Summary
Cet article décrit le protocole pour la culture de neurones hippocampiques primaires de basse densité en croissance sur des lamelles de verre inversées sur une monocouche de cellules gliales. Les couches de neurones et de cellules gliales sont séparés par des billes de cire de paraffine. Les neurones cultivés par ce procédé sont appropriés pour l'imagerie optique à haute résolution et des essais fonctionnels.
Abstract
La capacité à sonder la structure et de la physiologie des cellules nerveuses individuelles dans la culture est essentielle pour l'étude de la neurobiologie, et permet une certaine souplesse dans la manipulation génétique et chimique des cellules individuelles ou des réseaux définis. Une telle facilité de manipulation est plus simple dans le système de culture réduite par rapport au tissu cérébral intact. Bien que de nombreuses méthodes pour l'isolement et la croissance de ces neurones primaires existent, chacun a ses propres limites. Ce protocole décrit un procédé de culture de faible densité et de haute pureté rongeurs embryonnaires neurones hippocampiques sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales. Cette « culture sandwich » permet une croissance exclusive à long terme d'une population de neurones tout en permettant un soutien trophique de la monocouche gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont suffisamment âgé ou au niveau de la maturité, les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l'imagerie ou des analyses fonctionnelles. g neuronesrown par cette méthode survivent généralement pendant plusieurs semaines et développer de vastes tonnelles, les connexions synaptiques et les propriétés du réseau.
Introduction
Le cerveau est organisé en réseaux complexes de neurones. La contribution des neurones individuels à l'activité du réseau et la fonction cérébrale peut être étudiée par une altération sélective de leur composition moléculaire et perturbance de leurs propriétés physiologiques. La manipulation génétique et chimique des neurones individuels est sans doute plus facile dans les neurones en culture que dans le tissu cérébral intact, non grevé par l'hétérogénéité et la complexité cellulaire de ce dernier. Neurones dans la culture se développent axonale bien définis et arborisation dendritique et forment de vastes connexions synaptiques entre eux.
Alors que la culture des neurones des animaux adultes ou d'autres régions du système nerveux est possible, les cultures hippocampiques embryonnaires sont souvent préférées en raison de leur population cellulaire pyramidale définie et relativement faible densité gliale 1, 2. neurones hippocampiques cultivés à faible densité dans la culture sont particulièrement ammenable à l'étude de la localisation subcellulaire, le trafic des protéines, la polarité neuronale et le développement des synapses. Les neurones de culture ont également été largement utilisé dans l' étude des processus moléculaires dans la plasticité synaptique 3, 4, 5, 6. Préparations de culture Neuron de souris avec des délétions génétiques globales qui ne survivent pas postnatal ont été particulièrement utiles dans l' étude des rôles cellulaires et synaptiques de certains gènes 7.
Comme dans le cerveau, les neurones hippocampiques en culture dépendent du soutien des cellules gliales trophique. Cela complique leur culture, et a conduit au développement de plusieurs méthodes différentes par lesquelles ce soutien est fourni. Une méthode couramment utilisée consiste à plaquer directement les neurones sur une monocouche de cellules gliales 8, ou qui permettent à des cellules gliales contaminant du hipp acquisocampal tissu à proliférer et à former une monocouche sous les neurones 9. Bien que cette méthode a trouvé un certain succès, l'impureté de la culture neuronale résultante est désavantageux pour des expériences d'imagerie. Une autre méthode couramment utilisée pour la culture de neurones est de laisser-out de la couche d' alimentation de cellules gliales au total, et au lieu de fournir un support trophique sous la forme d'un milieu de croissance défini 10.
Nous décrivons ici la méthode « sandwich » ou « Banker » de la culture des neurones 2, 11. Cette méthode consiste à plaquer les neurones de l'hippocampe sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales séparées par des perles de cire de paraffine. Cela facilite la culture à long terme d'une population homogène de neurones sans contaminer glie tout en permettant le soutien de la monocouche trophique gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont de niveau suffisant âge ou de maturité,les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l'imagerie ou des analyses fonctionnelles.
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Protocol
Toutes les expériences et les protocoles des animaux de laboratoire ont été approuvés par le comité d'éthique animale Université du Manitoba et étaient conformes aux directives du Conseil canadien de protection des animaux.
1. Préparation des instruments, Tampons et solutions
- Stériliser par autoclavage tout l'équipement de dissection, pipettes Pasteur en verre, embouts de pipette, appareil de filtration, et de l'eau désionisée.
- Préparer 20% (p / v; 1,1 M) de solution de glucose stock dans de l'eau désionisée et de filtrage stériliser. Conserver à 4 ° C.
- Préparer une solution de pyruvate de sodium 100 mM dans de l'eau désionisée et on filtre à stériliser. Conserver à 4 ° C.
- Préparer calcium et de magnésium exempt de sel équilibrée de Hank Solution (CMF-HBSS) en faisant une solution à 10% de HBSS (10x), HEPES 10 mM, et pénicilline-streptomycine 100 U / ml dans de l'eau désionisée. Conserver à 4 ° C pendant plus de 1 à 2 mois.
- Préparer 10 mg / ml de désoxyribonucléase I (DNase) dans du CMF-HBSS,puis filtrer, stériliser et stocker à -20 ° C.
- Préparer moyen gliales en faisant une solution de 30 mM de glucose (à partir de la solution stérile), 95 pénicilline-streptomycine, et 10 à 15% de sérum de croissance bovine U / mL (BGS) dans du milieu essentiel minimum (MEM).
NOTE: Comme indiqué dans le protocole, une solution de 5% BGS peut être utilisée si nécessaire pour ralentir la prolifération des cellules. Le sérum de cheval peut être utilisé au lieu de BGS, mais notez que chaque lot doit être testé avant de l'utiliser en raison de la variation inter-lots. Conserver la solution préparée à 4 ° C pendant pas plus de 1 à 2 mois. Bien que de nombreux laboratoires utilisent FBS, nous avons observé que la croissance constante gliales dans BGS est aussi robuste que dans FBS. BGS est dérivé du sérum de veau foetal qui est complété avec des composants chimiquement définis. En outre, BGS est beaucoup plus économique que FBS. - Préparation de la croissance des neurones et un milieu d'entretien (neurobasal-B27, NBG) en faisant une solution de supplément B27 1x et 0,5 mM de L-glutamine dans 500 ml Neurobasal Medium. Conserver à 4 ° C pendant plus de 1 à 2 mois. L-Glutamine peut être substitué par GlutaMAX, qui a été suggérée pour être plus stable dans le milieu de croissance.
- Préparer le milieu de plaquage neurone en faisant une solution de 30 mM de glucose (à partir de la solution stérile), 1 mM de pyruvate de sodium (à partir de la solution stérile), et 10% BGS dans du MEM. Conserver à 4 ° C pendant plus de 1 à 2 mois.
- Préparer une solution de 1 mM de cytarabine (Ara-C) et le filtre stériliser. Aliquoter dans des parties 1 ml et stocker à -20 ° C.
- Préparer une solution de 100 mM à 100 mN APV NaOH stérilisé par filtration. Conserver à -20 ° C.
- Dissoudre 1 mg / ml de lysine-poly-L dans un tampon de borate, pH 8,5 (acide borique 50 mM et 12 mM de borax) et le filtre stériliser. Aliquoter et stocker à -20 ° C. Au lieu de poly-L-lysine, on peut utiliser le poly-L-ornithine, qui peut être moins toxique pour les cellules.
2. Préparation glie Culture
- Préparer la culture de cellules astrocytes corticale
- Vaporiser les chiots avec 70% d'éthanol et les décapite.
- Placez les têtes dans un plat de 100 mm sur la glace contenant 15 ml CMF-HBSS.
- Disséquer chaque cerveau en coupant le cuir chevelu, l'ouverture du crâne, sectionner le tronc cérébral, et transférer ensuite le cerveau à 60 mm des boîtes de Petri sur de la glace contenant 3 ml de HBSS-CMF.
- Séparer les hémisphères cérébraux de l'hippocampe et la bande alors loin les méninges qui les entourent. Faites preuve de précaution suffisante pour assurer un minimum de contamination à partir de fibroblastes méningés. fibroblastes méningés dans la culture peuvent rivaliser avec la glie pour la croissance et être nuisibles pour la santé des neurones. Ramassez tous les hémisphères cérébraux dans une boîte de Petri de 60 mm sur la glace contenant 5 ml CMF-HBSS.
- Retirez le CMF-HBSS et émincer puis le tissu cortical recueilli le plus finement possible à l'aide de micro-disséquer printemps-ciseaux.
- Ajouter suffisamment CMF-HBSS à la côtelettetissus ped. À l'aide d'une pipette Pasteur en verre, transférer les morceaux de tissu à un tube de 15 ml. Porter le volume total à 12 ml en ajoutant CMF-HBSS.
- Ajouter 1,5 ml chacune 2,5% de trypsine et 10 mg / ml de solution de DNase. Incuber le mélange résultant à 37 ° C dans un bain-marie pendant 12 min.
- Triturer le tissu 10-15 fois à l'aide d'une pipette Pasteur en verre, et en outre l'incubation dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 min.
- On filtre le surnageant à travers du papier lentille ou un filtre à mailles dans un tube de 50 ml contenant 5 ml de BGS. Ceci est fait pour enlever des morceaux de tissu non dissocié. Vous pouvez également utiliser crépines de cellules disponibles dans le commerce.
- Ajouter 13,5 ml de HBSS-CMF et 1,5 mL de 2,5% de trypsine dans le tube contenant les morceaux de tissu restant et en outre incuber à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 10 minutes supplémentaires.
- Triturer le tissu restant une fois de plus, puis filtrer de nouveau la suspension dans le tube de 50 ml contenant le filtrat initial. Ensuite, rincez le lens papier avec 3 ml de BGS. Le volume final doit être d'environ 38 ml.
- Centrifuger la suspension contenant les cellules gliales dissociées pendant 6 minutes à 130 x g. jetez soigneusement le surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur en verre. Veiller à ce que ne soient pas perturbés les cellules sédimentées au fond. Le fond de la pastille apparaît légèrement rougeâtre contenant des composants sanguins.
- Transférer les cellules gliales dans 1 ml de milieu gliales dans un nouveau tube, en prenant soin de ne pas perturber la partie rouge de la pastille.
- Ajouter jusqu'à 2 ml de milieu gliales par chiot pour remettre en suspension le combiné dissocie les cellules gliales. Par exemple, si 10 chiots ont été utilisés, et le volume total de la remise en suspension soit de 20 ml.
- Préparer une fiole de 75 cm2 de culture cellulaire par chiot. Ajouter 18 ml de milieu gliales préchauffée à chaque flacon.
- Transfert 2 ml de suspension cellulaire dans chaque fiole et laisser incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Après un jour, remplacer par 20 ml gliales moyen. A ce stade, la culture est un mélange de gliales et d'autres types de cellules indésirables.
- Quatre jours après l'ensemencement des cellules, secouer vigoureusement les flacons pour déloger les cellules non-astrocytes. Pour ce faire, rincer les flacons une fois avec CMF-HBSS, puis ajoutez 10 ml frais CMF-HBSS à chaque flacon. Secouer les flacons avec vigueur 5-10 fois, puis Aspirer le CMF-HBSS. Rincer deux fois avec CMF-HBSS, puis ajoutez 20 ml de milieu gliales.
REMARQUE: Cette étape est cruciale pour assurer l'élimination des types de cellules non-cibles, et ne doit pas entraîner la perte des astrocytes souhaités. - Remplacer par du milieu frais gliale deux fois par semaine jusqu'à ce que les cellules sont confluentes (Figure 1).
- glie gel
- Une fois que les cultures sont confluentes, Aspirer moyen et laver la monocouche cellulaire avec 10 ml CMF-HBSS.
- Ajouter 10 ml de trypsine / EDTA à 0,25% à chaque flacon et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- flacons Tapez doucement pour déloger les cellules. Ajouter 1 mL BGS to chaque flacon et transférer les suspensions de cellules dans des tubes de 15 ml.
- Centrifuger les tubes à 130 g pendant 6 min. Jeter le surnageant résultant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu gliales.
- Préparer le milieu de congélation de cellules gliales (1-partie du sulfoxyde de diméthyle et 4 parties BGS). Ajouter 0,5 ml de cette solution à chacun des 4 flacons cryogéniques par flacon.
- Transférer 0,5 ml de suspension cellulaire dans chaque flacon, puis congeler les cellules lentement en plaçant les flacons dans un récipient isolé dans un congélateur -80 ° C pendant une nuit. Après une journée, transférer les flacons à un congélateur d'azote liquide pour le stockage à long terme.
- Plaquage relancé glie
- Plate glie 1-2 semaines avant le jour de la culture des neurones.
- Préparer un tube de 50 mL avec 10 mL de milieu chauffé gliale.
- Décongeler une fiole congelée de la glie dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2-3 min.
- Transférer le contenu du flacon dans le tube de 50 ml contenant 10 ml de milieu gliale.
- centrifugeusee le tube pendant 5 min à 130 x g et le surnageant aspiré.
- Remettre en suspension le culot dans 20 ml de milieu gliales.
- Ajouter 3 ml de milieu frais gliale à chacune des boîtes de culture (60 mm), et transférer ensuite 1 ml de la suspension de cellules dans chaque boîte. Incuber les cultures à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Nourrir les cellules deux fois par semaine. Si la densité cellulaire atteint 50% de confluence bien avant la journée de la culture des neurones, passer à moyen gliales contenant 5% BGS pour ralentir le taux de croissance gliale. La confluence souhaitée de la monocouche de cellules gliales pour la culture de neurones est de 50% - 70%.
- Remplacer le milieu par du milieu gliale NBG (6 mL / boîte) 1-2 jours avant la culture des neurones.
3. Préparation Coverslip
- Nettoyage et préparation des perles Paraffine
- Immerger lamelles dans de l'acide nitrique concentré (70% en poids / poids; ATTENTION: très corrosif) et les sonication pendant 30 min à température ambiante. D'autres laboratoires ont found intérêt à incuber les lamelles à 70% d'acide nitrique dans des supports en céramique pour 12-24 h à la température ambiante à la place.
- jeter soigneusement l'acide nitrique dans une hotte chimique désigné conformément aux directives institutionnelles. Rincer les lamelles 3-5 fois avec de l'eau déminéralisée.
- Immergez les dans de l'eau déminéralisée lamelles et les sonication à nouveau pendant 30 min (sauter si suivant la méthode alternative).
- Retirer l'eau déminéralisée et rincer les lamelles trois autres fois.
- Immergez les dans de l'eau 50 lamelles ml déionisée et de les stériliser par autoclavage. En variante, les lamelles stériliser à 225 ° C dans un four pendant 6 h. Si vous utilisez cette approche alternative, passez à l'étape 3.1.9.
- Une fois que l'autoclave, transférer les lamelles dans une hotte à flux laminaire stérile pendant les étapes suivantes.
- Retirer l'eau déminéralisée et rincer à 20-30 ml de 100% d'éthanol.
- Ajouter 20-30 ml de 100% d'éthanol et transférer les lamelles etl'éthanol à une boîte de Petri de 100 mm.
- Utiliser des pinces émoussées pour transférer des lamelles de 60 mm des boîtes de Petri, 4-5 lamelles par boîte, puis les laisser sécher à l'air en se penchant les lamelles contre le bord du plat. Une fois que l'éthanol est évaporé, poser les lamelles à plat sur la surface.
- Transférer 10 g de paraffine à une bouteille en verre résistant à la chaleur appropriée. Faire fondre la paraffine et le maintenir à environ 150 à 200 ° C sur une plaque chaude pendant au moins 1 h. La température idéale à laquelle la paraffine doit être chauffé peut prendre quelques ajustements. Les températures non idéales peuvent conduire à des difficultés à produire la bonne taille des billes de paraffine. La période d'attente après la fusion contribue à assurer une température constante dans tout le liquide.
- Tremper une pipette Pasteur dans la paraffine, et appuyez ensuite rapidement à trois points proches du bord de chaque lamelle (chaque point étant approximativement à 120 °). Les gouttes se solidifie en perles d'environ 0,3-0,5 mm de haut et 1,0-2,0 mm de diamètreeter et fonctionne pour fournir un espace entre les neurones sur la lamelle et la monocouche de cellules gliales ci - dessous (figure 2).
- Stériliser la vaisselle sous lumière UV pendant 30 minutes, puis de les recouvrir d'une feuille d'aluminium et stocker à température ambiante. Préparés peuvent être stockés des lamelles et utilisées jusqu'à un mois. perles de paraffine devraient être autorisés à adhérer aux lamelles pendant au moins une semaine avant l'utilisation. Cela permettra d'éviter la paraffine de se détacher pendant les étapes restantes du protocole.
- Revêtement avec Poly-Lamelles de L-Lysine
- Obtenir des boîtes de Petri contenant des lamelles préalablement préparées avec les billes de paraffine.
- Ajouter 200 ul de poly-L-lysine dans du tampon borate à la surface de chaque lamelle et laisser la solution reposer pendant une nuit sur des lamelles couvre-objet, couverte, à la température ambiante. Manteau de la même surface que celle sur laquelle les billes de paraffine sont situés. Notez que si elle est correctement nettoyée, la poly-L-lysine doit se propager facilementpour couvrir la surface de la lamelle.
- Après une journée, se laver les deux fois en les lamelles tremper dans l'eau déminéralisée stérile pendant 2 h à chaque fois. Après le lavage final, remplacer l'eau avec 4 ml de milieu de placage par neuronal plat. Notez qu'il est important que la surface des lamelles ne pas laisser sécher après avoir été recouvertes de poly-L-lysine.
- Placer les capsules contenant une lamelle en 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Les lamelles enrobées doivent être mises en incubation pendant au moins 24 h avant la culture des neurones. Ceci est fait pour amorcer le milieu pour la culture des neurones.
4. Dissection de Hippocampus et le placage Neurones
- Obtenir un rat enceinte (jour embryonnaire 18 à 19, telle que mesurée à partir du jour de la découverte du bouchon vaginal) et l'euthanasie par décapitation sous anesthésie à l'isoflurane, ou toute autre méthode approuvée.
- Pulvériser la face inférieure du rat avec 70% d'éthanol, puis faire une incision de la région pubienne through à l'extrémité de la cavité abdominale. Pour éviter toute contamination, prendre soin de ne couper que par la peau à cette étape.
- Rincer les instruments de dissection à nouveau avec 70% d'éthanol, puis couper à travers la paroi abdominale pour exposer l'utérus. Retirez les deux cornes utérines et placez-les dans une boîte de Pétri stérile 100 mm.
- Effectuer les étapes restantes dans une hotte à flux laminaire. Retirer la membrane utérine entourant les foetus. Décapite et les placer les têtes dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 20 ml CMF-HBSS.
- Disséquer le cerveau et les placer immédiatement dans une boîte de Pétri 60 mm contenant 2 ml CMF-HBSS sur la glace. Recueillir seulement 2-3 cerveaux par plat pour permettre un espace suffisant pour l'étape suivante.
- Sous un microscope à dissection bande loin les méninges de la ligne médiane des hémisphères cérébraux, puis disséquer les hippocampes et les placer dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 4,5 ml de HBSS-CMF. Notez que l'hippocampe peut être distingué comme struc en forme de croissantture dans la surface interne de l'hémisphère cortical, et est facile à enlever car il est bordé latéralement par un ventricule.
- Transférer le tissu hippocampique recueilli et CMF-HBSS à un tube de 15 ml. Ajouter 0,5 ml de 2,5% de trypsine, puis incuber à 37 ° C pendant 10 min. Papaïne peut être utilisé au lieu de trypsine, car il est plus doux et peut augmenter le rendement.
- Retirer délicatement la solution de trypsine à la pipette Pasteur, en laissant le tissu hippocampique non perturbée au fond du tube.
- laver doucement le tissu à deux reprises avec 5 ml de HBSS-CMF tout en incubant à 37 ° C pendant 5 min. Après le second lavage, porter le volume total à au moins 5 ml par addition d'un volume suffisant de CMF-HBSS au tissu. S'il y a des hippocampes de plus de 10 chiots, jusqu'à 8 ml CMF-HBSS peut être ajouté.
- Préparer deux variantes de pipettes polies au feu pour la dissociation des tissus. La pointe d'une variante est du diamètre normal de la pipette, mais avec des bords lissés polies au feu. L'autre variant fait qu'un avec le diamètre de la pointe réduit de moitié. En bref exposer la pointe d'une pipette Pasteur en verre en diagonale à une source de flamme, puis examinez les conseils des pipettes.
- Répétez cette étape jusqu'à ce que le bord de la pointe avait été lissée ou le diamètre a été réduit. Il est important de pratiquer pour trouver le diamètre idéal pour faire en sorte que le tissu se dissocie pour produire des cellules individuelles sans endommager ces cellules.
- Triturer le tissu hippocampique premier par environ 10 passages à travers une pipette Pasteur en verre normale à bord lisse, puis encore 5 à 10 passages à travers la pipette avec le diamètre réduit. L'objectif est d'obtenir une solution homogène de cellules sans ou très peu de bouquets de tissus.
- Déterminer la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé. En règle générale, sont obtenus lorsque hippocampes provenant des deux hémisphères sont combinés de 0,8 à 1,0 million de cellules par chiot.
- Transférer un volume suffisant de la suspension cellulaire à des platscontenant des lamelles dans 4 ml de milieu de mise à revêtues de poly-L-lysine obtenir une densité de placage de 300.000 cellules par boîte de 60 mm. La densité des cellules peut varier de 100 000 à 500 000, en fonction de l'expérience prévue.
- Après 3-4 h, transférer les lamelles avec les neurones attachés à des boîtes contenant des cellules gliales dans le milieu NBG. Cela devrait être fait de telle sorte que le côté sur lequel les neurones ont été étalées est orienté vers le bas vers la couche de cellules gliales. Ajouter un total de 4-5 par plat de lamelles glie.
- Deux ou trois jours après placage, ajouter la solution Ara-C à une concentration finale de 5 uM par plat pour arrêter la croissance gliale.
- Alimenter les cellules une fois par semaine par substitution de 2 ml de l'ancien milieu par 2,5 ml de milieu frais à chaque repas. Le milieu supplémentaire ajouté est de compenser l'évaporation au fil du temps, et seule une partie du milieu est modifiée pour assurer le conditionnement constante du milieu par les cellules gliales. Ces cultures sont généralement en bonne santé pendant au moins un mois (Figure 3). la survie des neurones peut être améliorée par l'ajout d'APV dans le milieu de culture à une concentration finale de 100 uM. APV est un antagoniste des récepteurs NMDA et favorise la survie en réduisant l'excitotoxicité du glutamate.
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Representative Results
Dans cette méthode « sandwich » de la culture des cellules nerveuses primaires, les neurones hippocampiques (figure 3) se développent sur un lit de cellules gliales (figure 1) séparées par des billes de paraffine (Figure 2). Cela garantit que la croissance des neurones de manière sélective sur des lamelles de verre à la contamination des cellules gliales minimale mais reçoivent un soutien adéquat de la glie trophique de plus en plus sur la boîte de culture de tissus. En règle générale, les neurones peuvent être maintenus en culture pendant> 3 semaines et de développer une vaste arborisation avec axones et dendrites bien développés identifiés par leur dephospho-Tau et Map2 immunomarquage, respectivement typique (Figure 4). neurones matures développent des épines synaptiques identifiés par la localisation sélective du marqueur postsynaptique Drebrin1 à ces compartiments. Ces épines synaptiques sont étroitement aux spécialisations présynaptiques apposés, qui sont identifiés par le marqueur de la vésicule synaptique Synapsin1 immunomarquage. leproximité des sites pré et post-synaptiques indique bien développé et synapses correctement aligné. Ces neurones primaires sont bien adaptés pour des études fonctionnelles et structurales des neurones et des synapses. Ceux-ci comprennent, mais sans s'y limiter, les études de transduction du signal, la polarité neuronale, le trafic subcellulaire et le développement des synapses et la plasticité.
Figure 1. Les images de contraste de phase des cultures gliales prises 1 jour, 7 jours ou 14 jours après le placage du stock congelé gliales. Barre d'échelle, 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Les images à haute résolution de prépar lamellesed avec des perles de paraffine. (A, B) Exemples de billes de paraffine appliquées correctement. (C, D) Exemples de billes de paraffine appliquées de façon incorrecte. α: Plus d'une bille a été appliquée au même endroit. β: Le cordon n'a pas pu être correctement situé sur la lamelle. χ: La perle a été appliqué trop près du centre de la lamelle. δ: La perle était trop élevé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. images de contraste de phase des stades de développement des neurones primaires en culture. Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande eest la figure.
Figure 4. images de neurones primaires immunofluorescence à 17 jours in vitro. Les neurones ont été fixées avec 4% de formaldehyde et 4% de saccharose dans du PBS pendant 12 min, puis perméabilisées avec 0,25% de Triton X-100 pendant 5 min. Après blocage avec 10% de BSA dans du PBS pendant 30 min, les neurones ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires appliqués dans 3% de BSA dans du PBS. Les anticorps primaires ont été utilisés comme suit: anti-synapsine I (lapin, 1: 2000), anti-Drebrin (IgG1 de souris, 1: 8, clone M2F6, surnageant d'hybridome), anti-MAP2 (AGI polyclonal de poulet, 1: 5000), et anti-Tau-1 (IgG2a de souris, 1: 2000, PC1C6 clone; reconnaît tau déphosphorylé). Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et incubées avec des espèces appropriées ou des anticorps secondaires spécifiques d'un isotype à 3% de BSA dans du PBS pendant 1 h à 37 ° C. Les anticorps secondaires utilisés étaient Assembas: Alexa 488 conjugué IgG2a anti-souris (1: 500), anti-lapin Alexa 568-conjugué (1: 500), Alexa 647 conjugué IgG1 anti-souris (1: 500), et AMCA conjugué anti-poulet IgY (IgG d'âne, 1: 200). Barre d'échelle, 10 pm et 2,5 pm, comme il est indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Bien que la méthode « sandwich » de la culture des neurones a été bien décrit par ailleurs 2, 11, il y a plusieurs étapes dans le protocole qui sont assez difficiles à décrire seul dans le texte, ce qui peut conduire à la frustration pour les chercheurs qui souhaitent adopter.
La méthode peut être divisée en trois grands flux de travail: culture gliales, préparation de la culture et de couvre-neurone et de maintenance. Chacune des trois préparations sont essentielles pour les cultures et plusieurs considérations importantes neurones de haute qualité doit être gardé à l'esprit. Avant neurones placage, la couche d'alimentation gliales devrait idéalement être une population homogène de astrocytes et se situer entre la confluence de 50-70%. Cela permettrait d'assurer un soutien suffisant de la trophique couche d'alimentation gliales. Il est important de veiller à ce que la culture des astrocytes a un minimum de contamination d'autres types de cellules, en particulier microglie, qui sont plus ou moins attaccellules HED et arrondies. Libèrent des cytokines de microglie, qui nuisent à la santé des neurones et la survie 12. Le sérum, soit de sérum de cheval ou de sérum de croissance bovine, peuvent varier d'un lot à. examen minutieux de plusieurs lots de sérum doit être effectué avant de décider d'utiliser un lot spécifique.
préparation est Coverslip une autre étape importante. La qualité du verre et le protocole utilisé dans son nettoyage sont essentiels pour les neurones bien développés en bonne santé. Si la méthode est nouvellement adoptée dans un laboratoire, il serait une valeur de verre couvre-test auprès de plusieurs fournisseurs. Pour le nettoyage des lamelles, certains laboratoires trempent dans 70% des lamelles couvre l'acide nitrique pour 18-36 h tandis que d'autres ne le font que 1 h dans un sonicateur. Un critère important de lamelles blanches est que la solution de poly-L-lysine doit répartir uniformément sur la surface. Une autre considération importante est que les perles de cire de paraffine appliquées aux lamelles doivent être d'une hauteur appropriée etdiamètre et être chauffé à la bonne température, tel que décrit dans le protocole.
Pour obtenir des neurones, hippocampes peuvent être disséqués jour embryonnaire 17-19 rats. Bien que la dissection à ce stade conduit à très peu de cellules gliales, la prolifération gliale peut être arrêté en ajoutant l'agent anti-mitotique Ara-C après 2-3 jours de culture. La trituration du tissu hippocampique trypsinisées par des pointes de pipette polies au feu est essentiel pour dissocier le tissu dans des cellules individuelles sans endommager les cellules elles-mêmes. Le milieu de croissance et le maintien des neurones utilisés dans ce protocole est Neurobasal + L-Glutamine + B27 supplément. L-Glutamine peut être substitué par GlutaMAX, qui est plus stable dans le milieu de culture. La qualité du supplément de B27 peut varier d'un lot à, et il devrait donc être testé avant d'utiliser un lot spécifique pour la culture à long terme. Un grand nombre de pauvres B27 peut causer des neurones à agglutiner. produits alternatifs tels que GS21 et SM1 ont été trouvés être de bons substituts pour B27.doivent être nourris neurones cultivés pendant plus d'une semaine avec du milieu frais chaque semaine, dans lequel un tiers du milieu est remplacé chaque semaine.
Cette méthode de culture de cellules nerveuses peut se révéler précieuse pour les expériences qui reposent sur les populations neuronales pures avec peu ou pas de contamination gliale. neurones à faible densité cultivés en utilisant cette méthode survivent généralement pendant plusieurs semaines avec des tonnelles bien développées, les connexions synaptiques et les propriétés du réseau.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les IRSC RdP-142209 à TJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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- Kaech, S., Banker, G.
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- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
