メッキ培地4mLで水を置き換えます。ポリ-L-リジンで被覆された後、カバーガラスの表面を乾燥させないことが重要であることに留意されたいです。
- 37°C、5％CO 2インキュベーター中でカバースリップを含有する皿を置き。コーティングされたカバースリップは、ニューロン培養前に少なくとも24時間インキュベートされるべきです。これは、神経細胞培養のためのプライム中に行われます。
海馬やメッキニューロンの4解剖
- （膣プラグ発見の日から測定して胚日18-19、）妊娠中のラットを入手し、イソフルラン麻酔断頭またはその他の承認された方法で安楽死させます。
- 70％エタノールでラットの下面をスプレーし、次いで、陰部THROから切開部を作ります腹腔の最後にぐふ。汚染を避けるために、唯一のこの段階で皮膚を切断するように注意してください。
- 70％エタノールで再び切開器具をすすぎ、次いで子宮を露出するために腹壁を通って切断します。 2つの子宮角を取り出し、滅菌100ミリメートルペトリ皿に置きます。
- 層流フードの残りのステップを実行します。胎児の周囲の子宮膜を削除します。それらを斬ると20mLのCMF-HBSSを含む100mMペトリ皿に頭部を置きます。
- 脳を解剖し、直ちに氷上に2 mLのCMF-HBSSを含む60ミリメートルペトリ皿に置きます。次のステップのための十分なスペースを確保するために皿当たりのみ2-3の脳を収集します。
- 解剖顕微鏡下で大脳半球の正中線から髄膜を取り去り、その後、海馬を解剖し、4.5 mLのCMF-HBSSを含む60ミリメートルペトリ皿に置きます。海馬は、三日月形STRUCとして区別することができることに注意してください皮質半球の内側表面にTURE、そしてそれは、心室によって横方向縁取られているように除去が容易です。
- 15 mLチューブに回収した海馬組織およびCMF-HBSSを転送します。 2.5％トリプシンの0.5 mLを加え、次いで37℃で10分間インキュベートします。それは緩やかで、歩留まりを向上させる可能性があるため、パパインの代わりに、トリプシンを用いてもよいです。
- 穏やかにチューブの底に平静海馬組織を残し、パスツールピペットによりトリプシン溶液を除去します。
- 5分間37°Cでそれをインキュベートしながら穏やかに5 mLのCMF-HBSSで二回組織を洗浄します。第二の洗浄後、組織にCMF-HBSSの十分な量を添加することにより、少なくとも5 mLに総体積をもたらします。 10匹の以上の仔から海馬がある場合、最大8 mLのCMF-HBSSを添加することができます。
- 組織解離のためにファイアーポリッシュピペットの二つの変種を準備します。一の変形の先端がピペットの通常の直径が、火仕上げ平滑エッジにあります。他のバリアリは半分に減少し、先端径を有するものです。簡潔には火炎源に斜めガラスパスツールピペットの先端を露出させ、その後、ピペットの先端を調べます。
- 先端エッジが平滑化された、または直径が減少されるまで、この手順を繰り返します。組織がこれらの細胞に損傷を与えることなく、単一の細胞を得るために解離されていることを確認するのに理想的な直径を見つけるために実践することが重要です。
- 滑らかなエッジの通常のガラスパスツールピペットを介して約10回通過することにより、第1の海馬組織をトリチュレートし、その後減少した直径を有するピペットを介して10のパスにさらに5。目標はないか非常に少数の組織塊と細胞の均一な溶液を得ることです。
- 血球計数器または自動セルカウンターを用いて細胞密度を決定します。 2つの半球から海馬を組み合わせた場合、典型的には、子犬あたり080万1.0個の細胞が得られます。
- 皿に細胞懸濁液の十分な量を転送します60mmディッシュ30万個の細胞のプレーティング密度を得るために、培地をメッキ4 mLのポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップを含みます。細胞の密度は、意図される実験に応じて、100,000〜500,000で変化し得ます。
- 3~4時間後、NBG培地中のグリア細胞を含む皿に付着ニューロンとカバースリップを転送します。これは、ニューロンを播種した側は、グリア細胞の層に向かって下向きにされるように行われるべきです。グリア皿当たり4-5カバースリップの合計を追加します。
- 二、三日、メッキ後、グリア増殖を阻止するために皿当たり5μMの最終濃度にアラCのソリューションを追加します。
- 各給で新鮮な培地の2.5mLの古い培地2mlを置き換えることによって、週に一度細胞を養います。加え余分な媒体は、経時的蒸発を補償することで、媒体の一部のみが、グリア細胞によって培地の一貫したコンディショニングを確保するために変更されます。これらの培養物は、典型的には、少なくとも1ヶ月間、健康です（図3）。ニューロンの生存は、100μMの最終濃度まで培地にAPVを添加することによって改善することができます。 APVは、NMDA受容体拮抗薬であり、グルタミン酸興奮毒性を減少させることによって生存を促進します。
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Representative Results
初代神経細胞培養物のこの「サンドイッチ」法では、海馬ニューロン（ 図3）は、パラフィンビーズ（ 図2）により分離グリア細胞（ 図1）のベッドの上で成長します。これは、ニューロンが選択的に最小限のグリア細胞の汚染をカバーガラス上で増殖するが、組織培養皿上で成長しているグリア細胞から十分な栄養サポートを受けることを保証します。典型的には、ニューロンは> 3週間の培養で維持し、それぞれ、それらの典型的なデホスホ-tauおよびMAP2免疫染色によって同定よく発達軸索および樹状突起との広範なarborisation、（ 図4）を開発することができます。成熟した神経細胞は、これらの区画に後シナプスマーカーDrebrin1の選択的局在化によって識別されるシナプス棘を開発します。これらのシナプス棘は密接にシナプス小胞マーカーシナプシン免疫染色により識別されシナプス前の専門分野に並置されています。ザ・シナプス前および後のサイトの近接はよく発達し、正しく整列シナプスを示します。これらの一次ニューロンは、ニューロンとシナプスの機能と構造研究のために適しています。これらには、シグナル伝達、神経細胞極性、細胞内の人身売買やシナプスの発達と可塑性の研究が、これらに限定されません。
グリア培養の図1.位相差画像は、凍結グリア在庫からメッキした後、1日7日、または14日に撮影しました。スケールバー、500μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
カバースリップのpreparの図2高解像度の画像パラフィンビーズとエド。 （A、B）正常の例としては、パラフィンビーズを適用しました。 （C、D）が誤って適用されるパラフィンビーズの例。 α：複数のビーズは、同じ場所で適用しました。 β：ビーズは適切にカバースリップの上に位置することに失敗しました。 χ：ビーズは、カバースリップの中心部に近すぎる適用しました。 δ：ビーズが高すぎました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
培養中の一次ニューロンの発達段階の3位相コントラスト画像を図。スケールバーは100μm。 目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図です。
図in vitroで 17日間で一次ニューロンの4免疫蛍光画像。ニューロンを12分間、PBS中の4％ホルムアルデヒド、4％スクロースで固定し、次いで5分間、0.25％トリトンX-100で透過処理しました。 30分間、PBS中10％BSAでブロッキングした後、ニューロンをPBS中の3％BSAで適用した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートしました。次のように一次抗体を使用した：抗シナプシンI（ウサギ、1：2,000）、抗ドレブリン（マウスIgG1、1：8、クローンM2F6、ハイブリドーマ上清）、抗MAP2（ニワトリポリクローナルIgYを、1：5000）、および抗タウ-1（マウスIgG2aを、1：2,000、クローンPC1C6、脱リン酸化タウを認識する）。次いで、細胞をPBSで洗浄し、37℃で1時間、PBS中の3％BSAで適切な種またはアイソタイプ特異的二次抗体と共にインキュベートしました。使用した二次抗体は、FOLの通りでした。安値：アレクサ488結合抗マウスIgG2a（1：500）、アレクサ568結合抗ウサギ（1：500）、アレクサ647結合抗マウスIgG1（1：500）、およびAMCA結合抗ニワトリアイジワイ（ロバIgGを、1：200）。示されるように、スケールバーは10μmと2.5μmで、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
神経細胞を培養する「サンドイッチ」法は他の場所2、11、よく説明してきたが、それを採用したい研究者のための欲求不満につながることができ、テキストだけで説明するのは非常に困難なプロトコルを通して、いくつかのステップがあります。
グリア培養、カバースリップ調製ニューロン培養および維持：この方法は、3つの広いワークフローに分割することができます。 3つの製剤のそれぞれは、高品質のニューロン培養物のために重要であり、いくつかの重要な考慮事項は念頭に置いておく必要があります。ニューロンをメッキする前に、グリアフィーダー層は、理想的にはアストロサイトの均一な集団であるべきで、50から70パーセントの合流点の間にあります。これは、グリアフィーダー層から十分な栄養支持を確実にするでしょう。アストログリア文化はATTAC緩くしている他の細胞型、特にミクログリア、最小限の汚染を持っていることを確認することが重要ですHEDと丸みを帯びた細胞。ニューロンの健康と生存12に有害であるミクログリアサイトカインを放出します。血清、ウマ血清またはウシ成長血清のいずれかは、ロットごとに変動することができます。血清のいくつかの多くの慎重なスクリーニングは、特定のロットを使用することを決定する前に実行する必要があります。
カバースリップの準備は、もう一つの重要なステップです。ガラスの品質及びその清掃に使用されるプロトコルは、健全なよく発達した神経細胞のために重要です。この方法は、新たに研究室で採用されている場合、それはいくつかの業者からカバーガラスをテストする価値があるだろう。他のものは超音波処理でのみ1時間そうしながら、カバーガラスの洗浄のために、いくつかの研究室は、18〜36時間70％硝酸中にカバースリップを浸します。きれいなカバースリップの重要な基準は、ポリ-L-リジン水溶液が表面に均一に広げるべきであるということです。もう一つの重要な考慮事項は、カバーグラスに適用されるパラフィンワックスビーズが適切な高さでなければならないということで、プロトコールに概説されるように、直径とは、右の温度に加熱します。
ニューロンを得るために、海馬は胎生17-19ラットから解剖することができます。この段階での解剖は非常に少数のグリア細胞につながるものの、グリア増殖を培養の2~3日後に抗有糸分裂薬のAra-Cを追加することで逮捕することができます。ファイアーポリッシュピペットチップにより、トリプシン処理海馬組織の粉砕により、細胞自体に損傷を与えることなく、個々の細胞内への組織を分離することが重要です。このプロトコルで使用される神経細胞の成長および維持培地は、神経基礎+ L-グルタミン+ B27サプリメントです。 L-グルタミンは、培養培地中でより安定であるのGlutaMAX、置換されていてもよいです。 B27サプリメントの品質はロットごとに変えることができ、そしてそれは、長期培養のために特定のロットを使用する前にテストする必要があります。 B27の貧しい多くは、神経細胞が凝集することがあります。このようGS21とSM1などの代替製品は、B27のための良い代替品であることが判明しています。媒体の第三は、毎週交換されている、請求週間より長く成長したニューロンは、毎週新鮮な培地を供給しなければなりません。
神経細胞を培養するこの方法は、ほとんど、あるいはまったくグリア汚染との純粋なニューロン集団に依存している実験に非常に貴重な証明することができます。この方法を使用して成長させた低密度ニューロンは、一般的によく発達しアーバー、シナプスの接続とネットワークプロパティで数週間のために生き残ります。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、TJSにCIHRのMOP-142209によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
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- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
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- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
