Summary
이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.
Abstract
배양 개별 신경 세포의 구조와 생리을 프로빙하는 능력은 신경 생물학 연구에 매우 중요하고 개별적인 세포 또는 정의 된 네트워크의 유전 화학적 조작 유연성을 허용한다. 그대로 뇌 조직에 비해 조작의 이러한 편의성은 감소 된 문화 시스템에 간단하다. 이 차 신경 세포의 분리 및 성장을위한 많은 방법이 존재하지만, 각각 자신의 한계가있다. 이 프로토콜은 아교 세포의 단층 위에 부유 커버 글라스에 저밀도 및 고순도 쥐 배아 해마 신경 세포를 배양하는 방법을 설명한다. 이 '샌드위치 문화는'기본 아교 단일 층에서 영양 지원을 허용하면서 뉴런의 인구의 독점적 인 장기 성장을 할 수 있습니다. 신경 세포가 충분한 연령, 성숙도의 경우, 신경 세포의 커버 슬립은 아교 요리의 아웃을 뒤집어 및 이미징 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 뉴런 g이 방법으로 rown은 일반적으로 몇 주 동안 생존하고 광범위한 아버, 시냅스 연결 및 네트워크 속성을 개발한다.
Introduction
뇌는 신경 세포의 복잡한 네트워크로 구성되어있다. 네트워크 동작 및 뇌 기능 개별 뉴런의 기여는 자신의 분자 조성 및 생리 학적 특성의 동요를 선택적으로 변경하여 조사 할 수있다. 개별 뉴런의 유전 및 화학 조작은 후자의 세포 이질성과 복잡성에 의해 방해 그대로 뇌 조직에 비해 배양 신경 세포에서 틀림없이 더 쉽다. 배양 뉴런은 잘 정의 축삭 및 수상 아버 개발 서로 광범위한 시냅스 연결을 형성한다.
성인 동물 또는 신경계의 기타 영역에서 신경 세포 배양이 가능하지만, 배아 해마 배양 자주 정의 피라미드 세포 집단 및 상대적으로 낮은 밀도 신경교 (1, 2)로 인해 바람직하다. 배양에 저밀도로 성장 해마 뉴런이다 특히 AME세포 내 현지화, 단백질 인신 매매, 신경 극성 시냅스 개발 연구에 네이블. 배양 신경 세포는 광범위 시냅스 3, 4, 5, 6 분 방법을 연구에 사용되었다. 출생 후 생존하지 않는 글로벌 유전자 삭제와 마우스의 신경 세포 배양 준비는 특정 유전자 (7)의 세포와 시냅스 역할을 공부에 특히 유용되고있다.
뇌에서와 같이 배양 된 해마 신경 아교 세포의 영양 지원에 따라 달라집니다. 이것은 그들의 문화를 복잡하게하고,이 지원이 공급하는 여러 가지 방법의 개발을 주도하고있다. 하나의 일반적으로 사용되는 방법은 교세포 8, 취득한 HIPP로부터 오염물 교세포를 허용하는 단일 층에 직접 신경 도금 포함ocampal 조직 증식 및 신경 세포 (9) 아래에 단일 층을 형성한다. 이 방법은 약간의 성공을 발견 하였지만, 결과 신경 세포 배양의 불순물 촬상 실험 불리하다. 신경 세포 배양의 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 전체 층 폐해 급지 아웃두고 대신 정의 된 성장 배지 (10)의 형태의 영양 지원을 제공하는 것이다.
여기, 우리는 "샌드위치"또는 신경 문화 2, 11의 "은행"방법을 설명합니다. 이 방법은 파라핀 왁스 비드로 분리 아교 세포 단층 위에 부유 커버 글라스에 해마 뉴런 도금 포함한다. 이 기본 아교 단일 층에서 영양 지원을 허용하면서 아교 세포를 오염없이 뉴런의 동질적인 인구의 장기 문화를 용이하게합니다. 신경 세포가 충분한 연령, 성숙도의 경우,신경 세포의 커버 슬립은-뒤집어 밖으로 아교 요리 및 이미징 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 및 실험 동물을 사용하여 프로토콜 대학 매니토바의 동물 윤리위원회의 승인 및 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침을 준수 있었다.
악기, 완충제 및 솔루션 1. 제조
- 모든 절제 장비, 유리 파스퇴르 피펫, 피펫 팁, 필터 장치, 및 탈 이온수를 오토 클레이브에 의해 멸균한다.
- 탈 이온수 및 필터 소독에 스톡 포도당 용액,을 20 % (1.1 M / V w) 준비한다. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 탈 이온수 및 필터 소독에서 100 mM의 피루브산 나트륨 용액을 준비한다. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 준비 10 % HBSS (10 배), 10 mM의 HEPES 및 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신 탈 이온수의 용액을 만들어 칼슘 및 마그네슘이없는 행크의 균형 잡힌 염 용액 (CMF-HBSS). 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 10 ㎎ / ㎖의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I을 준비 CMF-HBSS에서 (DNase의)다음 필터링 소독하고 -20 ℃에서 보관.
- (멸균 용액)에서 30 mM의 포도당 용액함으로써 신경교 최소 필수 배지 매체 (MEM)에, 95 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신, 10-15 % 소 혈청 성장 (BGS)을 준비한다.
주 : 프로토콜에 나타낸 세포 증식을 늦추기 위해 필요한 경우 5 % BGS의 용액을 사용할 수있다. 말 혈청 대신 BGS의 사용하지만, 각 배치로 인해 간 배치 변화에 사용하기 전에 테스트해야합니다 할 수있다. 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 준비된 솔루션을 저장합니다. 많은 실험실 FBS를 사용하지만, 우리는 지속적으로 BGS의 폐해 성장 FBS에서와 같은 강력한 것을 관찰했다. BGS는 화학적 성분이 보충되는 소 태아 혈청으로부터 유도된다. 또한, BGS는 FBS보다 훨씬 더 경제적이다. - 용액함으로써 신경 세포의 성장 및 유지 매체 (로 Neurobasal-B27, NBG)를 준비 1X B27 보충제 및 500 ㎖로 Neurobasal 메디 0.5mm의 L- 글루타민음. 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오. L- 글루타민은 성장 배지에서 더 안정한 것으로 제안되었다 루타로 치환 될 수있다.
- MEM의 (살균 용액)에서 30 mM의 포도당 용액함으로써 매체 도금 뉴런 (멸균 용액으로부터), 1 mM 피루브산 나트륨, 10 % BGS를 준비한다. 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 1㎜의 시타 라빈 (아라-C)의 용액을 필터 및 소독을 준비한다. -20 ℃에서 1 mL의 부분으로 나누어 저장.
- 100 mN의 필터 - 멸균 NaOH를 100mm의 APV의 용액을 준비한다. -20 ° C에서 보관하십시오.
- 1 mg의 보레이트 완충액 / ml의 폴리 -L- 라이신, pH가 8.5 (50 mM의 붕산 및 붕사 12 밀리미터) 및 필터 소독 녹인다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 대신, 폴리 -L- 라이신, 하나는 세포 독성이 덜 수있다 폴리 -L- 오르니 틴을 사용할 수도있다.
2. 글 리아 문화 준비
- 대뇌 피질의 아스트로 글 리아 세포 배양을 준비
- 70 % 에탄올로 새끼를 스프레이하고 목을 벨.
- 15ml의 CMF-HBSS를 함유하는 얼음에 100mm의 접시 머리를 놓는다.
- 두피 절단 두개골을 열고, 뇌간을 절단 한 후 3 ㎖ CMF-HBSS를 함유하는 얼음에 60mm 페트리 접시에 뇌를 전송함으로써 각각의 뇌를 해부.
- 해마에서 대뇌를 분리하고 이들을 둘러싼 수막을 벗겨. 수막 섬유 아 세포에서 최소한의 오염을 확인하기 위해 적절한 예방 조치를 운동. 문화의 수막 섬유 아세포 성장을위한 아교와 경쟁하고 신경 세포의 건강에 유해 할 수 있습니다. 5 ㎖ CMF-HBSS를 함유하는 얼음에 60mm 페트리 접시에서 모두 대뇌 수집.
- CMF-HBSS를 제거하고 해부 스프링 마이크로 가위를 사용하여 미분 가능한 한 수집 피질 조직을 말하다.
- 들어온다 충분한 CMF-HBSS 추가PED 조직. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15 ㎖의 튜브에 조직 조각을 전송. CMF-HBSS를 첨가하여 12 mL의에 전량을 가지고.
- 1.5 mL의 2.5 % 트립신 및 10 ㎎ / ㎖ DNase의 용액을 각각 추가한다. 12 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 생성 된 혼합물을 인큐베이션.
- 티슈를 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 ~ 15 회 연화 처리하고, 추가로 3 분 동안 37 ° C의 수조에서 부화.
- 렌즈 용지 나 BGS 5 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 메쉬 필터를 통해 상청액을 필터. 이것은 해리되지 않은 조직의 덩어리를 제거하기위한 것입니다. 또한, 상업적으로 이용 가능한 세포 여과기를 사용합니다.
- 나머지 조직 조각을 함유하는 튜브에 CMF-HBSS 2.5 % 트립신, 1.5 mL를 135 mL를 추가하고 상기 추가의 10 분 동안 수욕에서 37 ℃로 배양한다.
- 한번 더 잔여 조직을 연화 처리하고, 초기 여과 액을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 다시 현탁 필터. 다음, 린스 르BGS의 3 ㎖와 NS 종이. 최종 부피는 약 38 mL로해야한다.
- 원심 분리기 (130)의 X g에서 6 분 동안 해리 아교 세포를 포함하는 현탁액. 조심스럽게 유리 파스퇴르 피펫을 이용하여 상층 액을 버린다. 하단의 펠렛 세포가 방해되지 않도록해야합니다. 펠렛의 바닥은 혈액 성분을 포함하는 약간 붉은 빛을 띤 나타납니다.
- 펠렛의 적색 부분을 방해하지 않도록주의하면서, 새로운 튜브에 폐해 배지 1 ㎖에 아교 세포 이동.
- 신경교 세포 해리 조합 재 부유 강아지 당 신경교 배지 2ml를까지 추가한다. 예를 들어, 10 새끼 사용한 후 부유 총 부피 20 ㎖ 것이다.
- 새끼 당 75cm 2 세포 배양 플라스크를 준비한다. 각각의 플라스크에 18 mL의 예열 폐해 매체를 추가한다.
- 전송 2 각 플라스크에 세포 현탁액 mL의 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양한다.
- 하루가 지난 후에도, 20 ㎖의 폐해를 m으로 대체edium. 이 단계에서, 문화는 아교 및 기타 원치 않는 세포 유형의 혼합이다.
- 나흘 세포를 파종 한 후, 적극적으로 비 성상 세포의 세포를 꺼 내려 플라스크를 흔들. 이 작업을 수행하려면, CMF-HBSS 한 번 플라스크를 헹군 다음 각 플라스크에 10 mL의 신선한 CMF-HBSS를 추가합니다. 적극적으로 5-10 번 플라스크를 흔들어 다음 CMF-HBSS를 대기음. CMF-HBSS 회 헹군 다음 20 ㎖를 추가 폐해 매체.
참고 :이 단계는 비 표적 세포 유형의 제거를 확인하는 것이 중요하며, 원하는 성상 세포의 손실이 발생하지 않아야합니다. - 세포가 합류 (그림 1) 때까지 일주일에 두 번 신선한 아교 매체로 교체하십시오.
- 냉동 아교 세포
- 배양 물이 컨 플루 언트되면, 배지를 흡인하고 10 ㎖ CMF-HBSS로 세포 단층을 세척한다.
- 각 플라스크에 0.25 % 트립신 / EDTA 10 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 탭 플라스크는 부드럽게 셀을 제거합니다. 1 mL의 BGS의 t 추가O 각 플라스크에 15 개 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 6 분 동안 130 XG에서 튜브를 원심 분리기. 얻어진 상층 액을 제거한다.
- 2ml의 폐해 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 아교 동결 배지 (1 부, 디메틸 설폭 사이드, 4 BGS 부품)을 준비한다. 플라스크 당 4 개 극저온 튜브 각각이 용액 0.5 mL를 넣고.
- 각 바이알에 세포 현탁액 0.5 mL를 전송하고 밤새 -80 ° C에 냉동 절연 용기에 튜브를 삽입하여 서서히 세포를 동결. 하루가 지난 후에도 장기간 저장을 위해 액체 질소로 냉동 바이알 옮긴다.
- 도금 아교 세포를 부활
- 플레이트 아교 세포 뉴런 문화 전날 1~2주.
- 가하여 가온 신경교 매체 (10)와 한 50㎖ 튜브를 준비한다.
- 2-3 분 동안 37 ℃의 수욕 신경교 1 냉동 바이알을 해동.
- 10 ㎖ 폐해 배지를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 바이알의 내용물을 이동.
- 원심 분리기상청액 오프 5 분에서 130 XG 및 기음에 대한 E 튜브.
- 20 ㎖ 폐해 매체 펠렛을 재현 탁.
- 배양 접시 (60mm)의 각각에 3 mL의 신선한 배지 폐해를 추가 한 후 각 접시에 세포 현탁액 1 ㎖를 옮긴다. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 물을 인큐베이션.
- 일주일에 두 번 세포를 공급. 세포 밀도가 50 % 합류도 전 신경 배양 일 도달하면, 아교 성장 속도를 늦추기 위해 5 % BGS 함유 폐해 매체로 전환. 70 % - 신경 세포 배양 용 아교 단층의 목적은 50 % 합류점이다.
- 1-2 일 신경 세포 배양 전에 NBG 배지 아교 매체 (6 ㎖ / 접시) 대체.
3. 커버 슬립 제조
- 청소 및 파라핀 비즈의 준비
- 실온에서 30 분 동안 초음파 처리들을 : (부식성주의 70 % 중량 / 중량), 농축 질산 커버 슬립을 담근다. 다른 실험실 f를했습니다운드, 그것은 유익 대신 상온에서 12-24 시간 동안 세라믹 랙에 70 % 질산의 커버 슬립을 배양.
- 조심 기관 가이드 라인에 따라 지정 화학 퓸 후드에서 질산을 버린다. 커버 슬립을 탈 이온수로 3-5 회 헹군다.
- (대안 적 방법에 따라 이동하는 경우), 탈 이온수의 커버 슬립을 담그고, 30 분 동안 다시 초음파 처리.
- 탈 이온수를 제거하고 커버 슬립 또 다른 세 번 씻어.
- 50 ㎖의 탈 이온수에 담그고 커버 슬립을 오토 클레이브에 의해 멸균들을. 대안으로, 6 시간 동안 오븐에서 225 ° C에서 커버 슬립 살균. 이 대체 방법을 사용하는 경우, 3.1.9 단계로 건너 뜁니다.
- 멸균 후, 다음 단계를 위해 멸균 층류 후드로 커버 슬립을 전송.
- 탈 이온수를 제거하고 100 % 에탄올을 20-30 mL로 헹군다.
- 100 % 에탄올 20 ~ 30 mL의를 추가하고 커버 슬립을 전송하고100mm의 배양 접시에 에탄올.
- 60mm 페트리 접시, 접시 당 4-5 커버 슬립에 커버 슬립을 전송 한 다음 접시의 가장자리에 커버 슬립을 기대어에 의해 공기 건조에 할 수 있도록 무딘 핀셋을 사용합니다. 에탄올이 증발되면, 표면에 커버 슬립 평면 누워.
- 적합한 내열성 유리 병에 10g 파라핀 전송. 파라핀을 녹이고, 적어도 1 시간 동안 핫 플레이트상에서 약 150-200 ℃에서 그것을 유지한다. 파라핀은 가열되어야하는 최적 온도는 약간의 조정을 취할 수있다. 비 이상적인 온도는 파라핀 구슬의 정확한 크기를 생산 어려움을 초래할 수 있습니다. 용해 후 대기 기간은 액체에 걸쳐 일관된 온도를 확인하는 데 도움이됩니다.
- (각 지점은 약 120 ° 떨어져있는) 각 커버 슬립의 가장자리 근처에 세 개의 지점을 만지지 빠르게 후 파라핀에 파스퇴르 피펫을 찍어합니다. 방울은 약 0.3 mm 높은 구슬과 DIAM에서 1.0 ~ 2.0 mm로 확고히 할 것이다eter는 커버 슬립의 뉴런 및 신경교 아래 단층 (도 2) 사이의 공간을 제공하는 기능을하며.
- 30 분 동안 UV 광 아래에서의 요리를 소독 한 다음, 실온에서 알루미늄 박 및 저장소로 커버. 준비 커버 슬립 저장 1 개월까지 사용할 수 있습니다. 파라핀 비즈를 사용하기 전에 적어도 한 주 동안 커버 슬립을 준수 할 수 있어야합니다. 이 프로토콜의 나머지 단계에서 분리에서 파라핀을 방지 할 수 있습니다.
- 폴리 - L - 라이신과 코팅 Coverslips는
- 파라핀 구슬 이전에 준비 커버 슬립을 포함하는 페트리 접시를 가져옵니다.
- 각 커버 슬립의 표면을 붕산염 완충액 폴리 L 리신 200 μL를 첨가하고 용액을 실온에서 덮여 밤새 커버 슬립에 앉게. 코트 파라핀 비즈가 위치되는 것과 같은 표면. 제대로 청소되면, 폴리 -L- 라이신 쉽게 전파해야합니다커버 슬립의 표면을 커버한다.
- 후 하루 2 시간 동안 각각 멸균 증류수에 담가들을 커버 슬립 번 씻는다. 최종 세척 후, 접시 당 신경 도금 배지 4 ㎖의 물을 대체. 없는 커버 슬립의 표면을 폴리 -L- 리신으로 코팅 된 후 건조되도록하는 것이 중요합니다.
- 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 커버 슬립 함유 음식을 놓는다. 코팅 된 커버 슬립은 신경 세포 배양하기 전에 적어도 24 시간 동안 배양한다. 이는 신경 세포 배양을위한 주요 매체로 이루어집니다.
해마와 도금 뉴런 4. 해부
- (질 플러그 발견 한 날로부터 측정 된 배아 일 18-19) 임신 한 쥐를 얻 및 이소 플루 란 - 마취 잘린 또는 기타 승인 된 방법으로 안락사.
- 70 % 에탄올로 쥐의 하부 스프레이하고 음부 죽로부터 절개복강 끝에 우. 오염을 방지하기 위해, 단지이 단계에서 피부를 통해 잘라주의해야합니다.
- 70 % 에탄올로 다시 해부 악기를 씻어하고 자궁을 노출 복부 벽을 통해 잘라. 두 자궁 뿔을 제거하고 살균 100mm 배양 접시에 배치합니다.
- 층류 후드의 나머지 단계를 수행합니다. 태아를 둘러싸고있는 자궁 막을 제거합니다. 이를 20 mL의 참살 CMF-HBSS를 함유하는 100mm 배양 접시에서 머리를 놓는다.
- 뇌를 절개 즉시 얼음에 2ml의 CMF-HBSS를 함유하는 60mm 페트리 접시에 배치. 다음 단계에 대한 충분한 공간을 확보하기 위해 접시 당 2 ~ 3 뇌를 수집합니다.
- 해부 현미경 대뇌 반구의 중심선에서 수막을 벗겨하고 해마를 해부하고 4.5 mL의 CMF-HBSS를 함유하는 60mm 페트리 접시에 배치. 해마는 초승달 모양의 struc로 구분 될 수 있습니다대뇌 반구의 내측 표면에, 한시간하고는 심실로 횡 접경로 제거하기 쉽다.
- 15 ㎖의 튜브에 수집 된 해마 조직 및 CMF-HBSS를 옮긴다. 2.5 % 트립신 0.5ml를 추가 한 후 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 이 완만하고 수율을 증가시킬 수 있기 때문에 파파인 대신 트립신을 사용할 수있다.
- 조심스럽게 튜브의 하단에 방해받지 해마 조직을 떠나는 파스퇴르 피펫으로 트립신 용액을 제거한다.
- 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하면서 천천히 5 ㎖ CMF-HBSS 회 조직을 세척 하였다. 두번째 세척 한 후, 조직을 CMF-HBSS의 충분한 부피를 첨가하여 적어도 5 ㎖를 전량을 가져온다. 최대 8 이상 10 새끼에서 해마가있을 경우 용액 CMF-HBSS를 첨가 할 수있다.
- 조직 분리를위한 화재 광택 피펫의 두 가지 변종을 준비합니다. 하나의 변형의 끝은 피펫하지만 화재 - 연마 부드러워 가장자리 정상적인 직경이다. 다른 VARI개미 반감 선단 직경이다. 간단히 화염 소스 대각선 유리 파스퇴르 피펫의 선단을 노출 한 후 피펫 팁을 조사한다.
- 선단 에지가 평활화되었다거나 직경이 감소 될 때까지이 과정을 반복한다. 조직이 이러한 세포를 손상시키지 않고 단일 세포를 산출하기 위해 해리 될 수 있도록 최적의 직경을 찾아 실천하는 것이 중요하다.
- 매끄러운 가장자리 통상 유리 파스퇴르 피펫을 통해 제 10 패스하여 해마 조직을 연화 처리하고, 직경 감소와 피펫이어서 추가 5 내지 10 통과한다. 목표는 아니오 세포 또는 거의 조직 덩어리의 균일 한 용액을 제조하는 것입니다.
- 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정한다. 두 반구에서 해마가 결합 될 때 통상, 강아지 당 80 만 내지 1.0 세포가 얻어진다.
- 접시에 세포 현탁액의 충분한 양을 전송60mm 접시 당 300,000 세포의 도금 밀도를 얻을 수 평판 배지 4 mL의 폴리 -L- 리신 - 코팅 된 커버 슬립을 함유. 세포의 밀도는 의도 된 실험에 따라 10 만에서 50 만까지 다양 할 수 있습니다.
- 3-4 시간 후, NBG 매체에 아교 세포를 포함하는 접시에 부착 된 커버 슬립 뉴런으로 옮긴다. 이는 신경 세포 도말 된면이 아래 아교 세포 층쪽으로 향하도록 할 것이다. 아교 접시 당 4-5 커버 슬립의 총을 추가합니다.
- 2 ~ 3 일 도금 후, 아교 세포 성장을 체포 접시 당 5 μM의 최종 농도 아라-C 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 각 먹이에 새로운 배지 2.5 mL로 된 매체의 2 mL로 교체하여 일주일에 한 번 세포를 공급. 추가 여분 매체는 시간이 지남에 증발을 보상하기 위해, 그리고 중간 부분 만이 아교 세포 배지의 일관된 조절을 위해 변경된다. 이러한 문화는 (적어도 한 달 동안 일반적으로 건강그림 3). 신경 생존은 100 μM의 최종 농도로 배양 배지에 APV를 첨가함으로써 개선 될 수있다. APV는 NMDA 수용체 길항제이며, 글루탐산 흥분 독성을 줄여 생존을 촉진합니다.
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Representative Results
주 신경 세포 배양액의 "샌드위치"방법에있어서, 해마 신경 세포 (도 3) 파라핀 비드 (도 2)에 의해 분리 된 아교 세포 (도 1)의 침대에 성장한다. 이 신경 세포가 선택적으로 최소한의 아교 세포 오염 커버 글라스에 성장하지만, 조직 배양 접시에 성장 교세포에서 적절한 영양 지원을받을 것을 보장한다. 일반적으로, 뉴런> 3주위한 배양 유지 및 그들의 일반적인 데포 스포 타우 및 MAP2 면역 각각 (도 4)에 의해 식별 잘 발달 축삭 및 수상 돌기로 광범위한 arborisation 개발 될 수있다. 성숙한 신경이 구획 시냅스 마커 Drebrin1 선택적 제이션에 의해 식별 시냅스 등뼈를 개발한다. 이 시냅스 쪽이 밀접하게 시냅스 소포 마커 Synapsin1 면역 염색에 의해 식별되는 시냅스 전문에 나란히 놓이는된다. 그만큼사전 및 시냅스 사이트의 근접 잘 발달 표시하고 정확하게 시냅스를 정렬됩니다. 이러한 차 뉴런과 시냅스 신경 세포의 구조와 기능 연구를 위해 적합하다. 이들은 다음을 포함하지만, 신호 전달, 신경 극성 세포 내 피킹 및 시냅스 가소성의 개발 및 연구에 한정되지 않는다.
아교 문화 그림 1. 위상 콘트라스트 이미지는 냉동 아교 재고에서 도금 후, 1 일 7 일 또는 14 일 촬영. 스케일 바, 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 커버 슬립을 위해 준비 할 2. 고해상도 이미지파라핀 비즈 에디션. (A, B)가 제대로로서는 파라핀 비드를 적용 하였다. (C, D)를 잘못인가 파라핀 비드의 예. α : 하나 이상의 비드는 동일한 위치에 도포 하였다. β : 비드 제대로 커버 슬립에 위치 할 못했습니다. χ : 비드는 커버 슬립의 중심에 너무 가까이 적용되었다. δ : 비드가 너무 높았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 문화 주 뉴런의 발달 단계의 3 단계 대비 이미지. 스케일 바, 100 μm의. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.
그림 체외 17 일째 차 뉴런의 4. 면역 형광 이미지. 뉴런은 12 분 동안 PBS 중의 4 % 포름 알데히드 및 4 % 자당과 고정 후 5 분간 0.25 % 트리톤 X-100으로 투과 화 하였다. 일차 항체를 PBS에서 3 % BSA에 적용하여, 30 분 동안 PBS 중 10 %의 BSA로 블로킹 한 후, 신경 세포는 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 다음과 같이 차 항체를 사용 하였다 : 안티 - synapsin I (토끼, 1 : 2,000), 안티 - drebrin (마우스의 IgG1, 1 : 8, 복제 M2F6, 하이 브리 도마 상층 액), 안티 MAP2 (닭 클론 IGY, 1 : 5,000) 및 안티 타우-1 (마우스의 IgG2a, 1 : 2,000, 복제 PC1C6는, 탈 인산화 타우 인식). 세포는 PBS로 세척하고, 37 ° C에서 1 시간 동안 PBS 중의 3 % BSA 적절한 종 또는 이소 특이 이차 항체로 인큐베이션 하였다. 이차 항체는 사용 FOL 같고최저 : 알렉사 항 마우스 IgG2a의 (1 : 500) 488 - 복합, 알렉사 568 - 복합 항 - 토끼 (1 : 500), 알렉사 647 - 복합 항 마우스의 IgG1 (1 : 500), 및 AMCA - 복합 안티 - 닭 IGY (당나귀의 IgG, 1 : 200). 스케일 바 바와 같이 10 ㎛ 내지 2.5 ㎛의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
배양 신경 세포의 "샌드위치"방법은 다른 곳에서 잘 설명 하였지만 2, 11, 그것을 채택하고자하는 연구자에 대한 불만으로 이어질 수 있습니다 만 텍스트를 설명하는 것은 매우 어려운 프로토콜에 걸쳐 여러 단계가있다.
아교 문화, 커버 슬립 준비 및 신경 세포의 문화 및 유지 보수 :이 방법은 세 가지 흐름으로 나눌 수 있습니다. 세 가지 준비 각각 염두에 보관해야합니다 높은 품질의 신경 세포 문화와 몇 가지 중요한 고려 사항에 대한 중요합니다. 신경 세포를 도금하기 전에, 아교 피더 층은 이상적으로 성상 세포의 균일 한 인구해야 50 내지 70 %의 합류 사이. 이는 아교 세포층에서 충분한 영양 지원을 보장합니다. astroglial 배양 ATTAC 느슨하게 다른 세포 형태, 특히 미세 아교 세포의 최소한의 오염을 갖는 것이 중요을 Hed 둥근 세포. 신경 세포의 건강과 생존 (12) 해로운 미세 아교 세포 릴리스 사이토 카인,. 혈청, 중 말 혈청 또는 소 성장 혈청, 많은에 많은에서 변수가 될 수 있습니다. 혈청의 여러 많은주의 깊게 검사는 특정 많이 사용 결정하기 전에 수행해야합니다.
커버 슬립 준비는 또 다른 중요한 단계입니다. 유리와의 세척에 사용되는 프로토콜의 질은 건강하게 잘 발달 된 신경 세포에 중요하다. 메소드가 새롭게 실험실에서 채택되는 경우, 여러 공급 업체로부터 커버 글라스를 테스트 할 가치가있을 것입니다. 다른 소니 케이 터에서 1 시간 동안 만 그렇게하면서 커버 슬립의 청소를 들어, 일부 실험실은 18-36 시간 동안 70 % 질산에 침지 커버 슬립. 깨끗한 커버 슬립의 중요한 기준은 폴리 -L- 라이신 용액이 표면에 균일하게 분산되어야한다는 것이다. 또 다른 중요한 고려 사항은 커버 슬립에인가되는 파라핀 왁스 비드 적절한 높이하고 있어야한다는 것이다프로토콜에 명시된 직경은 적당한 온도로 가열한다.
신경 세포를 얻기 위해, 해마는 배아 일 17-19 쥐 해부 할 수 있습니다. 이 단계에서 해부가 거의 신경 교세포에 이르게하지만, 아교 확산은 문화 2-3 일 후에 항 유사 분열 에이전트 아라-C를 추가하여 체포 할 수있다. 화재 광택 피펫 팁에 의한 트립신 해마 조직의 연화는 세포 자체를 손상시키지 않고 각각의 세포로 조직을 떼어 놓다하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 신경 세포의 성장과 유지 보수 매체로 Neurobasal + L 글루타민 + B27 보충제입니다. L- 글루타민은 배양 배지에서 더 안정한 루타 의해 치환 될 수있다. B27 보충제의 품질은 많이에서 많이 다를 수 있습니다, 그래서 그것은 장기적으로 문화에 대한 특정 많이 사용하기 전에 테스트해야합니다. B27의 가난한 많은 신경 세포가 응집 될 수 있습니다. 같은 GS21 및 SM1과 같은 대체 제품은 B27 좋은 대체 것으로 밝혀졌다.매체의 세 번째는 매주 교체되는 것을 특징으로하는 이상 주 동안 성장 뉴런은 매주 신선한 배지로 공급되어야한다.
신경 세포를 배양하는이 방법은 거의 또는 전혀 아교 오염 순수 신경 인구에 의존하는 실험에 귀중한 증명할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 성장 저밀도 뉴런은 일반적으로 잘 발달 된 아버, 시냅스 연결 및 네트워크 속성과 함께 몇 주 동안 생존.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 CIHR의 MOP-142209 TJS에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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