Low-density Primary hippocampus Neuron kultur

Summary

Denna artikel beskrivs det protokoll för odling av låg densitet primära hippocampusneuroner växer på täckglas av glas inverterade över en glial monoskikt. Neuron och gliaceller skikten separeras av paraffin vaxpärlor. Neuronerna odlas genom detta förfarande är lämpliga för hög upplösning optisk avbildning och funktionella analyser.

Abstract

Förmågan att sondera struktur och fysiologi av individuella nervceller i kultur är avgörande för studier av neurobiologi, och tillåter flexibilitet i genetisk och kemisk manipulation av enskilda celler eller definierade nätverken. Sådan lätthet för manipulation är enklare i den reducerade odlingssystemet jämfört med den intakta hjärnvävnad. Medan många metoder för isolering och tillväxt av dessa primära nervceller existerar, har varje sina egna begränsningar. Detta protokoll beskriver ett förfarande för odling låg densitet och hög renhet gnagare embryonala hippocampusneuroner på täckglas, som sedan är upphängda över ett monoskikt av gliaceller. Denna 'sandwich kultur' möjliggör för exklusiv långsiktig tillväxt av en population av nervceller samtidigt för trofiska stöd från den underliggande gliaceller monolager. När neuroner är av tillräcklig ålder eller mognad, kan de neurontäckglas vändas ut av gliaceller skålen och används i avbildning eller funktionella analyser. neuroner grown genom denna metod överleva typiskt under flera veckor och utveckla omfattande hållare, synaptiska förbindelser och nätverksegenskaper.

Introduction

Hjärnan är organiserad i intrikata nätverk av nervceller. kan studeras bidraget av enskilda nervceller till nätverksaktivitet och hjärnans funktion genom selektiv förändring av deras molekylära sammansättning och perturbance av deras fysiologiska egenskaper. Genetisk och kemisk manipulation av enskilda nervceller är utan tvekan lättare i odlade nervceller än intakt hjärnvävnad, kompliceras av den senare cellulära heterogenitet och komplexitet. Neuroner i odling utvecklas väldefinierad axonal och dendritiska hållare och bildar omfattande synaptiska anslutningar med varandra.

Medan neuron kultur från vuxna djur eller från andra regioner i nervsystemet är möjlig, är embryonala hippocampusodlingar ofta föredragna på grund av deras definierade pyramidal cellpopulation och relativt låg gliala densitet ^{1, 2.} Hippocampusneuroner odlade vid låg densitet i odling är särskilt ameNable att studiet av subcellulära lokalisering, protein trafficking, neuronal polaritet och synaps utveckling. Neuroner i kultur har också i stor utsträckning använts för att studera molekylära processer i synaptisk plasticitet ^{3, 4, 5, 6.} Neuron kultur preparat från möss med globala genetiska deletioner som inte överlever efter födelsen har varit särskilt användbart för att studera cellulära och synaptiska roller vissa gener ^7.

Såsom i hjärnan, odlade hippocampala neuroner är beroende av trofisk stöd från gliaceller. Detta försvårar deras kultur, och har lett till utvecklingen av flera olika metoder genom vilka detta stöd levereras. En vanligen använd metod inbegriper plätering neuroner direkt på ett monoskikt av gliaceller ^8, eller gör det kontaminerande gliaceller från det förvärvade hippocampal vävnad för att proliferera och bilda ett monoskikt under neuron ^9. Även om denna metod har funnit en viss framgång, är den förorening av den resulterande neuronal kultur ofördelaktigt för avbildning experiment. En annan vanligen använd metod för neuron kultur är att lämna ut gliaceller matarskikt helt och hållet, och istället tillhandahålla trofiskt stöd i form av ett definierat tillväxtmedium ^10.

Här beskriver vi "sandwich" eller "Banker" metod för neuron kultur ^{2, 11.} Denna metod innefattar utstrykning av hippocampala neuroner på täckglas, som sedan är upphängda över ett monoskikt av gliaceller åtskilda av paraffin vaxpärlor. Detta underlättar långvarig odling av en homogen population av nervceller utan att förorena glia samtidigt för trofiska stöd från den underliggande gliaceller monolager. När nervceller är tillräckligt ålder eller mognad,neuron täckglas kan fällas ut av gliaceller skålen och används i avbildning eller funktionella analyser.

Protocol

Alla experiment och protokoll som använder försöksdjur godkändes av University of Manitoba djuretisk kommitté och var kompatibel med riktlinjerna för den kanadensiska rådet om Animal Care.

1. Framställning av Instrument, Buffertar och lösningar

1. Sterilisera genom autoklavering av alla dissektion utrustning, glas Pasteur-pipetter, pipettspetsar, filteranordning, och avjoniserat vatten.
2. Bered en 20% (vikt / volym; 1,1 M) stamglukoslösning i avjoniserat vatten och filtrera-sterilisera. Lagra vid 4 ° C.
3. Bered en 100 mM natriumpyruvat lösning i avjoniserat vatten och filtrera-sterilisera. Lagra vid 4 ° C.
4. Förbereda kalcium- och magnesiumfri Hanks balanserade saltlösning (CMF-HBSS) genom att göra en lösning av 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES och 100 U / ml penicillin-streptomycin i avjoniserat vatten. Lagra vid 4 ° C under inte mer än 1 till 2 månader.
5. Förbereda 10 mg / ml deoxiribonukleas I (DNas) i CMF-HBSS,och sedan filtrera-sterilisera och förvara vid -20 ° C.
6. Förbereda gliaceller mediet genom att göra en lösning av 30 mM glukos (från den sterila lösning), 95 U / ml penicillin-streptomycin, och 10-15% bovint tillväxthormon serum (BGS) i Minimum Essential Medium (MEM).
   OBSERVERA: Såsom anges i protokollet, kan en lösning av 5% BGS användas om det krävs för att bromsa cellproliferation. Horse Serum kan användas i stället för BGS, men observera att varje parti måste testas före användning på grund av inter-batch variation. Lagra den framställda lösningen vid 4 ° C under inte mer än 1 till 2 månader. Även om många laboratorier använder FBS, vi konsekvent observerat att gliaceller tillväxt i BGS är så robust som i FBS. BGS är härledd från fetalt kalvserum, som är kompletterat med kemiskt definierade komponenter. Dessutom är BGS väsentligt mer ekonomisk än FBS.
7. Förbereda neuron tillväxt och upprätthållande medium (Neurobasal-B27, NBG) genom att göra en lösning av 1x B27 supplement och 0,5 mM L-glutamin i 500 ml Neurobasal Medium. Lagra vid 4 ° C under inte mer än 1 till 2 månader. L-glutamin kan vara substituerad med GlutaMAX, som har föreslagits för att vara mer stabila i tillväxtmediet.
8. Förbereda neuron plätering mediet genom att göra en lösning av 30 mM glukos (från den sterila lösning), 1 mM natriumpyruvat (från den sterila lösning), och 10% BGS i MEM. Lagra vid 4 ° C under inte mer än 1 till 2 månader.
9. Framställa en lösning av ett mM Cytarabine (Ara-C) och filtrera-sterilisera. Alikvot i 1 ml portioner och förvara vid -20 ° C.
10. Framställa en lösning av 100 mM APV i 100 mN filtersteriliserad NaOH. Lagra vid -20 ° C.
11. Upplös 1 mg / ml poly-L-lysin i boratbuffert, pH 8,5 (50 mM borsyra och 12 mM borax) och filtrera-sterilisera. Alikvot och förvara vid -20 ° C. I stället för poly-L-lysin, kan man använda poly-L-ornitin, som kan vara mindre toxiska för celler.

2. Glia Culture Framställning

1. Förbered kortikal astroglia cellodling
   1. Spraya valparna med 70% etanol och halshugga dem.
   2. Placera huvudena i en 100 mm skål på is innehållande 15 ml CMF-HBSS.
   3. Dissekera ut varje hjärna genom att skära hårbotten, öppna skallen, avskärning hjärnstammen, och sedan överföring hjärnan till 60 mm Petri skålar på is innehållande 3 ml CMF-HBSS.
   4. Separera hjärnhalvorna från hippocampi och sedan skala bort hjärnhinnorna som omger dem. Motion tillräcklig försiktighet för att säkerställa minimal förorening från meningeal fibroblaster. Meningeal fibroblaster i kultur kan konkurrera med glia för tillväxt och vara skadligt för neuron hälsa. Samla alla hjärnhalvorna i en 60 mm Petri skål på is innehållande 5 ml CMF-HBSS.
   5. Avlägsna CMF-HBSS och sedan mala den uppsamlade kortikala vävnaden så fint som möjligt med användning av mikro-dissekera fjäder-sax.
   6. Tillsätt tillräckligt CMF-HBSS till chopped vävnad. Med användning av en Pasteurpipett av glas, överföra vävnaden bitar till ett 15 ml rör. Bringa den totala volymen till 12 ml genom tillsats av CMF-HBSS.
   7. Lägga 1,5 ml vardera av 2,5% trypsin och 10 mg / ml DNas-lösning. Inkubera den resulterande blandningen vid 37 ° C i ett vattenbad under 12 min.
   8. Triturera vävnaden 10-15 gånger med användning av en Pasteurpipett av glas, och vidare inkubera den i en 37 ° C vattenbad under 3 min.
   9. Filtrera supernatanten genom linspapper eller ett filter mesh in i ett 50 ml rör innehållande 5 ml BGS. Detta görs för att ta bort bitar av odissocierad vävnad. Alternativt använda kommersiellt tillgängliga cell silar.
   10. Lägga 13,5 ml av CMF-HBSS och 1,5 ml av 2,5% trypsin till röret innehållande de återstående vävnadsbitar och ytterligare inkubera den vid 37 ° C i ett vattenbad under ytterligare 10 min.
   11. Triturera den återstående vävnaden än en gång, och sedan filtrera suspensionen igen in i 50 ml rör innehållande det ursprungliga filtratet. Därefter skölj lens papper med 3 ml av BGS. Den slutliga volymen bör vara ungefär 38 ml.
   12. Centrifug suspensionen innehållande de dissocierade gliaceller för 6 min vid 130 x g. Noggrant kassera supernatanten med användning av en Pasteurpipett av glas. Se till att de pelleterade cellerna i botten inte störs. Bottnen av pelleten visas svagt rödaktig innehåller blodkomponenter.
   13. Överföra de gliaceller i 1 ml glial medium till ett nytt rör, noga med att inte störa den rödaktiga delen av pelleten.
   14. Lägga till upp till 2 ml av glial medium per valp för att återsuspendera den kombinerade dissocierade gliaceller. Till exempel, var om 10 valpar används, och sedan den totala resuspension volymen skulle vara 20 ml.
   15. Förbereda en 75 cm ^{2-cellkulturflaska} per valp. Lägga 18 ml förvärmd gliaceller medium till varje kolv.
   16. Överföring 2 ml cellsuspension till varje kolv och inkubera i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.
   17. Efter en dag, ersätta med 20 ml glial medium. I detta skede är kulturen en blandning av gliaceller och andra oönskade celltyper.
   18. Fyra dagar efter sådd cellerna Skaka kolvarna för att lossa icke-astrocyternas celler. För att göra detta, skölj flaskorna gång med CMF-HBSS, och sedan lägga till 10 ml färsk CMF-HBSS till varje kolv. Skaka kolvarna kraftigt 5-10 gånger, och sedan aspirera av CMF-HBSS. Skölj två gånger med CMF-HBSS, och sedan lägga 20 ml glial medium.
       OBS: Detta steg är avgörande för att säkerställa avlägsnandet av icke-mål celltyper, och bör inte leda till förlust av de önskade astrocyter.
   19. Ersätta med färskt glial mediet två gånger i veckan till dess att cellerna är sammanflytande (Figur 1).
2. Frys glia
   1. När kulturerna är konfluenta, aspirera bort mediet och tvätta cellmonoskiktet med 10 ml CMF-HBSS.
   2. Lägga 10 ml 0,25% trypsin / EDTA till varje kolv och inkubera vid 37 ° C under 3 min.
   3. Knacka flaskor försiktigt för att rubba cellerna. Lägg 1 ml BGS to varje kolv och överföra cellsuspensioner i 15 ml rör.
   4. Centrifugera rören vid 130 xg under 6 min. Kassera den resulterande supernatanten.
   5. Resuspendera cellpelleten i 2 ml glial medium.
   6. Förbereda gliaceller frysmedium (1-del dimetylsulfoxid och 4-parts BGS). Lägga 0,5 ml av denna lösning till var och en av 4 kryogena flaskor per kolv.
   7. Överföra 0,5 ml cellsuspension till varje flaska, och sedan frysa cellerna långsamt genom att placera flaskorna i en isolerad behållare i en -80 ° C frys över natten. Efter en dag, överför flaskorna till en flytande kväve frys under långtidslagring.
3. Plätering återupplivade glia
   1. Plate glia 1-2 veckor före neuron kultur dag.
   2. Framställa en 50 ml rör med 10 ml värmdes glial medium.
   3. Tina en frusen ampull av glia i ett 37 ° C vattenbad under 2-3 minuter.
   4. Överför innehållet i injektionsflaskan in i 50 ml rör innehållande 10 ml glial medium.
   5. Centrifuge röret i 5 minuter vid 130 xg och aspirera bort supernatanten.
   6. Återsuspendera pelleten i 20 ml glial medium.
   7. Lägg 3 ml färskt glial medium till var och en av odlingsskålar (60 mm), och sedan överföra en ml av cellsuspensionen till varje skål. Inkubera odlingarna i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.
   8. Mata cellerna två gånger i veckan. Om celldensiteten når 50% konfluens i god tid före neuron odlingsdagen, växla till glia medium innehållande 5% BGS till långsamt gliaceller tillväxthastighet. Den önskade sammanflödet av gliaceller monoskiktet för neuron kultur är 50% - 70%.
   9. Ersätta den gliala medium med NBG-medium (6 ml / skål) 1-2 dagar före neuron kulturen.

3. Cover Framställning

1. Rengöring och Framställning av Paraffin Pärlor
   1. Dränka täckglas i koncentrerad salpetersyra (70% vikt / vikt; VARNING: starkt frätande) och sonikera dem för 30 min vid rumstemperatur. Andra laboratorier har found det fördelaktigt att inkubera täckglas i 70% salpetersyra i keramiska rack för 12-24 timmar vid rumstemperatur i stället.
   2. Noggrant kassera salpetersyra i en utsedd kemisk dragskåp i enlighet med institutionella riktlinjer. Skölja täckglasen 3-5 gånger med avjoniserat vatten.
   3. Dränka täckglasen i avjoniserat vatten och sonikera dem igen för 30 min (hoppa över om att följa det alternativa metoden).
   4. Avlägsna avjoniserat vatten och skölj täck ytterligare tre gånger.
   5. Dränka täckglasen i 50 ml avjoniserat vatten och sterilisera dem genom autoklavering. Alternativt sterilisera täckglas vid 225 ° C i en ugn under sex timmar. Om du använder detta alternativ metod vidare till steg 3.1.9.
   6. Gång autoklaveras, överföra täckglasen till en steril huv med laminärt flöde för de följande stegen.
   7. Avlägsna det avjoniserade vattnet och skölj med 20-30 ml 100% etanol.
   8. Lägga 20-30 ml 100% etanol och överföra täckglas ochetanol till en 100 mm Petri skål.
   9. Använda trubbiga pincett för att överföra täckglas till 60 mm Petri skålar, 4-5 täckglas per skål, och sedan låta dem lufttorka genom att luta täckglasen mot kanten av skålen. När etanolen har avdunstat, låg täckglasen platt på ytan.
   10. Överföra 10 g paraffin till ett lämpligt värmebeständigt glasflaska. Smält paraffin och bibehålla den vid omkring 150-200 ° C på en het platta under minst 1 h. Den idealiska temperaturen till vilken paraffinet bör upphettas kan ta vissa justeringar. Icke-ideala temperaturer kan leda till svårigheter att producera den korrekta storleken av de paraffin pärlor. Väntetiden efter smältning bidrar till att säkerställa jämn temperatur i hela vätskan.
   11. Doppa en pasteurpipett in i paraffin, och sedan snabbt röra den till tre fläckar nära kanten av varje täckglas (varje fläck är ungefär 120 ° från varandra). Dropparna kommer att stelna till pärlor ca 0,3-0,5 mm höga och 1,0-2,0 mm i diametereter och kommer att fungera för att tillhandahålla ett utrymme mellan neuronerna på täckglas och gliaceller monoskiktet nedan (figur 2).
   12. Sterilisera rätter under UV-ljus under 30 min, och sedan täcka dem med aluminiumfolie och förvara vid rumstemperatur. Beredda täck kan lagras och användas i upp till en månad. Paraffin pärlor bör tillåtas att ansluta sig till täck under minst en vecka före användning. Detta kommer att förhindra paraffin lossnar under de återstående stegen i protokollet.
2. Beläggningstäckglas med Poly-L-Lysin
   1. Erhålla Petriskålar innehållande tidigare framställda täckglas med de paraffin pärlor.
   2. Lägga 200 mikroliter av poly-L-lysin i boratbuffert till ytan hos varje täckglas och låt lösningen sitta på täckglasen över natten, täckt, vid rumstemperatur. Belägga samma yta som den på vilken de paraffinpärlorna är belägna. Observera att om ordentligt rengjorda, bör poly-L-lysin sprids lättför att täcka ytan av täckglas.
   3. Efter en dag, tvätta täckglasen två gånger genom att blötlägga dem i sterilt avjoniserat vatten i 2 timmar varje gång. Efter den slutliga tvätten, ersätta vattnet med 4 ml av neuronal plätering medium per skål. Observera att det är viktigt att ytan på täckglasen inte tillåtas att torka efter att ha blivit belagda med poly-L-lysin.
   4. Placera täckglas innehållande rätter i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator. De belagda täckglas skall inkuberas under minst 24 h före neuron kulturen. Detta görs för att prima medium för neuron kultur.

4. Dissekering av Hippocampus och Plating Neuroner

1. Erhålla en gravid råtta (embryonal dag 18-19, mätt från dagen för vaginal plugg upptäckten) och euthanize genom isofluran-sövda halshuggning eller annan godkänd metod.
2. Spraya undersidan av råtta med 70% etanol, och sedan göra ett snitt från blygd regionen through till slutet av bukhålan. För att undvika kontaminering, vara noga med att skära endast genom huden i detta steg.
3. Skölj dissektion instrument igen med 70% etanol, och skär sedan genom bukväggen för att exponera livmodern. Ta bort de två livmoderhornen och placera dem i en steril 100 mm Petri skål.
4. Utföra de återstående stegen i en huv med laminärt flöde. Ta bort livmoder membran som omger fostren. Decapitate dem och placera huvudena i en 100 mm Petri skål innehållande 20 ml CMF-HBSS.
5. Dissekera ut hjärnorna och omedelbart placera dem i en 60 mm Petri skål innehållande 2 ml CMF-HBSS på is. Samla bara 2-3 hjärnor per fat för att ge tillräcklig plats för nästa steg.
6. Under ett dissektionsmikroskop skala bort hjärnhinnorna från mittlinjen av de cerebrala hemisfärerna och sedan dissekera ut hippocampi och placera dem i en 60 mm Petri skål innehållande 4,5 ml CMF-HBSS. Observera att hippocampus kan urskiljas som en halvmåne-formad Structure i den mediala ytan av det kortikala hemisfären, och är lätt att avlägsna så det gränsar i sidled av en ventrikel.
7. Överför den insamlade hippocampusvävnad och CMF-HBSS till en 15 ml rör. Lägga 0,5 ml av 2,5% trypsin, och sedan inkubera vid 37 ° C under 10 min. Papain kan användas i stället för trypsin, eftersom det är skonsammare och kan öka avkastningen.
8. Försiktigt bort trypsin lösningen genom pasteurpipett, lämnar hippocampusvävnad ostört vid botten av röret.
9. tvätta försiktigt vävnaden två gånger med 5 ml CMF-HBSS samtidigt inkubera den vid 37 ° C under 5 min. Efter den andra tvätten, bringa den totala volymen till minst 5 ml genom tillsats av en tillräcklig volym av CMF-HBSS till vävnaden. Om det finns hippocampi från mer än 10 valpar, upp till 8 ml CMF-HBSS kan läggas till.
10. Bered två varianter av brand polerad pipetter för vävnads dissociation. Spetsen av en variant är av den normala diametern av pipetten, men med brandpolerade smoothened kanter. Den andra Variant är ett med spetsdiametern minskas med hälften. Kortfattat utsätta toppen av ett glas pasteurpipett diagonalt till en flamma källa och sedan undersöka tips av pipetter.
    1. Upprepa detta steg tills spetsen kanten hade smoothened eller diametern har reducerats. Det är viktigt att öva att finna ideal diameter för att säkerställa att vävnaden dissocieras för att ge enskilda celler utan att skada dessa celler.
11. Mal sönder hippocampusvävnad först med cirka 10 passager genom en slät-edged normala glas pasteurpipett, och sedan ytterligare fem till tio passager genom pipetten med den reducerade diametern. Målet är att erhålla en homogen lösning av celler med ingen eller mycket få vävnadsklumpar.
12. Bestämma celldensitet med användning av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Normalt är 0,8 till 1,0 miljoner celler per valp erhålles när hippocampi från de två halvkloten kombineras.
13. Överföra en tillräcklig volym av cellsuspensionen till rätterinnehållande poly-L-lysin-belagda täckglas i 4 ml plätering medium för att erhålla en plätering densitet av 300.000 celler per 60 mm skål. Densiteten av cellerna kan variera från 100 tusen till 500 tusen, beroende på den avsedda experimentet.
14. Efter 3-4 h, överföra täckglas med neuroner fästa till skålar innehållande gliaceller i NBG-medium. Detta bör göras på sådant sätt att den sida på vilken de neuroner utströks är vänd ner mot gliala cellskiktet. Lägg till totalt 4-5 täck per glia skålen.
15. Två eller tre dagar efter plätering, tillsätt Ara-C-lösning till en slutlig koncentration av 5 | iM per skål att gripa glial tillväxt.
16. Mata cellerna en gång i veckan genom att ersätta 2 ml av den gamla mediet med 2,5 ml färskt medium vid varje utfodring. Den extra mediet tillsätts är att kompensera för avdunstning med tiden, och endast en del av mediet byts för att säkerställa konsekvent konditionering av mediet genom gliaceller. Dessa kulturer är normalt hälsosamt för minst en månad (Figur 3). Neuronöverlevnad kan förbättras genom tillsats av APV till odlingsmediet till en slutlig koncentration av 100 | iM. APV är en NMDA-receptorantagonist och främjar överlevnad genom att minska glutamat excitotoxicitet.

Representative Results

I denna "sandwich" -metoden av primär nervcellkultur, hippocampusneuroner (Figur 3) växa på en bädd av gliaceller (Figur 1) åtskilda av paraffin pärlor (Figur 2). Detta säkerställer att nervceller selektivt växa på täckglas med minimal glial cellkontaminering men får tillräckligt trofisk stöd från glia växer på vävnadsodlingsskål. Typiskt kan neuroner bibehållas i odling under> 3 veckor och utveckla omfattande arborisation med väl utvecklade axoner och dendriter som identifieras av deras typiska dephospho-Tau och MAP2 immunfärgning, respektive (Figur 4). Mogna neuron utvecklar synaptiska ryggar som identifieras genom selektiv lokalisering av postsynaptiska markör Drebrin1 till dessa fack. Dessa synaptiska ryggar är nära apposed till presynaptiska inriktningar, som identifieras av synaptiska vesikler markör Synapsin1 immunfärgning. DeNärheten till pre- och postsynaptiska ställen indikerar välutvecklad och korrekt inriktad synapser. Dessa primära nervceller är väl lämpade för funktionella och strukturella studier av neuroner och synapser. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, studier av signaltransduktion, neuronal polaritet, subcellulär trafficking och synaps utveckling och plasticitet.

Figur 1. faskontrast bilder av gliala kulturer tas en dag, 7 dagar, eller 14 dagar efter utstrykning från frysta glial lager. Scale bar, 500 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Högupplösta bilder av täck FÖRBEREDELSEed med paraffin pärlor. (A, B) Exempel på korrekt tillämpas paraffin pärlor. (C, D) Exempel på felaktigt applicerade paraffin pärlor. α: Mer än en vulst applicerades på samma plats. β: Pärlan inte vara korrekt belägen på täckglas. χ: Pärlan tillämpades för nära mitten av täckglas. δ: Vulsten var för hög. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Fas kontrastbilder av utvecklingsstadier av primära neuroner i odling. Scale bar, 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av thär figur.

Figur 4. Immunfluorescens bilder av primära neuroner vid 17 dagar in vitro. De neuroner fixerades med 4% formaldehyd och 4% sackaros i PBS under 12 min, och sedan permeabiliserades med 0,25% Triton X-100 under 5 min. Efter blockering med 10% BSA i PBS under 30 min, fick neuronema inkuberades över natten vid 4 ° C med primära antikroppar appliceras i 3% BSA i PBS. Primära antikroppar användes enligt följande: anti-synapsin I (kanin, 1: 2000), anti-drebrin (mus lgG1, 1: 8, klon M2F6, hybridomsupernatant), anti-MAP2 (kyckling polyklonal IgY, 1: 5000), och anti-Tau-1 (mus-IgG2a, 1: 2000, klon PC1C6; erkänner defosforylerad tau). Cellerna tvättades sedan med PBS och inkuberades med lämpliga arter-eller isotypspecifika sekundära antikroppar i 3% BSA i PBS under 1 h vid 37 ° C. Sekundära antikroppar som användes var enligt foldalar: Alexa 488-konjugerad anti-mus IgG2a (1: 500), Alexa 568-konjugerad anti-kanin (1: 500), Alexa 647-konjugerad anti-mus lgG1 (1: 500), och AMCA-konjugerad anti-kyckling IgY (åsna-IgG, 1: 200). Scale bar, 10 | j, m och 2,5 | im, såsom anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Medan "sandwich" -metoden att odla nervceller har väl beskrivna på annat håll ^{2, 11,} finns det flera steg under protokollet som är ganska svårt att beskriva i text ensam, vilket kan leda till frustration för utredare som vill anta den.

Metoden kan delas in i tre breda arbetsflöden: gliaceller kultur, täckglas beredning och neuron kultur och underhåll. Var och en av de tre preparaten är avgörande för högkvalitativa neuron kulturer och flera viktiga överväganden måste hållas i åtanke. Före utstrykning neuroner, bör gliaceller matarskikt helst vara en homogen population av astrocyter och vara mellan 50-70% konfluens. Detta skulle säkerställa tillräcklig trofisk stöd från gliaceller feeder lager. Det är viktigt att se till att astroglial kulturen har minimal förorening av andra celltyper, särskilt mikroglia, som är löst AttacHed och rundade celler. Mikroglia frigör cytokiner, som är skadliga för neuron hälsa och överlevnad ^12. Serumet antingen hästserum eller bovint tillväxthormon serum, kan variera från parti till parti. Noggrann screening av flera partier av serum ska utföras innan man beslutar att använda en viss del.

Täck förberedelse är ytterligare ett viktigt steg. Kvaliteten på glaset och det protokoll som används i rengöring är avgörande för friska välutvecklade nervceller. Om metoden är nyligen antagna i ett labb, skulle det vara värt att testa glastäck från flera leverantörer. För rengöring av täck del laboratorier blöt täck i 70% salpetersyra under 18-36 h, medan andra gör det för endast 1 timme i en sonikator. Ett viktigt kriterium för rena täck är att poly-L-lysin lösning bör fördelas jämnt på ytan. Ett annat viktigt övervägande är att paraffin vaxpärlor appliceras på täckglas bör vara av lämplig höjd ochdiameter och värmas till rätt temperatur, som det beskrivs i protokollet.

För att erhålla nervceller kan hippocampi dissekeras från embryonala dag 17-19 råttor. Men dissektion på detta stadium leder till mycket få gliaceller, kan gliaproliferation gripas genom att tillsätta det antimitotiska medlet Ara-C efter 2-3 dagars odling. Rivning av trypsin hippocampus vävnad från brand polerad pipettspetsar är avgörande för att skilja vävnaden i enskilda celler utan att skada cellerna själva. Den neuronala tillväxten och underhållsmedium som används i detta protokoll är Neurobasal + L-glutamin + B27 supplement. L-glutamin kan vara substituerad med GlutaMAX, som är mera stabil i odlingsmediet. Kvaliteten på B27 tillskott kan variera från parti till parti, så det bör testas innan du använder en specifik del för längre sikt kultur. En dålig massa B27 kan orsaka nervceller att klumpa. Alternativa produkter såsom GS21 och SM1 har visat sig vara bra substitut för B27.Neuroner som odlas för längre än en vecka bör matas med färskt medium varje vecka, varvid tredjedel av mediet ersattes varje vecka.

Denna metod för att odla nervceller kan visa sig ovärderligt för experiment som förlitar sig på rena neuronala populationer med liten eller ingen glial föroreningar. Låg densitet neuroner odlade med användning av denna metod överlever typiskt under flera veckor med väl utvecklade hållare, synaptiska förbindelser och nätverksegenskaper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Instruments
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5910
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5650
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5605
Dumont Forceps (#5)	Roboz	RS-5045
Dumont Forceps (#PP)	Roboz	RS-4950
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Trypsin (2.5%)	Gibco	15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25-200-072
Swinnex Filter Holder, 25 mm	EMD Millipore	SX0002500	Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave
Isoflorane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406V2
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Grade 105 Lens Cleaning Tissue	GE Healthcare	2105-841	Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave
Glass Pasteur pipettes with cotton filter	VWR	14672-412
HEPES (1 M)	Gibco	15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)	Gibco	14-185-052
Glass Pasteur pipettes	VWR	14672-380
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)	Sigma-Aldrich	DN25-100mg
Butane bunsen burner	Wall-Lenk Mfg. Co.	Model 65
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Petri Dish (100 mm)	Fisher	FB0875712
Petri Dish (60 mm)	Fisher	FB0875713A
Horse Serum	Gibco	16050-122	Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	11-095-080
Neurobasal Medium	Gibco	21-103-049
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25-030-081
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium
Culture Dish (60 mm)	Corning, Inc	353002
Culture Flasks (75 cm^2)	Greiner Bio-One	658170
Cytarabine (Ara-C)	Sigma-Aldrich	C3350000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Bovine Growth Serum (BGS)	HyClone	SH3054103	Heat-inactivation is recommended before use.
B27 Supplement (50x)	Gibco	17-504-044
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ml
Cryogenic Vials	VWR	89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)	Sigma-Aldrich	A5282
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip Preparation
Sodium tetraborate decahydrate (borax)	Sigma-Aldrich	B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Histoplast Paraffin Wax	Fisher	22-900-700
Gravity Convection Oven	VWR	89511-404	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Ultrasonic Bath (Sonicator)	Fisher Scientific	15337400
Nitric Acid	Anachemia	62786-460
Ceramic Staining Racks	Thomas Scientific	8542E40	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Coverslips	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/18	Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B0252
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Sterile Syringe Filters	VWR	28145-477	Used with BD syringe for filter-sterilization
Syringe	BD	302832	Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization
Water Bath	Fisher Scientific	15-460-16Q
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339650
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339652