Summary
В этой статье описан протокол для культивирования низкой плотности первичных нейронов гиппокампа, растущие на покровных стеклах инвертированных над глиальной монослое. Нейрон и глиальные слои разделены парафиновых бусин. Нейроны, выращенные этот метод являются подходящими для высокого разрешения оптических изображений и функциональных анализов.
Abstract
Возможность исследовать структуру и физиологию отдельных нервных клеток в культуре имеет решающее значение для изучения нейробиологии, и обеспечивает гибкость в генетической и химической манипуляции отдельных клеток или определенных сетей. Такая легкость манипуляции проще в сокращенной системе культуры по сравнению с интактной тканью мозга. Хотя многие методы выделения и рост этих первичных нейронов существуют, каждый из них имеет свои ограничения. Этот протокол описан способ культивирования низкой плотности и грызуны высокой чистоты эмбриональных нейронов гиппокампа на покровных стекла, которые затем подвешенный над монослоем глиальных клеток. Эта «сэндвич культура» позволяет исключительно для долгосрочного роста популяции нейронов, позволяя для трофической поддержки со стороны основного глиальных монослоя. Когда нейроны достаточного возраста и уровня зрелости, то нейрон покровный может быть перевернут отказ от глиального блюда и используется в визуализации или функциональных анализах. Нейроны гrown этого методом, как правило, выживает в течение нескольких недель и разработать обширные беседки, синаптические связи и сетевые свойства.
Introduction
Мозг состоит из запутанных сетей нейронов. Вклад отдельных нейронов к сетевой активности и функции мозга могут быть изучены путем селективного изменения их молекулярного состава и perturbance их физиологических свойств. Генетическая и химическая обработка отдельных нейронов в культуре нейронов, возможно, легче, чем в интактной ткани мозга, обремененная клеточной гетерогенности последнего и сложности. Нейроны в культуре развиваются хорошо определенные аксонами и дендритные беседки и образуют обширные синаптические связи друг с другом.
В то время как нейрон культура от взрослых животных или из других областей нервной системы возможно, эмбриональный гиппокамп культура часто предпочтительна из - за их определенные пирамидальную популяцию клеток и относительно низкой плотность глиальной 1, 2. Нейроны гиппокампа, выращенные при низкой плотности в культуре особенно AMENable к изучению внутриклеточной локализации, торговли белка, нейрональной полярности и развитие синапсов. Нейроны в культуре также широко используют в исследовании молекулярных процессов в синаптической пластичности 3, 4, 5, 6. Препараты Нейрона культуры мышея с глобальными генетическими удалениями , которые не выживают послеродовым были особенно полезны при изучении клеточной и синаптической роли определенных генов 7.
Как и в головном мозге, культивируемые нейроны гиппокампа зависят от трофической поддержки со стороны глиальных клеток. Это усложняет их культуру, и привел к разработке нескольких различных методов, с помощью которых поставляется эта поддержка. Один из часто используемый способ включает нанесение непосредственно на нейроны монослой клеток глии 8, или позволять загрязняющие глиальные клетки от приобретенной Hippocampal ткани пролиферировать и образуют монослой под нейронах 9. Хотя этот метод нашел некоторый успех, примесь в результате нейронного культуры является невыгодной для экспериментов с изображениями. Другим часто используемый метод нейронной культуры , чтобы оставить выход глиальных фидерного слоя в целом, и вместо того, чтобы оказывать трофическую поддержку в виде определенной среды для выращивания 10.
Здесь мы описываем «сэндвич» или «Banker» метод нейрон культуры 2, 11. Этот способ включает в себя нанесение нейронов гиппокампа на покровные стекла, которые затем подвешенных над монослой глиальных клеток, разделенных парафиновых шариков. Это облегчает долгосрочную культуру гомогенной популяции нейронов без загрязнения глии допуская при этом трофической поддержке со стороны основной глиальной монослое. Когда нейроны достаточного возраста и уровня зрелости,Нейрон покровные может быть перевернута из-глиальных блюдо и используется в визуализации или функциональных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты и протоколы с использованием лабораторных животных были одобрены Университет Манитобы комитета по этике животных и были в соответствии с инструкциями Канадского совета по уходу за животными.
1. Подготовка инструментов, Буферы и растворы
- Стерилизовать автоклавирование всего рассечение оборудования, стеклянные пипетки Пастера, наконечники пипеток, фильтрующий аппарат, и деионизированную воду.
- Подготовьте 20% (вес / объем; 1,1 М) раствора глюкозы в запас деионизированной воды и фильтр-стерилизуют. Хранить при 4 ° С.
- Подготовьте 100 мМ раствор пирувата натрия в деионизированной воде и фильтр-стерилизуют. Хранить при 4 ° С.
- Подготовьте кальций- и магний-Free Хэнка сбалансированный солевой раствор (CMF-HBSS), сделав раствор 10% HBSS (10x), 10 мМ HEPES и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина в деионизированной воде. Хранить при 4 ° С в течение не более чем 1 до 2 месяцев.
- Подготовьте 10 мг / мл Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы) в CMF-HBSS,а затем отфильтровать стерилизовать и хранить при -20 ° С.
- Подготовьте глиальных среду, делая раствор 30 мМ глюкозы (из стерильного раствора), 95 Ед / мл пенициллина-стрептомицина и 10-15% сыворотки роста крупного рогатого скота (BGS) в минимальной поддерживающей среде (MEM).
Примечание: Как указано в протоколе, раствор 5% БГС может быть использован, если это необходимо, чтобы замедлить пролиферацию клеток. Лошадь Сыворотка может использоваться вместо БГС, но учтите, что каждая партия должна быть проверена перед использованием в связи с между периодическим изменением. Хранить приготовленный раствор при 4 ° С в течение не более чем 1 до 2 месяцев. Хотя многие лаборатории используют FBS, мы постоянно наблюдали, что глиальные рост BGS является столь надежен, как и в ФБС. БГС получают из эмбриональной сыворотки теленка, который с добавлением химически определенных компонентов. Кроме того, БГС является значительно более экономичным, чем FBS. - Приготовьте роста нейронов и поддерживающую среду (Neurobasal-B27, NBG), сделав раствор 1x В27 добавки и 0,5 мМ L-глутамина в 500 мл Neurobasal Mediгм. Хранить при 4 ° С в течение не более чем 1 до 2 месяцев. L-Глютамин может быть замещен GlutaMAX, который был предложен, чтобы быть более стабильным в среде роста.
- Подготовьте нейрон гальванической среду, сделав раствор 30 мМ глюкозы (из стерильного раствора), 1 мМ пирувата натрия (из стерильного раствора) и 10% BGS в MEM. Хранить при 4 ° С в течение не более чем 1 до 2 месяцев.
- Готовят раствор 1 мМ цитарабина (Ara-C) и фильтр-стерилизовать. Алиготе в 1 мл порциями и хранят при -20 ° C.
- Готовят раствор 100 мМ APV в 100 мН фильтр-стерилизованного NaOH. Хранить при -20 ° C.
- Растворите 1 мг / мл поли-L-лизина в боратного буфера, рН 8,5 (50 мМ борной кислоты и 12 мМ буры) и фильтр-стерилизовать. Аликвоты и хранят при -20 ° C. Вместо того, поли-L-лизин, можно использовать поли-L-орнитин, которые могут быть менее токсичными к клеткам.
2. Культура Подготовка Глия
- Подготовка кортикальных культур астроглии клеток
- Спрей щенков с 70% -ным этанолом и обезглавить их.
- Поместите головы в 100 мм блюдо на льду, содержащей 15 мл CMF-HBSS.
- Рассеките из каждого мозга путем разрезания кожи головы, открывая череп, отделяя ствол мозга, а затем передать мозг до 60 мм чашек Петри на льде, содержащий 3 мл CMF-HBSS.
- Отделить полушарий головного мозга от гиппокампа, а затем стирают мозговых оболочек, окружающих их. Упражнение адекватной меры предосторожности, чтобы обеспечить минимальное загрязнение от менингеальных фибробластов. Менингеальные фибробласты в культуре могут конкурировать с глией для роста и быть вредными для здоровья нейрона. Собрать все полушарий головного мозга в 60 Мм Петри Петри на льду, содержащей 5 мл CMF-HBSS.
- Удалите CMF-HBSS и затем фарш собранной кортикальную ткани, как тонко, как это возможно с помощью микро-рассечения пружинных ножниц.
- Добавьте достаточное количество CMF-HBSS к отбивнойPED ткани. С помощью пипетки Пастера стекла, перенести куски ткани в пробирку 15 мл. Довести общий объем до 12 мл добавлением CMF-HBSS.
- Добавить 1,5 мл каждого из 2,5% трипсина и 10 мг / мл раствора ДНКазы. Инкубируйте полученную смесь при 37 ° С в водяной бане в течение 12 мин.
- Растирают ткани в 10-15 раз с помощью стеклянной пипетки Пастера, и дополнительно инкубировать ее в водяной бане C 37 ° в течение 3 мин.
- Фильтр супернатанта через линзу бумагу или фильтрующую сетку в пробирку, содержащую 50 мл 5 мл БГСА. Это делается, чтобы удалить куски недиссоциированной ткани. В качестве альтернативы, использовать коммерчески доступные фильтры клеток.
- Добавить 13,5 мл CMF-HBSS и 1,5 мл 2,5% трипсина в пробирку, содержащую оставшиеся кусочки ткани и дополнительно инкубировать при 37 ° С на водяной бане в течение еще 10 мин.
- Растирают оставшиеся ткани еще раз, а затем отфильтровать суспензию снова в 50 мл пробирки, содержащей первоначальный фильтрат. Затем промойте льнс бумага с 3 мл БГС. Конечный объем должен быть примерно 38 мл.
- Центрифуга суспензия, содержащая диссоциированных глиальные клетки в течение 6 мин при 130 х г. Осторожно удалите супернатант с помощью стеклянной пипетки Пастера. Убедитесь в том, что осажденные клетки в нижней части не нарушается. Дно осадка появляется слегка красновато-содержащие компоненты крови.
- Передача глиальных клеток в 1 мл среды глиальной в свежую пробирку, следя за тем, чтобы не нарушить красноватую часть гранул.
- Добавление до 2 мл среды в глиальном детеныш для ресуспендирования комбинированных диссоциированы глиальные клетки. Например, если были использованы 10 щенков, а затем общий объем ресуспендирования будет 20 мл.
- Подготовьте один 75 см 2 клеточной культуре колбу каждого щенка. Добавить 18 мл подогретого глиальных среды в каждую колбу.
- Передача 2 мл клеточной суспензии в каждую колбу и инкубировать в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора.
- После того, как один дня, заменить 20 мл глиальных мedium. На этом этапе, культура представляет собой смесь из глиальных и других нежелательных типов клеток.
- Через четыре дня после посева клетки, энергично встряхните колбы, чтобы выбивать без астроцитов клеток. Чтобы сделать это, промыть колб один раз с CMF-HBSS, а затем добавляют 10 мл свежего CMF-HBSS в каждую колбу. Встряхните колбы энергично в 5-10 раз, а затем отсасывают от СМФ-HBSS. Промыть дважды с CMF-HBSS, а затем добавить 20 мл глии среду.
Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения удаления типов нецелевых клеток, и не должен приводить к потере желаемых астроцитов. - Заменить со свежей средой глиальной два раза в неделю до тех пор , пока клетки не являются вырожденная (Рисунок 1).
- Замораживание глии
- После того, как культуры конфлюэнтны, аспирация от среды и промыть клеточный монослой 10 мл CMF-HBSS.
- Добавляют 10 мл 0,25% трипсина / EDTA в каждую колбу и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
- Нажмите Колбы осторожно, чтобы выбить клетки. Добавить 1 мл BGS то каждой колбе и передавать клеточные суспензии в 15 мл пробирки.
- Центрифуга труб при 130 мкг в течение 6 мин. Откажитесь полученного супернатанта.
- Ресуспендируют осадок клеток в 2 мл среды глиальной.
- Подготовьте глиальную среду замораживания (1-часть диметилсульфоксид и 4-частей BGS). Добавить 0,5 мл этого раствора в каждый из 4-х криогенных флаконов в колбу.
- Передача 0,5 мл клеточной суспензии в каждую пробирку, а затем заморозить клетки медленно, поместив флаконы в изолированном контейнере в морозильнике C -80 ° в течение ночи. После того, как один день, передавать флаконы с жидким морозильнике азота в течение длительного хранения.
- Покрытие возродил глии
- Пластинчатые глии 1-2 недели до дня нейрона культуры.
- Подготовьте 50 мл пробирки с 10 мл нагретой глиальных среды.
- Оттепель 1 флакон замороженного глии в водяной бане при 37 ° С в течение 2-3 мин.
- Перенести содержимое флакона в 50 мл пробирку, содержащую 10 мл глии среду.
- центрифугае пробирку в течение 5 мин при 130 мкг и Аспирируйте от надосадочной жидкости.
- Ресуспендируют осадок в 20 мл глиальной среды.
- Добавьте 3 мл свежей среды глиальной к каждому из культуральных чашек (60 мм), а затем передать 1 мл клеточной суспензии в каждую чашку. Инкубируйте культуры в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора.
- Поток клеток два раза в неделю. Если плотность клеток достигает 50% сплошности задолго до дня нейрон культуры, переключиться на глиальных среде, содержащей 5% BGS, чтобы замедлить темп роста глии. Желательно слияние глиального монослоя для нейронов культуры составляет 50% - 70%.
- Заменить глиальную среду с НБС средой (6 мл / чашка) 1-2 дней до нейрона культуры.
3. Получение покровного
- Очистка и подготовка парафиновых шариков
- Погрузитесь покровные в концентрированной азотной кислоте (70% вес / вес; ВНИМАНИЕ: высококоррозионную) и разрушать ультразвуком их в течение 30 мин при комнатной температуре. Другие лаборатории Found его полезным для инкубации покровные в 70% -ной азотной кислоты в керамических стойках в течение 12-24 ч при комнатной температуре вместо.
- Осторожно удалите азотную кислоту в указанном химических вытяжном шкафу в соответствии с ведомственными руководящими принципами. Промыть покровные 3-5 раза деионизированной водой.
- Погрузитесь покровные в деионизированной воде и снова разрушать ультразвуком их в течение 30 мин (пропустить, если после альтернативный метод).
- Удалите деионизованную воду и промойте покровные еще три раза.
- Погрузитесь покровные в 50 мл деионизированной воды и стерилизовать их автоклавированием. В качестве альтернативы, стерилизовать покровные при 225 ° С в печи в течение 6 ч. При использовании этого альтернативного подхода, перейдите к шагу 3.1.9.
- После того, как автоклавирует, передача покровных в стерильный колпак с ламинарным потоком для следующих шагов.
- Удалите деионизированной воды и промыть 20-30 мл 100% -ного этанола.
- Добавить 20-30 мл 100% этанола и передачи покровные иэтанола в 100 Мм Петри Петри.
- Используйте тупой пинцет для передачи покровных до 60 Мм Петри Петри, 4-5 покровных на чашку, а затем позволить им высохнуть на воздух, опираясь покровными на край тарелки. После того, как этанол выпаривали, лежал покровные плоско на поверхности.
- Передача 10 г парафина к подходящей термостойкой стеклянной бутылке. Растопить парафин и поддерживать его при температуре около 150-200 ° С на горячей плите, по меньшей мере, 1 ч. Идеальная температура, при которой парафин должен быть нагрет может потребоваться некоторые настройки. Неидеальные температуры могут привести к затруднению получения правильного размера парафиновых шариков. Период ожидания после плавления помогает обеспечить постоянную температуру в жидкости.
- Dip пипетки Пастера в парафин, а затем быстро прикоснуться к нему до трех точек вблизи края каждого покровное (каждое пятно быть около 120 ° друг от друга). Капли затвердевают в виде шариков высоты примерно 0,3-0,5 мм и 1,0-2,0 мм в диаметреEter и будет функционировать , чтобы обеспечить пространство между нейронами на покровном и глиальный монослой ниже (рисунок 2).
- Стерилизовать посуду под УФ-светом в течение 30 мин, а затем покрывают их алюминиевой фольгой и хранить при комнатной температуре. Подготовленные покровные можно хранить и использовать в течение одного месяца. Парафиновые шарики должны иметь возможность придерживаться покровных, по крайней мере, за одну неделю до использования. Это предотвратит парафин отсоединения в течение оставшихся шагов протокола.
- Покрытие Покровные с поли-L-лизин
- Получить чашки Петри, содержащие предварительно подготовленные покровные с парафином бусинами.
- Добавляют 200 мкл поли-L-лизина в буфере бората к поверхности каждого покровного и пусть решение сесть на покровные в течение ночи под крышкой при комнатной температуре. Покрыть же поверхность, как тот, на котором расположены парафиновые шарики. Обратите внимание, что, если надлежащим образом очищены, поли-L-лизин должен легко распространятьсячтобы покрыть поверхность покровного стекла.
- После того, как один день, мыть покровные два раза путем замачивания их в стерильной деионизированной воде в течение 2 ч каждый раз. После последней промывки, замените воду с 4 мл нейронной гальванической среды на чашку. Следует отметить, что очень важно, чтобы поверхность не покровные быть дают высохнуть после того, как покрытые поли-L-лизин.
- Поместите покровную содержащую посуду в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора. Покровные с покрытием должна быть инкубировали в течение по крайней мере за 24 ч до нейрона культуры. Это делается для прайм среды для нейронов культуры.
4. Препарирование гиппокампа и плакировка Нейроны
- Получить беременные крыса (эмбриональный день 18-19, как измерено от дня обнаружения вагинальной пробки) и эвтаназии с помощью изофлурана анестезировал декапитацию или другим утвержденного метода.
- Спрей с нижней крысы с 70% -ным этанолом, а затем сделать разрез от лобковой области беспересадочныйтьфу до конца брюшной полости. Для того, чтобы избежать загрязнения, позаботьтесь, чтобы сократить только через кожу на этой стадии.
- Промыть рассечение инструменты снова с 70% -ным этанолом, а затем разрезают через брюшную стенку, чтобы выставить матку. Удалите два рога матки и помещают их в стерильную 100 Мм Петри Петри.
- Выполните остальные шаги в колпаке с ламинарным потоком. Удалите маточные мембраны, окружающей зародыши. Обезглавьте их и поместить головы в 100 Мм Петри Петри, содержащую 20 мл CMF-HBSS.
- Рассеките из мозги и сразу помещают их в 60 Мм Петри Петри, содержащие 2 мл CMF-HBSS на льду. Собирают только 2-3 мозги на чашку, чтобы обеспечить достаточное пространство для следующего шага.
- Под микроскопом рассекает стирают мозговые оболочки от средней линии полушарий головного мозга, а затем рассекает вне гиппокампа и поместить их в 60 Мм Петри Петри, содержащей 4,5 мл CMF-HBSS. Обратите внимание, что гиппокамп можно выделить в виде полумесяца STRUCдифракционная картина в медиальной поверхности коры головного мозга полушария, и легко удалить, как она граничит с боками желудочком.
- Передача собранной ткани гиппокампа и CMF-HBSS к трубе 15 мл. Добавить 0,5 мл 2,5% трипсина, а затем инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин. Папаин может быть использован вместо трипсина, потому что это мягче и может увеличить выход.
- Осторожно удалите раствор трипсина с помощью пипетки Пастера, оставляя ткань гиппокампа ненарушенной в нижней части трубы.
- Осторожно промыть ткани дважды 5 мл CMF-HBSS во время инкубации при 37 ° С в течение 5 мин. После второй промывки, довести общий объем до по крайней мере, 5 мл добавления достаточного объема CMF-HBSS к ткани. Если есть Гиппокамп из более чем 10 щенков, до 8 мл CMF-HBSS, может быть добавлен.
- Приготовьте два варианта пожарных полировки пипетки для диссоциации ткани. Кончик одного варианта является нормального диаметра пипетки, но с пожарными полировкой сглаженными краями. Другой варимуравей один с диаметром наконечника уменьшают вдвое. Кратко подвергать кончик стеклянной пипетки Пастера по диагонали к источнику пламени, а затем изучить кончики пипеток.
- Повторите этот шаг, пока край наконечника не был сглажен или диаметр был уменьшен. Важно практиковать, чтобы найти идеальный диаметр, чтобы гарантировать, что ткань диссоциируют с получением отдельных клеток без повреждения этих клеток.
- Растирают ткани гиппокампа, сначала около 10 проходов через гладкие края нормальной стеклянной пипетку Пастера, а затем еще 5 до 10 проходит через пипетку с уменьшенным диаметром. Цель состоит в том, чтобы получить гомогенный раствор клеток с отсутствием или очень мало сгустков ткани.
- Определить плотность клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Как правило, от 0,8 до 1,0 млн клеток на щенок получается, когда Гиппокамп из двух полусфер объединены.
- Передача достаточного объема клеточной суспензии к блюдамсодержащий покровные поли-L-лизин-покрытие в 4 мл среды покрытия, чтобы получить плотность гальванической 300000 клеток на 60 мм блюда. Плотность клеток может варьироваться от 100000 до 500000, в зависимости от предполагаемого эксперимента.
- Через 3-4 ч, передача покровные с нейронами, прикрепленных к блюдам, содержащим глиальные клетки в среде НБС. Это должно быть сделано таким образом, чтобы сторона, на которой высевали нейроны обращена вниз по направлению к слою глиальных клеток. Добавить в общей сложности 4-5 покровных в глии блюдо.
- Два или три дня после посева, добавляют раствор Ara-C до конечной концентрации 5 мкМ на блюдо задержать рост глии.
- Поток клетки один раз в неделю путем замены 2 мл старой среды с 2,5 мл свежей среды при каждом кормлении. Дополнительная среда добавляется, чтобы компенсировать испарение в течение долгого времени, и только часть среды изменяется, чтобы обеспечить последовательное кондиционирование среды с помощью глиальных клеток. Эти культуры, как правило, здоровы, по крайней мере, один месяц (Рисунок 3). Нейрон выживаемость может быть улучшена путем добавления APV к культуральной среде до конечной концентрации 100 мкМ. APV является антагонист рецептора NMDA, и способствует выживанию за счет снижения глутамата эксайтотоксичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом «сэндвиче» методе первичной культуры нервных клеток, нейроны гиппокампа (Рисунок 3) растут на ложе из глиальных клеток (рисунок 1) , разделенных парафиновых гранулы (рисунок 2). Это гарантирует, что нейроны избирательно растут на покровных стекла с минимальным загрязнением глиальных клеток, но получить адекватную трофическую поддержку со стороны глии, растущей на культуре ткани блюда. Как правило, нейроны можно поддерживать в культуре в течение 3 -х недель> и разрабатывать обширную арборизации с хорошо развитыми аксонов и дендритов , определенных их типичной dephospho-Tau и map2 иммуноокрашиванием, соответственно (фигура 4). Зрелые нейроны развиваются синаптические шипы, определенного путем селективной локализации постсинаптических маркеров Drebrin1 этих отсеки. Эти синаптические шипы тесно проставление в пресинаптических специализаций, которые идентифицируются синаптических везикул маркер Synapsin1 иммунным окрашиванием.близость до- и постсинаптических участков указывает на хорошо развитые и правильно выровнены синапсов. Эти первичные нейроны хорошо подходит для функциональных и структурных исследований нейронов и синапсов. Они включают, но не ограничиваются ими, исследованием сигнальной трансдукции, нейрональной полярности, субклеточной торговлей и развития синапса и пластичности.
Рисунок 1. фазового контраста изображения глиальных культур приняты 1 день, 7 дней, или 14 дней после того, как покрытие из замороженных глиальной складе. Масштаб бар, 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изображения с высоким разрешением покровных ИМред парафиновых бусин. (A, B) Примеры правильного применения парафиновые шарики. (С, D) Примеры неправильно применяемых парафиновых шариков. α: Больше чем один шарик был применен в том же месте. β: Валик не смог правильно расположен на покровном. χ: Шарик был применен слишком близко к центру покровных. δ: Гранула была слишком высока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Фазовый контраст изображения стадии развития первичных нейронов в культуре. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию гофигурное.
Рисунок 4. иммунофлуоресценция изображение первичных нейронов на 17 дней в пробирке. Нейроны фиксировали 4% формальдегида и 4% сахарозы в PBS в течение 12 мин, а затем проницаемыми 0,25% Triton X-100 в течение 5 мин. После блокирования с 10% BSA в PBS в течение 30 мин, нейроны инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами применяются в 3% BSA в PBS. Первичные антитела были использованы следующим образом: анти-синапсины Я (кролик, 1: 2000), анти-drebrin (мышь IgG1, 1: 8, клон M2F6, гибридома супернатант), анти-МАР2 (курица поликлональные IgY, 1: 5000), и анти-Тау-1 (мышь IgG, 1: 2000, клон PC1C6; распознает дефосфорилировали тау). Затем клетки промывали PBS и инкубировали с соответствующими видами или изотипа конкретных вторичных антител в 3% БСА в PBS в течение 1 ч при 37 ° С. Вторичные антитела были использованы в качестве ВОЛПминимумы: Alexa 488-конъюгированные анти-мыши IgG2a (1: 500), Alexa 568-сопряженных анти-кролика (1: 500), Alexa 647-конъюгированные анти-мышь IgG1 (1: 500), и AMCA-конъюгированные анти-курица IgY (осел IgG, 1: 200). Шкала бар, 10 мкм и 2,5 мкм, как указано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как метод «сэндвич» из культивирования нейронов был хорошо описан в другом месте 2, 11, есть несколько шагов , на протяжении протокола, которые довольно трудно описать только текст, который может привести к расстройству для исследователей , которые желают принять его.
Метод можно разделить на три основные рабочие процессы: глиальные культуры, подготовка покровной и нейрон культура и техническое обслуживание. Каждая из этих трех препаратов имеют важное значение для высококачественных нейронных культур и несколько важных соображений, следует иметь в виду. Перед покрытия нейронов глиального фидера слой в идеале должен быть гомогенным населением астроцитов и находиться в пределах 50-70% слияния. Это обеспечит достаточную трофическую поддержку со стороны глиальных фидерного слоя. Важно, чтобы убедиться, что астроглиальная культура имеет минимальное загрязнение других типов клеток, в частности, микроглии, которые свободно ATTACHED и округлые клетки. Релиз цитокины микроглии, которые вредны для здоровья нейронов и выживания 12. Сыворотка, либо лошадиная сыворотка или бычьи сывороточные роста, может варьироваться в пределах от партии к партии. Тщательный отбор нескольких партий сыворотки должны быть выполнены, прежде чем использовать конкретный много.
Покровное препарат является еще одним важным шагом. Качество стекла и протокол, используемый в его очистке имеет важное значение для здоровых хорошо развитых нейронов. Если метод быть вновь принят в лаборатории, это стоило бы испытывать покровные стекла от нескольких поставщиков. Для очистки покровные, некоторые лаборатории замочить покровные в 70% -ной азотной кислоты в течение 18-36 ч, а другие делают это только 1 ч в ультразвуковую. Важный критерий чистых покровный является то, что раствор поли-L-лизин должен распространяться равномерно на поверхности. Другим важным фактором является то, что парафиновые восковые шарики, применяемые к покровные должны быть соответствующей высоты иДиаметр и нагревают до нужной температуры, как указано в протоколе.
Для получения нейронов, гиппокамп может быть расчленен из эмбриональных дня 17-19 крыс. Хотя рассечение на этом этапе приводит к очень немногие глиальные клетки, глиальные пролиферация может быть задержан путем добавления анти-митотический агент Ara-C через 2-3 дней культуры. Растирание трипсинизированной ткани гиппокампа пожарных полировки наконечники пипеток имеет решающее значение для диссоциации ткани на отдельные клетки, не повреждая сами клетки. Нейроны среднего роста и техническое обслуживание, используемые в этом протоколе является нейробазальным + L-глютамин + В27 добавки. L-Глютамин может быть замещен GlutaMAX, который является более стабильным в культуральной среде. Качество B27 добавки может варьироваться от партии к партии, и поэтому он должен быть испытан перед использованием конкретных много для долгосрочной культуры. Бедных много В27 может привести к нейронам комок. Альтернативные продукты, такие как GS21 и SM1 были найдены, чтобы быть хорошими заменителями B27.Нейроны, выращенные дольше, чем неделю следует кормить свежей средой каждую неделю, причем третья часть среды заменяется каждую неделю.
Этот метод культивирования нервных клеток может оказаться бесценным для экспериментов, которые полагаются на чистых нейрональных популяциях практически без глиальных загрязнения. нейроны низкой плотности, выращенные с помощью этого метода, как правило, выживают в течение нескольких недель с хорошо развитыми беседками, синаптическими соединениями и сетевыми свойствами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана CIHR СС-142209 в Сомони.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
