Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لزراعة منخفض الكثافة الخلايا العصبية الحصين الابتدائية المتزايد على coverslips الزجاج المقلوب على أحادي الطبقة الدبقية. يتم فصل طبقات الخلايا العصبية والدبقية التي كتبها حبات شمع البارافين. الخلايا العصبية التي يزرعها هذه الطريقة هي مناسبة لعالية الدقة التصوير الضوئي والمقايسات الفنية.
Abstract
القدرة على تحقيق هيكل وفسيولوجيا الخلايا العصبية الفردية في الثقافة أمر بالغ الأهمية لدراسة بيولوجيا الأعصاب، ويسمح للمرونة في التلاعب الجيني والكيميائي للخلايا فردية أو شبكات محددة. بهذه السهولة التلاعب أبسط في نظام الثقافة انخفاض بالمقارنة مع أنسجة الدماغ سليمة. بينما العديد من الأساليب لعزل ونمو هذه الخلايا العصبية الأولية موجودة، كل له حدوده الخاصة. يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة منخفض الكثافة والقوارض عالية النقاء الخلايا العصبية الجنينية الحصين coverslips على الزجاج، والتي يتم بعد ذلك علقت اكثر من أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية. هذه "الثقافة شطيرة" تسمح للنمو على المدى الطويل الحصري لعدد السكان من الخلايا العصبية في حين يسمح للحصول على الدعم الغذائي من أحادي الطبقة الدبقية الأساسية. عندما الخلايا العصبية هي من العمر ما يكفي أو مستوى النضج، لل coverslips الخلايا العصبية يمكن أن انقلبت التدريجي من الطبق الدبقية والمستخدمة في التصوير أو المقايسات الفنية. الخلايا العصبية زrown بهذه الطريقة البقاء على قيد الحياة عادة لعدة أسابيع وتطوير العرش واسعة، اتصالات متشابك، وخصائص الشبكة.
Introduction
وينظم الدماغ في شبكات معقدة من الخلايا العصبية. مساهمة من الخلايا العصبية الفردية لنشاط الشبكة وظائف المخ يمكن دراستها عن طريق تغيير الانتقائي للتكوينها الجزيئية وperturbance ممتلكاتهم الفسيولوجية. التلاعب الجيني والكيميائية من الخلايا العصبية الفردية أسهل القول في الخلايا العصبية مثقف مما كانت عليه في أنسجة الدماغ سليمة، تعيقها عدم التجانس الخلوية الأخير والتعقيد. الخلايا العصبية في ثقافة تطوير محور عصبي واضحة المعالم والعرش الشجرية وتشكل الاتصالات المشبكية مكثفة مع بعضها البعض.
في حين ثقافة العصبية من الحيوانات البالغة أو من مناطق أخرى من الجهاز العصبي هو ممكن، وكثيرا ما يفضل الثقافات الحصين الجنينية بسبب السكان المحمولة الخاصة بهم محددة هرمي وكثافة منخفضة نسبيا الدبقية 1 و 2. الخلايا العصبية قرن آمون نمت في منخفض الكثافة في الثقافة بشكل خاص آميnable لدراسة توطين التحت خلوية، والاتجار البروتين، والاستقطاب الخلايا العصبية والتنمية المشبك. كما تم توظيف الخلايا العصبية في الثقافة على نطاق واسع في دراسة العمليات الجزيئية في اللدونة متشابك 3، 4، 5، 6. وكانت الاستعدادات ثقافة العصبية من الفئران مع الحذف الجينية العالمية التي لا البقاء على قيد الحياة بعد الولادة مفيدة بشكل خاص في دراسة أدوار الخلوية ومتشابك بعض الجينات 7.
كما هو الحال في الدماغ، الخلايا العصبية الحصين مثقف تعتمد على الدعم الغذائي من الخلايا الدبقية. هذا يعقد ثقافتهم، وأدى إلى تطوير العديد من الطرق المختلفة التي يتم من خلالها توفير هذا الدعم. ويشمل أحد الطريقة المستخدمة عادة طلاء الخلايا العصبية مباشرة على أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية 8، أو السماح للخلايا الدبقية الملوثات من هيب المكتسبةالأنسجة ocampal لتتكاثر وتشكيل أحادي الطبقة تحت الخلايا العصبية 9. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة بعض النجاح، والنجاسة من ثقافة العصبية الناتج هو غير ملائم للتجارب التصوير. آخر الطريقة المستخدمة عادة من ثقافة العصبية ومن المقرر ان يغادر المغادرة وحدة التغذية الدبقية طبقة تماما، وبدلا من تقديم الدعم الغذائي في شكل متوسط النمو المحدد 10.
هنا، نحن تصف "ساندويتش" أو طريقة "بانكر" للثقافة العصبية 2 و 11. يتضمن هذا الأسلوب طلاء الخلايا العصبية قرن آمون coverslips على الزجاج، والتي يتم بعد ذلك علقت اكثر من أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية مفصولة حبات شمع البارافين. وهذا يسهل الثقافة على المدى الطويل من السكان متجانسة من الخلايا العصبية دون تلويث الدبقية في حين يسمح للحصول على الدعم الغذائي من أحادي الطبقة الدبقية الأساسية. عندما الخلايا العصبية هي من العمر ما يكفي أو مستوى النضج،لل coverslips الخلايا العصبية يمكن أن انقلبت التدريجي من الطبق الدبقية وتستخدم في التصوير أو المقايسات الفنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب والبروتوكولات باستخدام حيوانات المختبر من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية جامعة مانيتوبا وكانت متوافقة مع المبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان.
1. إعداد الآلات، المخازن وحلول
- تعقيم بواسطة التعقيم جميع المعدات تشريح، الماصات الزجاج باستور، نصائح ماصة، جهاز التصفية، والماء منزوع الأيونات.
- إعداد 20٪ (ث / ت؛ 1.1 M) حل سهم الجلوكوز في الماء منزوع الأيونات وتصفية تعقيم. تخزينها في 4 ° C.
- يعد حل البيروفات الصوديوم 100 ملم في الماء منزوع الأيونات وتصفية تعقيم. تخزينها في 4 ° C.
- إعداد الكالسيوم والمغنيسيوم خالية هانك المتوازن محلول الملح (CMF-HBSS) بجعل حل 10٪ HBSS (10X)، و 10 ملي HEPES، و 100 U / مل البنسلين ستربتومايسين في الماء منزوع الأيونات. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر.
- إعداد 10 ملغ / مل ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز) في CMF-HBSS،ثم تصفية تعقيم وتخزين في -20 ° C.
- إعداد المتوسطة الدبقية بجعل حل 30 ملي الجلوكوز (من محلول معقم)، 95 U / مل البنسلين ستربتومايسين، و10-15٪ مصل النمو البقري (BGS) في الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM).
ملاحظة: كما هو مبين في البروتوكول، وهو حل من 5٪ BGS يمكن استخدامها إذا لزم الأمر لإبطاء تكاثر الخلايا. حصان المصل يمكن أن تستخدم بدلا من BGS، ولكن لاحظ أن كل دفعة يجب أن يتم اختبار قبل استخدامها نظرا لاختلاف بين دفعة واحدة. تخزين حل استعداد عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر. على الرغم من العديد من المختبرات تستخدم FBS، لاحظنا دائما أن النمو الدبقية في BGS قوي كما هو الحال في FBS. مشتق BGS من مصل العجل الجنين الذي تستكمل مع عناصر محددة كيميائيا. وبالإضافة إلى ذلك، BGS حد كبير أكثر اقتصادا من FBS. - إعداد نمو الخلايا العصبية والمتوسطة الصيانة (neurobasal-B27، NBG) بجعل حل 1X B27 تكملة و 0.5 ملي L-الجلوتامين في 500 مل Neurobasal ميديأم. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر. يمكن أن تكون بديلا L-الجلوتامين مع GlutaMAX، الذي كان قد اقترح أن يكون أكثر استقرارا في متوسط النمو.
- إعداد الخلايا العصبية تصفيح المتوسطة بجعل حل 30 ملي الجلوكوز (من محلول معقم)، 1 ملم البيروفات الصوديوم (من محلول معقم)، و 10٪ BGS في MEM. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر.
- يعد حل من 1 ملم Cytarabine و(آرا-C) ومرشح تعقيم. قسامة 1 مل أجزاء ومخزن في -20 ° C.
- يعد حل من 100 ملي APV في هيدروكسيد الصوديوم فلتر تعقيم-100 مليون. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- حل 1 ملغ / مل بولي-L-يسين في المخزن بورات، ودرجة الحموضة 8.5 (50 ملم حمض البوريك و 12 ملي البوراكس) ومرشح تعقيم. قسامة ومخزن في -20 ° C. بدلا من بولي-L-ليسين، يمكن للمرء استخدام بولي-L-الأورنيثين التي قد تكون أقل سمية للخلايا.
2. إعداد الثقافة الدبقية
- إعداد القشرية زراعة الخلايا دبق نجمي الخلايا
- رش الجراء مع 70٪ من الإيثانول واقطع رؤوسهم.
- وضع رؤساء في صحن 100 ملم على الجليد تحتوي على 15 مل CMF-HBSS.
- تشريح خارج كل الدماغ عن طريق قطع في فروة الرأس، وفتح الجمجمة، قطع جذع الدماغ، ومن ثم نقل الدماغ إلى 60 مم أطباق بتري على الجليد التي تحتوي على 3 مل CMF-HBSS.
- فصل نصفي الكرة المخية من الحصين ومن ثم تجريد بعيدا السحايا المحيطة بهم. ممارسة الاحتياطات الكافية لضمان الحد الأدنى من التلوث من الخلايا الليفية السحائية. الليفية السحائي في الثقافة يمكن أن تتنافس مع الدبقية للنمو ويكون ضارا لصحة الخلايا العصبية. جمع كل نصفي الكرة المخية في 60 مم طبق بيتري على الجليد تحتوي على 5 مل CMF-HBSS.
- إزالة CMF-HBSS ثم تخطر على الأنسجة القشرية التي تم جمعها كما بدقة ممكن باستخدام الربيع مقص تشريح الصغيرة.
- إضافة يكفي CMF-HBSS لفرمالأنسجة PED. باستخدام الزجاج ماصة باستير، ونقل القطع الأنسجة لأنبوب 15 مل. جعل إجمالي حجم 12 مل بإضافة CMF-HBSS.
- إضافة 1.5 مل كل من التربسين 2.5٪ و 10 ملغ / مل حل الدناز. احتضان الخليط الناتج على 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 12 دقيقة.
- يسحن الأنسجة 10-15 مرة باستخدام الزجاج ماصة باستير، وكذلك احتضان في 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 3 دقائق.
- تصفية طاف من خلال العدسة ورق أو شبكة مرشح في أنبوب 50 مل تحتوي على 5 مل من BGS. ويتم ذلك لإزالة أجزاء من الأنسجة undissociated. بدلا من ذلك، استخدم مصافى الخلية متاحة تجاريا.
- إضافة 13.5 مل من CMF-HBSS و 1.5 مل من 2.5٪ التربسين إلى الأنبوب الذي يحتوي على قطع الأنسجة المتبقية وزيادة احتضان أنه عند 37 درجة مئوية في حمام الماء لمدة 10 دقيقة إضافية.
- يسحن الأنسجة المتبقية مرة أخرى، ومن ثم تصفية تعليق مرة أخرى في أنبوب 50 مل تحتوي على الترشيح الأولي. بعد ذلك، شطف جنيهورقة نانوثانية مع 3 مل من BGS. يجب أن يكون الحجم النهائي ما يقرب من 38 مل.
- الطرد المركزي تعليق يحتوي على الخلايا الدبقية فصلها لمدة 6 دقائق في 130 ز س. بعناية تجاهل طاف باستخدام ماصة باستير الزجاج. تأكد من أن الخلايا مكعبات في الجزء السفلي ليست منزعجة. الجزء السفلي من بيليه يبدو المحمر قليلا تحتوي على مكونات الدم.
- نقل الخلايا الدبقية في 1 مل من المتوسط الدبقية في أنبوب جديد، مع الحرص على عدم تعكير صفو جزء المحمر من بيليه.
- تضيف ما يصل الى 2 مل من المتوسط الدبقية في الجرو لإعادة تعليق مجتمعة فصل الخلايا الدبقية. على سبيل المثال، إذا تم استخدام 10 الجراء، ومن ثم إجمالي حجم إعادة تعليق سيكون 20 مل.
- إعداد واحد 75 سم 2 خلية الثقافة قارورة في الجرو. إضافة 18 مل قبل تحسنت المتوسطة الدبقية إلى كل قارورة.
- نقل 2 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
- بعد يوم واحد، مع استبدال 20 مل الدبقية مedium. في هذه المرحلة، والثقافة هي مزيج من الدبقية وغيرها من أنواع الخلايا غير المرغوب فيها.
- بعد أربعة أيام من البذر الخلايا، هزة بقوة القوارير لإزاحة الخلايا غير نجمية. للقيام بذلك، وشطف القوارير مرة واحدة مع CMF-HBSS، ثم قم بإضافة 10 مل الطازجة CMF-HBSS إلى كل قارورة. يهز قوارير بقوة 5-10 مرات، ثم نضح قبالة CMF-HBSS. شطف مرتين مع CMF-HBSS، ثم إضافة 20 مل المتوسطة الدبقية.
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان إزالة أنواع الخلايا غير المستهدفة، ويجب أن لا تؤدي إلى فقدان الخلايا النجمية المطلوب. - استبدال المتوسطة الدبقية الطازج مرتين في الأسبوع حتى الخلايا متموجة (الشكل 1).
- تجميد الدبقية
- بمجرد متموجة الثقافات، ونضح قبالة المتوسطة وغسل أحادي الطبقة الخلية مع 10 مل CMF-HBSS.
- إضافة 10 مل من 0.25٪ التربسين / EDTA لكل قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- قوارير الصنبور بلطف لطرد الخلايا. إضافة 1 مل BGS رس كل قارورة ونقل تعليق خلية في 15 مل أنابيب.
- أنابيب الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف الناتجة عن ذلك.
- إعادة تعليق بيليه خلية في 2 مل المتوسطة الدبقية.
- إعداد المتوسطة تجميد الدبقية (1-جزء ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 4 أجزاء BGS). إضافة 0.5 مل من هذا الحل إلى كل من 4 قوارير المبردة في قارورة.
- نقل 0.5 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة، ثم تجميد الخلايا ببطء عن طريق وضع قارورة في وعاء معزول في الفريزر -80 درجة مئوية خلال الليل. بعد يوم واحد، ونقل قوارير إلى الثلاجة النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
- أحيت الطلاء الدبقية
- الدبقية لوحة قبل اليوم ثقافة العصبية 1-2 أسابيع.
- إعداد أنبوب 50 مل مع 10 مل حرارة متوسطة الدبقية.
- ذوبان الجليد 1 قارورة المجمدة من الدبقية في 37 ° C حمام الماء لمدة 2-3 دقيقة.
- نقل محتويات القارورة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل المتوسطة الدبقية.
- طاردةالبريد الأنبوب لمدة 5 دقائق في 130 x ج ونضح من طاف.
- إعادة تعليق بيليه في 20 مل المتوسطة الدبقية.
- إضافة 3 مل المتوسطة الدبقية جديدة إلى كل من الأطباق الثقافة (60 ملم)، ومن ثم نقل 1 مل من خلية إلى تعليق كل طبق. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
- تغذية الخلايا مرتين في الأسبوع. إذا وصلت كثافة الخلية 50٪ التقاء جيدا قبل اليوم ثقافة العصبية، والتحول إلى المتوسطة الدبقية تحتوي على 5٪ BGS إلى إبطاء معدل النمو الدبقية. التقاء المرجوة من أحادي الطبقة الدبقية للثقافة العصبية بنسبة 50٪ - 70٪.
- استبدال المتوسطة الدبقية مع NBG المتوسطة (6 مل / طبق) قبل 1-2 أيام من ثقافة العصبية.
3. إعداد ساترة
- تنظيف وإعداد الخرز البارافين
- غمر coverslips في حامض النتريك (70٪ وزن / وزن، تنبيه: ضارة للغاية) ويصوتن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وو غيرها من المختبراتس اوند من المفيد لاحتضان coverslips في حمض النيتريك 70٪ في رفوف السيراميك لمدة 12-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة بدلا من ذلك.
- بعناية تجاهل حمض النيتريك في عين غطاء الدخان الكيميائية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. شطف لل coverslips 3-5 مرات بالماء منزوع الأيونات.
- غمر لل coverslips في الماء منزوع الأيونات ويصوتن لهم مرة أخرى لمدة 30 دقيقة (تخطي إذا وفقا للطريقة بديلة).
- إزالة الماء منزوع الأيونات وشطف لل coverslips آخر ثلاث مرات.
- غمر لل coverslips في 50 مل من الماء منزوع الأيونات وتعقيم لهم من قبل التعقيم. بدلا من ذلك، تعقيم لل coverslips في 225 ° C في الفرن لمدة 6 ساعات. في حالة استخدام هذا النهج البديل، انتقل إلى الخطوة 3.1.9.
- مرة واحدة تعقيمها، ونقل لل coverslips إلى غطاء تدفق الصفحي معقمة للخطوات التالية.
- إزالة الماء منزوع الأيونات وشطف مع 20-30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
- إضافة 20-30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ونقل لل coverslips والإيثانول إلى 100 ملم طبق بيتري.
- استخدام ملاقط حادة لنقل coverslips إلى 60 ملم أطباق بتري، 4-5 coverslips في طبق، ثم السماح لهم الهواء الجاف بالانحناء لل coverslips على حافة الطبق. مرة واحدة وقد تبخرت الإيثانول، وضع لل coverslips شقة على السطح.
- نقل 10 غ البارافين لزجاجة مناسبة الزجاج المقاوم للحرارة. إذابة البارافين والحفاظ عليه في حوالي 150-200 ° C على طبق ساخن لمدة 1 ساعة على الأقل. درجة الحرارة المثالية التي يجب أن تكون ساخنة البارافين قد يستغرق بعض التغيير والتبديل. إن درجات الحرارة غير المثالية تؤدي إلى صعوبات في انتاج الحجم الصحيح من الخرز البارافين. فترة الانتظار بعد ذوبان تساعد على ضمان درجة حرارة ثابتة طوال السائل.
- تراجع ماصة باستور في البارافين، ثم سرعان ما مسها إلى ثلاث مناطق قرب حافة كل ساترة (كل بقعة يجري ما يقرب من 120 درجة على حدة). فإن قطرات يصلب في الخرز حوالي 0.3-0.5 ملم عالية و1،0-2،0 مم بقطرالعطر وسوف تعمل لتوفير مساحة بين الخلايا العصبية على ساترة وأحادي الطبقة الدبقية أدناه (الشكل 2).
- تعقيم الأطباق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، ثم تغطيتها بورق الألمنيوم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. coverslips مستعدة يمكن تخزينها واستخدامها لمدة تصل إلى شهر واحد. ينبغي أن يسمح الخرز البارافين التمسك لل coverslips لمدة أسبوع على الأقل قبل الاستخدام. وهذا سيمنع البارافين من فصل خلال الخطوات المتبقية من البروتوكول.
- Coverslips مع طلاء بولي-L-ليسين
- الحصول على أطباق بتري تحتوي معدة مسبقا coverslips مع الخرز البارافين.
- إضافة 200 ميكرولتر من بولي-L-يسين في المخزن بورات على سطح كل ساترة والسماح للحل الجلوس على لل coverslips بين عشية وضحاها، وتغطيتها، في درجة حرارة الغرفة. معطف السطح نفسه باسم واحد التي تقع الخرز البارافين. لاحظ أنه إذا تنظيفها بشكل صحيح، بولي-L-يسين أن ينتشر بسهولةلتغطية سطح ساترة.
- بعد يوم واحد، وغسل لل coverslips مرتين عن طريق نقع في الماء منزوع الأيونات معقمة لمدة 2 ساعة في كل مرة. بعد غسل النهائي، واستبدال الماء مع 4 مل من المتوسط طلاء الخلايا العصبية في طبق. لاحظ أنه من المهم أن يسمح للسطح لل coverslips لا تجف بعد أن تم المغلفة مع بولي-L-يسين.
- ضع الأطباق التي تحتوي على ساترة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. وينبغي المحتضنة لل coverslips المغلفة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل ثقافة العصبية. ويتم ذلك لرئيس وسيلة للثقافة الخلايا العصبية.
4. تشريح الحصين وطلاء الخلايا العصبية
- الحصول على الفئران الحوامل (18-19 يوم الجنينية، كما يقاس من يوم اكتشاف المكونات المهبلية) والموت ببطء عن طريق قطع الرأس-تخدير الأيزوفلورين أو غيرها من طريقة المعتمدة.
- رش الجانب السفلي من الفئران مع 70٪ من الإيثانول، ثم إجراء شق من منطقة العانة ترولاف إلى نهاية تجويف البطن. لتجنب التلوث، ورعاية لقطع فقط من خلال الجلد في هذه الخطوة.
- شطف أدوات تشريح ثانية مع 70٪ من الإيثانول، ثم قطع طريق جدار البطن لفضح الرحم. إزالة قرني الرحم ووضعها في العقيمة 100 ملم طبق بيتري.
- تنفيذ الخطوات المتبقية في غطاء تدفق الصفحي. إزالة غشاء الرحم المحيطة الأجنة. اقطع رؤوسهم ووضع رؤساء في 100 مم طبق بتري تحتوي على 20 مل CMF-HBSS.
- تشريح خارج العقول وعلى الفور وضعها في 60 مم طبق بتري تحتوي على 2 مل CMF-HBSS على الجليد. جمع فقط 2-3 العقول في طبق للسماح مساحة كافية لاتخاذ الخطوة التالية.
- تحت المجهر تشريح تجريد بعيدا السحايا من خط الوسط من نصفي الكرة المخية، ومن ثم تشريح خارج الحصين ووضعها في 60 مم طبق بتري تحتوي على 4.5 مل CMF-HBSS. لاحظ أن الحصين يمكن تمييزها على أنها struc على شكل هلالتلح في السطح الإنسي من نصف الكرة القشرية، وسهلة لإزالة كما يحده أفقيا عن طريق البطين.
- نقل الأنسجة قرن آمون التي تم جمعها وCMF-HBSS إلى أنبوب 15 مل. إضافة 0.5 مل من 2.5٪ التربسين، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. غراء يمكن أن تستخدم بدلا من التربسين لأنها ألطف ويمكن أن تزيد الغلة.
- إزالة بلطف الحل التربسين بواسطة ماصة باستير، وترك الأنسجة دون عائق قرن آمون في الجزء السفلي من الأنبوب.
- غسل بلطف النسيج مرتين مع 5 مل CMF-HBSS في حين تفرخ أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد غسل الثاني، ليصبح الحجم الكلي للا يقل عن 5 مل عن طريق إضافة كمية كافية من CMF-HBSS إلى الأنسجة. إذا كان هناك الحصين من أكثر من 10 الجراء، ما يصل إلى 8 مل CMF-HBSS يمكن إضافتها.
- تحضير نوعين مختلفين من ماصات مصقول النار لتفكك الأنسجة. غيض من متغير واحد هو من القطر العادي من ماصة ولكن مع حواف مملس مصقول النار. وفاري الآخريننملة واحدة مع قطر الحافة بمقدار النصف. لفترة وجيزة فضح غيض من ماصة باستير الزجاج قطريا لمصدر لهب، ومن ثم اختبر نصائح من الماصات.
- كرر هذه الخطوة حتى يتم مملس حافة الحافة أو تم تخفيض القطر. ومن المهم أن ممارسة للعثور على قطر المثالي للتأكد من أن الأنسجة نأت لانتاج الخلايا واحد دون الإضرار هذه الخلايا.
- يسحن الأنسجة الحصين أولا بنحو 10 يمر من خلال ماصة باستير الزجاج العادي ارتفع على نحو سلس، وبعد ذلك أبعد 5-10 يمر من خلال ماصة مع انخفاض القطر. الهدف هو الحصول على حل متجانس من الخلايا مع عدم وجود أو عدد قليل جدا من كتل الأنسجة.
- تحديد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي. عادة، يتم الحصول على 0،8-1،0 مليون خلية لكل الجرو عندما يتم الجمع بين الحصين من نصفي الكرة الأرضية.
- نقل كمية كافية من خلية إلى تعليق الأطباقتحتوي على coverslips المغلفة بولي-L-يسين في 4 مل الطلاء المتوسطة للحصول على كثافة الطلاء من 300000 خلية لكل 60 مم طبق. كثافة الخلايا يمكن أن تختلف من 100،000 إلى 500،000، وهذا يتوقف على التجربة المقصود.
- بعد 3-4 ساعات، ونقل لل coverslips مع الخلايا العصبية التي تعلق على الأطباق التي تحتوي على الخلايا الدبقية في NBG المتوسطة. ينبغي أن يتم ذلك بحيث يكون الجانب الذي كانت مطلية الخلايا العصبية لأسفل نحو طبقة الخلايا الدبقية. إضافة ما مجموعه 4-5 coverslips في طبق الدبقية.
- بعد يومين أو ثلاثة أيام والطلاء، وإضافة محلول آرا-C إلى التركيز النهائي من 5 ميكرومتر في طبق لإيقاف نمو الدبقية.
- تغذية الخلايا مرة واحدة في الأسبوع عن طريق استبدال 2 مل من المتوسط القديم مع 2.5 مل من متوسطة جديدة في كل رضاعة. وسيلة اضافية المضافة هي لتعويض التبخر مع مرور الوقت، ويتم تغيير سوى جزء من وسيلة لضمان تكييف ثابت من المتوسط من قبل الخلايا الدبقية. هذه الثقافات هي عادة صحية لمدة شهر واحد على الأقل (الشكل 3). ويمكن تحسين بقاء الخلايا العصبية عن طريق إضافة APV إلى مستنبت إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر. APV هو مستقبلات NMDA ويعزز البقاء على قيد الحياة عن طريق الحد من الغلوتامات التحفيز الزائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الطريقة "ساندويتش" الثقافة الخلايا العصبية الأولية، والخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 3) تنمو على سرير من الخلايا الدبقية (الشكل 1) مفصولة الخرز البارافين (الشكل 2). وهذا يضمن أن الخلايا العصبية تنمو بشكل انتقائي على coverslips الزجاج مع الحد الأدنى من تلوث الخلية الدبقية لكن تلقي الدعم الغذائي الكافي من الدبقية المتزايد على طبق زراعة الأنسجة. عادة، الخلايا العصبية يمكن الحفاظ على الثقافة في ل> 3 أسابيع، وتطوير arborisation اسعة مع المحاور والتشعبات متطورة حددها لهم نموذجي dephospho-تاو وMAP2 المناعية، على التوالي (الشكل 4). الخلايا العصبية الناضجة تتطور العمود الفقري متشابك التي حددها توطين الانتقائي للعلامة بعد المشبكي Drebrin1 لهذه المقصورات. والرئيسي يعارضها هذه الأشواك متشابك بشكل وثيق للتخصصات قبل المشبكي، والتي يتم تحديدها من قبل متشابك الحويصلة علامة Synapsin1 المناعية. الالقرب من المواقع قبل وبعد المشبكي يشير متطورة والانحياز نقاط الاشتباك العصبي بشكل صحيح. ومناسبة تماما هذه الخلايا العصبية الأولية للدراسات الفنية والهيكلية من الخلايا العصبية والمشابك. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، دراسات نقل الإشارة، قطبية الخلايا العصبية، والاتجار التحت خلوية والتنمية المشبك واللدونة.
الشكل 1. المرحلة النقيض من الصور الثقافات الدبقية اتخذت 1 يوم، 7 أيام، أو 14 يوما بعد الطلاء من الأسهم الدبقية المجمدة. شريط الحجم، 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صور عالية الدقة من coverslips preparإد مع الخرز البارافين. (A، B) أمثلة على تطبيق صحيح الخرز البارافين. (C، D) أمثلة من الخرز البارافين تطبيقها بشكل غير صحيح. α: تم تطبيق حبة أكثر من واحد في نفس الموقع. β: فشل حبة لأن تقع بشكل صحيح على ساترة. χ: تم تطبيق حبة قريبة جدا من مركز ساترة. δ: كانت حبة مرتفعة جدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الصور المرحلة النقيض من مراحل تطور الخلايا العصبية الأولية في الثقافة. شريط الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.
الشكل 4. الصور المناعي للخلايا العصبية الابتدائية في 17 يوما في المختبر. تم إصلاح الخلايا العصبية مع 4٪ الفورمالديهايد و 4٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لمدة 12 دقيقة، ثم permeabilized مع 0.25٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق. بعد حجب مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة، وحضنت الخلايا العصبية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المطبقة في 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني. استخدمت الأجسام المضادة الأولية على النحو التالي: مكافحة سينابسينات I (أرنب، 1: 2000)، ومكافحة drebrin (IgG1 الماوس، 1: 8، استنساخ M2F6، هجين طاف)، ومكافحة MAP2 (بولكلونل الدجاج IGY، 1: 5000)، ومكافحة تاو-1 (الماوس IgG2a، 1: 2000، استنساخ PC1C6، يعترف تاو dephosphorylated). ثم تم غسلها الخلايا مع برنامج تلفزيوني وحضنت مع الأنواع أو المناسبة الأجسام المضادة الثانوية نمط إسوي محددة في 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. كانت الأجسام المضادة الثانوية تستخدم فلأدنى: اليكسا 488 مترافق المضادة للماوس IgG2a (1: 500)، اليكسا 568 مترافق المضادة للأرنب (1: 500)، اليكسا 647 مترافق المضادة للماوس IgG1 (1: 500)، وAMCA مترافق مكافحة الدجاج IGY (حمار مفتش، 1: 200). شريط الحجم، 10 ميكرون و 2،5 ميكرون، كما هو محدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن أسلوب "ساندويتش" من الخلايا العصبية زراعة وصفت أيضا في أماكن أخرى 2، 11، هناك العديد من الخطوات في جميع أنحاء البروتوكول الذي يصعب جدا لوصف في النص وحده، الذي يمكن أن يؤدي إلى الإحباط للمحققين الذين يرغبون في اعتماده.
ويمكن تقسيم طريقة إلى ثلاثة مسارات رئيسية: ثقافة الدبقية، وإعداد ساترة والثقافة الخلايا العصبية والصيانة. كل الاستعدادات ثلاثة حاسمة للثقافات الخلايا العصبية ذات جودة عالية وعدة اعتبارات هامة يجب أن يوضع في الاعتبار. قبل الطلاء الخلايا العصبية، وينبغي أن تكون الطبقة المغذية الدبقية مثالي يبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا النجمية ويكون بين 50-70٪ التقاء. وهذا من شأنه ضمان الدعم الغذائي الكافي من الطبقة المغذية الدبقية. من المهم للتأكد من أن الثقافة astroglial ديها الحد الأدنى من التلوث من أنواع الخلايا الأخرى، وخاصة الخلايا الدبقية الصغيرة، والتي هي فضفاضة اتاكخلايا هيد ومدورة. السيتوكينات إطلاق الخلايا الدبقية الصغيرة، التي تضر صحة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة 12. مصل الدم، وإما الحصان أو مصل النمو البقري، يمكن أن يكون متغير من الكثير الكثير. يجب أن يتم تنفيذ فحص دقيق لعدة الكثير من المصل قبل البت في استخدام الكثير محدد.
إعداد ساترة هو خطوة هامة أخرى. نوعية الزجاج والبروتوكول المستخدم في التنظيف لها بالغة الأهمية بالنسبة لصحة الخلايا العصبية متطورة. إذا كان يتم اعتماد طريقة حديثا في المختبر، سيكون من المفيد اختبار coverslips الزجاج من العديد من الموردين. لتنظيف لل coverslips ان بعض المعامل امتصاص coverslips في حمض النيتريك 70٪ عن 18-36 ساعة في حين يفعل الآخرون ذلك ل1 فقط ساعة في sonicator. معيارا هاما من coverslips نظيفة هو أن الحل بولي-L-يسين يجب أن تنتشر بالتساوي على السطح. اعتبار آخر مهم هو أن حبات شمع البارافين تطبيقها على لل coverslips ينبغي أن يكون من الارتفاع المناسب وأن يكون ساخنا قطر ودرجة الحرارة المناسبة، على النحو المبين في البروتوكول.
للحصول على الخلايا العصبية، الحصين يمكن تشريح من الجنينية يوم 17-19 الفئران. على الرغم من تشريح في هذه المرحلة يؤدي إلى عدد قليل جدا من الخلايا الدبقية، وانتشار الدبقية يمكن القبض بإضافة عامل مضاد للالإنقسامية آرا-C بعد 2-3 أيام من الثقافة. سحن من الأنسجة قرن آمون trypsinized من نصائح ماصة النار مصقول أمر بالغ الأهمية لفصل الأنسجة إلى الخلايا الفردية دون الإضرار الخلايا نفسها. وسط النمو وصيانة الخلايا العصبية المستخدمة في هذا البروتوكول هو Neurobasal + L-الجلوتامين + B27 الملحق. قد تكون بديلا L-الجلوتامين التي كتبها GlutaMAX، الذي هو أكثر استقرارا في مستنبت. نوعية الملحق B27 يمكن أن تختلف من الكثير الكثير، ولذا يجب أن يتم اختباره قبل استخدامه الكثير محدد للثقافة على المدى الطويل. وهناك الكثير من الفقراء B27 قد يسبب الخلايا العصبية تتجمع. تم العثور على المنتجات البديلة مثل GS21 وSM1 أن تكون بدائل جيدة لB27.الخلايا العصبية نمت لفترة أطول من أسبوع ويجب أن تغذى مع متوسطة جديدة كل أسبوع، حيث يتم استبدال ثلث المتوسط كل أسبوع.
هذه الطريقة في زراعة الخلايا العصبية يمكن أن تقدر بثمن إلى التجارب التي تعتمد على السكان العصبية الخالص مع تلوث الدبقية قليلة أو معدومة. الخلايا العصبية منخفض الكثافة نمت باستخدام هذا الأسلوب البقاء على قيد الحياة عادة لعدة أسابيع مع العرش متطورة، وصلات متشابك وخصائص الشبكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل CIHR MOP-142209 لTJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
