Summary
यह लेख कम घनत्व प्राथमिक हिप्पोकैम्पस एक glial monolayer पर उल्टे कांच coverslips पर बढ़ रही न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। न्यूरॉन और glial परतों पैराफिन मोम मोती से अलग होती है। इस विधि की वृद्धि हुई न्यूरॉन्स उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग और कार्यात्मक assays के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
संस्कृति में संरचना और व्यक्तिगत तंत्रिका कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने की क्षमता तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, और व्यक्तिगत कोशिकाओं या परिभाषित नेटवर्क के आनुवंशिक और रासायनिक हेरफेर में लचीलेपन के लिए अनुमति देता है। जब बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में हेरफेर के इस तरह के आराम कम संस्कृति प्रणाली में सरल है। जबकि अलगाव और इन प्राथमिक न्यूरॉन्स के विकास के लिए कई तरीके मौजूद हैं, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं। यह प्रोटोकॉल कांच coverslips, जो तब glial कोशिकाओं की एक monolayer से अधिक निलंबित कर रहे हैं पर कम घनत्व और उच्च शुद्धता कृंतक भ्रूण हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन है। यह 'सैंडविच संस्कृति' न्यूरॉन्स की आबादी के अनन्य दीर्घकालिक विकास, जबकि अंतर्निहित glial monolayer से पौष्टिकता संबंधी सहायता के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देता है। न्यूरॉन्स पर्याप्त उम्र या परिपक्वता के स्तर के होते हैं, तो न्यूरॉन coverslips फ़्लिप बाहर किया जा सकता है glial पकवान की और इमेजिंग या कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया। न्यूरॉन्स जीइस विधि द्वारा rown आम तौर पर कई हफ्तों के लिए जीवित रहते हैं और व्यापक arbors, synaptic कनेक्शन, और नेटवर्क गुण का विकास।
Introduction
मस्तिष्क न्यूरॉन्स के जटिल नेटवर्क में आयोजित किया जाता है। नेटवर्क गतिविधि और मस्तिष्क समारोह के लिए अलग-अलग न्यूरॉन्स के योगदान उनके आणविक संरचना और उनकी शारीरिक गुणों की perturbance के चुनिंदा परिवर्तन द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की आनुवंशिक और रासायनिक हेरफेर बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में यकीनन आसान है, बाद के सेलुलर विविधता और जटिलता द्वारा अभारग्रस्त है। संस्कृति में न्यूरॉन्स अच्छी तरह से परिभाषित axonal और वृक्ष के समान arbors को विकसित करने और एक दूसरे के साथ व्यापक synaptic कनेक्शन के रूप में।
जबकि वयस्क जानवरों से या तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों से न्यूरॉन संस्कृति संभव है, भ्रूण हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों अक्सर उनके परिभाषित पिरामिड सेल आबादी और अपेक्षाकृत कम glial घनत्व 1, 2 की वजह से पसंद किया जाता है। हिप्पोकैम्पस संस्कृति में कम घनत्व से वृद्धि हुई न्यूरॉन्स विशेष रूप से एएमई हैंsubcellular स्थानीयकरण, प्रोटीन की तस्करी, न्यूरोनल polarity और अन्तर्ग्रथन विकास के अध्ययन के लिए nable। संस्कृति में न्यूरॉन्स भी बड़े पैमाने पर अन्तर्ग्रथनी plasticity 3, 4, 5, 6 में आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में नियोजित किया गया है। वैश्विक आनुवंशिक विलोपन कि postnatally जीवित नहीं है के साथ चूहों से न्यूरॉन संस्कृति की तैयारी कुछ जीनों 7 के सेलुलर और synaptic भूमिकाओं का अध्ययन करने में विशेष रूप से उपयोगी किया गया है।
मस्तिष्क में के रूप में, सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं से पौष्टिकता समर्थन पर निर्भर हैं। यह उनकी संस्कृति पेचीदा हो, और कई अलग अलग तरीके है जिसके द्वारा इस समर्थन आपूर्ति की है के विकास के लिए प्रेरित किया है। एक आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि सीधे न्यूरॉन्स चढ़ाना glial कोशिकाओं 8, या प्राप्त हिप से दूषित पदार्थों को glial कोशिकाओं की इजाजत दी की एक monolayer पर शामिलocampal ऊतक पैदा करना और न्यूरॉन्स 9 के नीचे एक monolayer फार्म करने के लिए। इस विधि कुछ सफलता मिली है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरोनल संस्कृति की अशुद्धता इमेजिंग प्रयोगों के लिए हानिकर है। न्यूरॉन संस्कृति का एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि छोड़ आउट करने के लिए glial फीडर पूरी तरह परत और इसके बदले एक परिभाषित विकास माध्यम 10 के रूप में पौष्टिकता संबंधी सहायता प्रदान करता है।
यहाँ, हम "सैंडविच" या न्यूरॉन संस्कृति 2, 11 के "बैंकर" विधि का वर्णन। इस विधि कांच coverslips, जो तब पैराफिन मोम मोती द्वारा अलग glial कोशिकाओं की एक monolayer से अधिक निलंबित कर रहे हैं पर हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स चढ़ाना शामिल है। यह glia contaminating जबकि अंतर्निहित glial monolayer से पौष्टिकता संबंधी सहायता के लिए अनुमति के बिना न्यूरॉन्स की एक समरूप जनसंख्या का लंबे समय तक संस्कृति की सुविधा। न्यूरॉन्स पर्याप्त उम्र या परिपक्वता के स्तर के होते हैं,न्यूरॉन coverslips फ़्लिप बाहर किया जा सकता है glial पकवान की और इमेजिंग या कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया।
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Protocol
सभी प्रयोगों और प्रयोगशाला पशुओं का उपयोग प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय मैनीटोबा के पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित और पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशानिर्देशों के अनुरूप थे।
1. उपकरण, बफ़र और समाधान की तैयारी
- सभी विच्छेदन उपकरण, कांच पाश्चर pipettes, विंदुक युक्तियाँ, फिल्टर उपकरण, और विआयनीकृत जल autoclaving द्वारा नसबंदी।
- विआयनीकृत जल और फिल्टर बाँझ में शेयर ग्लूकोज समाधान, एक 20% (1.1 एम w / v) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- विआयनीकृत जल और फिल्टर बाँझ में 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- तैयार कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त हांक संतुलित नमक समाधान (सीएमएफ-HbSS) 10% HBSS (10x), 10 मिमी HEPES, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन विआयनीकृत जल में का एक समाधान बनाने के द्वारा। से अधिक नहीं 1 से 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करें।
- 10 मिलीग्राम / एमएल deoxyribonuclease तैयार मैं सीएमएफ-HBSS में (DNase),और उसके बाद से फिल्टर-नसबंदी और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
- (बाँझ समाधान से) 30 मिमी ग्लूकोज का एक समाधान बनाकर glial मध्यम, 95 यू / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10-15% गोजातीय वृद्धि न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) में सीरम (BGS) तैयार करें।
नोट: के रूप में प्रोटोकॉल में संकेत दिया, 5% BGS का एक समाधान है, तो कोशिका प्रसार को धीमा करने के लिए आवश्यक हो सकता है। हार्स सीरम BGS के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है, लेकिन ध्यान दें कि प्रत्येक बैच अंतर-बैच परिवर्तन के कारण उत्पन्न उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। से अधिक नहीं 1 से 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार समाधान स्टोर। हालांकि कई प्रयोगशालाओं एफबीएस उपयोग करें, हम लगातार मनाया BGS में glial विकास एफबीएस में के रूप में के रूप में मजबूत है। BGS भ्रूण बछड़ा सीरम जो रासायनिक परिभाषित घटकों के साथ पूरक है से ली गई है। इसके अलावा, BGS एफबीएस की तुलना में काफी अधिक किफायती है। - का एक समाधान बनाकर न्यूरॉन विकास और रखरखाव मध्यम (Neurobasal-B27, NBG) तैयार करें 1x B27 पूरक और 0.5 मिमी 500 एमएल Neurobasal मेडी में L-Glutamineउम। से अधिक नहीं 1 से 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करें। L-Glutamine GlutaMAX है, जो विकास का माध्यम में स्थिर माना सुझाव दिया गया है के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
- न्यूरॉन (बाँझ समाधान से) 30 मिमी ग्लूकोज का एक समाधान बनाकर मध्यम चढ़ाना, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट (बाँझ समाधान से), और 10% BGS सदस्य में तैयार करें। से अधिक नहीं 1 से 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करें।
- 1 मिमी Cytarabine (आरा-सी) के घोल और फिल्टर बाँझ तैयार करें। 1 एमएल भागों में विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- 100 करोड़ फिल्टर-निष्फल NaOH में 100 मिमी APV का एक समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- 1 मिलीग्राम / एमएल borate बफर में पाली एल लाइसिन, पीएच 8.5 (50 मिमी बोरिक एसिड और 12 मिमी बोरेक्स) और फिल्टर बाँझ भंग। विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। पाली एल लाइसिन के बजाय, एक पाली एल ओर्निथिन जो कम कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है का उपयोग कर सकते हैं।
2. Glia संस्कृति तैयारी
- cortical अस्थिकणिका सेल संस्कृति तैयार
- 70% इथेनॉल के साथ पिल्ले स्प्रे और उन्हें सिर काटना।
- 15 एमएल सीएमएफ-HBSS युक्त बर्फ पर एक 100 मिमी डिश में सिर रखें।
- , खोपड़ी काटने खोपड़ी खोलने, brainstem विच्छेद, और फिर 3 एमएल सीएमएफ-HBSS युक्त बर्फ पर 60 म पेट्रि डिश के लिए मस्तिष्क स्थानांतरित करके प्रत्येक मस्तिष्क बाहर काटना।
- हिप्पोकैम्पस से मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग करें और फिर उन्हें आसपास के मेनिन्जेस दूर पट्टी। पर्याप्त एहतियात व्यायाम मस्तिष्कावरणीय fibroblasts से कम से कम प्रदूषण सुनिश्चित करने के लिए। संस्कृति में मस्तिष्कावरणीय fibroblasts विकास के लिए glia के साथ प्रतिस्पर्धा और न्यूरॉन स्वास्थ्य के लिए हानिकारक हो सकता है। 5 एमएल सीएमएफ-HBSS युक्त बर्फ पर एक 60 म पेट्रि डिश में सभी मस्तिष्क गोलार्द्धों इकट्ठा।
- सीएमएफ-HBSS निकालें और फिर माइक्रो चीर-फाड़ वसंत-कैंची का उपयोग कर सूक्ष्मता के रूप में संभव के रूप में एकत्र cortical ऊतक कीमा।
- काट करने के लिए पर्याप्त सीएमएफ-HBSS जोड़ेंped ऊतक। एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक 15 एमएल ट्यूब ऊतक टुकड़े हस्तांतरण। सीएमएफ-HBSS जोड़कर 12 एमएल के लिए कुल मात्रा ले आओ।
- 1.5 एमएल 2.5% ट्रिप्सिन और 10 मिलीग्राम / एमएल DNase समाधान के प्रत्येक जोड़े। 12 मिनट के लिए एक जल स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त मिश्रण सेते हैं।
- ऊतक Triturate एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग कर 10-15 गुना, और आगे 3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में यह सेते हैं।
- लेंस कागज या BGS 5 एमएल युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक फिल्टर जाल के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर। यह undissociated ऊतक का हिस्सा दूर करने के लिए किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल छलनी का उपयोग करें।
- सीएमएफ-HBSS और 2.5% ट्रिप्सिन के 1.5 एमएल के 13.5 एमएल शेष ऊतक टुकड़ों से युक्त ट्यूब में जोड़े और आगे एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए एक जल स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं।
- एक बार फिर शेष ऊतक Triturate, और फिर प्रारंभिक छानना युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब में फिर से निलंबन फ़िल्टर करें। इसके बाद, कुल्ला leBGS के 3 एमएल के साथ एनएस कागज। अंतिम मात्रा लगभग 38 एमएल होना चाहिए।
- अपकेंद्रित्र निलंबन से कम 130 x जी 6 मिनट के लिए अलग glial कोशिकाओं से युक्त। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग कर त्यागें। सुनिश्चित करें कि तल पर pelleted कोशिकाओं परेशान नहीं कर रहे हैं। गोली के नीचे थोड़ा रक्त घटकों से युक्त लाल दिखाई देता है।
- एक ताजा ट्यूब में glial माध्यम के 1 एमएल में glial कोशिकाओं स्थानांतरण, देखभाल करने के गोली के लाल भाग को परेशान नहीं।
- ऊपर पिल्ला प्रति glial माध्यम की 2 एमएल में जोड़े फिर से निलंबित करने के लिए glial कोशिकाओं अलग संयुक्त। उदाहरण के लिए यदि 10 पिल्ले का उपयोग किया गया है, और फिर कुल मेजबान मात्रा 20 एमएल होगा।
- पिल्ला प्रति एक 75 सेमी 2 सेल संस्कृति कुप्पी तैयार करें। प्रत्येक फ्लास्क में 18 एमएल पूर्व गर्म glial माध्यम जोड़ें।
- स्थानांतरण प्रत्येक कुप्पी के लिए सेल निलंबन की 2 एमएल और एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- एक दिन बाद, 20 एमएल glial मीटर के साथ बदलेंedium। इस स्तर पर, संस्कृति glial और अन्य अवांछित सेल प्रकार के एक मिश्रण है।
- चार दिन कोशिकाओं बोने के बाद, सख्ती गैर तारिकाकोशिका कोशिकाओं को हटाने के लिए बोतल हिला। ऐसा करने के लिए, सीएमएफ-HBSS के साथ एक बार बोतल कुल्ला, और फिर प्रत्येक फ्लास्क करने के लिए 10 एमएल ताजा सीएमएफ-HBSS जोड़ें। सख्ती बोतल हिला 5-10 गुना, और फिर सीएमएफ-HBSS बंद aspirate। सीएमएफ-HBSS के साथ दो बार कुल्ला, और फिर 20 एमएल glial मध्यम जोड़ें।
नोट: यह कदम गैर लक्ष्य प्रकार की कोशिकाओं को हटाने सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इच्छित astrocytes की हानि नहीं करना चाहिए। - एक सप्ताह ताजा glial मध्यम दो बार के साथ बदलें जब तक कोशिकाओं संगामी (चित्रा 1) कर रहे हैं।
- बर्फ़ीली glia
- एक बार जब संस्कृतियों मिला हुआ हैं, मध्यम बंद aspirate और 10 एमएल सीएमएफ-HBSS के साथ सेल monolayer धोएं।
- प्रत्येक फ्लास्क को 0.25% ट्रिप्सिन / EDTA के 10 एमएल जोड़ें और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- नल बोतल धीरे कोशिकाओं को हटाने के लिए। 1 एमएल BGS टी जोड़ेओ प्रत्येक फ्लास्क और 15 एमएल ट्यूबों में सेल निलंबन हस्तांतरण।
- 6 मिनट के लिए 130 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- 2 एमएल glial मध्यम में सेल गोली Resuspend।
- glial ठंड मध्यम (1-भाग डाइमिथाइल sulfoxide और 4 भागों BGS) तैयार करें। कुप्पी 4 प्रति क्रायोजेनिक शीशियों में से प्रत्येक के लिए इस समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें।
- प्रत्येक शीशी के लिए सेल निलंबन के 0.5 एमएल स्थानांतरण, और फिर एक ही रात में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक विद्युत-रोधित कंटेनर में शीशियों रखकर धीरे-धीरे कोशिकाओं फ्रीज। एक दिन बाद, लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन फ्रीजर को शीशियों हस्तांतरण।
- चढ़ाना glia पुनर्जीवित
- प्लेट glia न्यूरॉन संस्कृति दिन से पहले 1-2 सप्ताह।
- एक 50 एमएल ट्यूब 10 के साथ एमएल glial मध्यम गरम तैयार करें।
- 2-3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में glia की 1 जमे हुए शीशी पिघलना।
- 10 एमएल glial मध्यम युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब में शीशी की सामग्री को स्थानांतरित करें।
- मथित्रई 130 XG पर 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण के लिए ट्यूब।
- 20 एमएल glial माध्यम में गोली Resuspend।
- संस्कृति व्यंजन (60 मिमी) में से प्रत्येक के 3 एमएल ताजा glial माध्यम जोड़ें, और उसके बाद प्रत्येक पकवान के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल हस्तांतरण। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृतियों सेते हैं।
- सप्ताह में दो बार कोशिकाओं फ़ीड। सेल घनत्व 50% संगम अच्छी तरह से पहले न्यूरॉन संस्कृति दिन तक पहुँच जाता है, glial 5% BGS युक्त glial विकास दर को धीमा करने के मध्यम करने के लिए स्विच। 70% - न्यूरॉन संस्कृति के लिए glial monolayer के वांछित संगम 50% है।
- 1-2 दिनों के न्यूरॉन संस्कृति से पहले NBG माध्यम के साथ glial मध्यम (6 एमएल / पकवान) बदलें।
3. Coverslip तैयारी
- सफाई और पैराफिन मोती की तैयारी
- केंद्रित नाइट्रिक एसिड में coverslips डूब (70% wt / wt; चेतावनी: उच्च संक्षारक) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उन्हें sonicate। अन्य प्रयोगशालाओं f हैound यह फायदेमंद बजाय कमरे के तापमान पर 12-24 घंटे के लिए चीनी मिट्टी के रैक में 70% नाइट्रिक एसिड में coverslips सेते हैं करने के लिए।
- ध्यान से संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार एक नामित रासायनिक धूआं हुड में नाइट्रिक एसिड त्यागें। coverslips विआयनीकृत जल के साथ 3-5 गुना रिंस करें।
- विआयनीकृत जल में coverslips डूब और उन्हें 30 मिनट के लिए फिर से sonicate (यदि वैकल्पिक पद्धति निम्नलिखित जाएँ)।
- विआयनीकृत जल निकालें और coverslips एक और तीन बार कुल्ला।
- 50 एमएल विआयनीकृत जल में coverslips डूब और autoclaving द्वारा उन्हें नसबंदी। वैकल्पिक रूप से, 6 घंटे के लिए एक ओवन में 225 डिग्री सेल्सियस पर coverslips जीवाणुरहित। यदि यह विकल्प दृष्टिकोण का उपयोग कर, चरण 3.1.9 को छोड़ दें।
- एक बार जब autoclaved, निम्न चरणों के लिए एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड coverslips हस्तांतरण।
- विआयनीकृत जल निकालें और 100% इथेनॉल के 20-30 एमएल के साथ कुल्ला।
- 100% इथेनॉल के 20-30 एमएल जोड़ें और coverslips हस्तांतरण औरएक 100 म पेट्रि डिश के लिए इथेनॉल।
- 60 म पेट्रि डिश, डिश प्रति 4-5 coverslips के लिए coverslips हस्तांतरण, और फिर उन्हें पकवान के किनारे के खिलाफ coverslips झुकाव द्वारा एयर सूखी करने के लिए अनुमति देने के लिए कुंद चिमटी का प्रयोग करें। एक बार जब इथेनॉल सुखाया गया है, coverslips सतह पर फ्लैट करना।
- एक उपयुक्त गर्मी प्रतिरोधी कांच की बोतल के लिए 10 ग्राम तेल में स्थानांतरित करें। तेल पिघल और कम से कम 1 घंटे के लिए एक गर्म थाली पर 150-200 के बारे में डिग्री सेल्सियस पर इसे बनाए रखने। आदर्श तापमान जो करने के लिए तेल गरम किया जाना चाहिए कुछ फेरबदल कर सकते हैं। गैर आदर्श तापमान तेल मोती के सही आकार के उत्पादन कठिनाई हो सकती है। पिघलने के बाद प्रतीक्षा अवधि तरल में एक जैसा तापमान सुनिश्चित करने के लिए मदद करता है।
- तेल में एक पाश्चर विंदुक डुबकी, और फिर जल्दी से प्रत्येक coverslip के किनारे के पास तीन स्थानों के लिए इसे छूने (प्रत्येक स्थान लगभग 120 डिग्री अलग किया जा रहा है)। बूँदें मोती लगभग 0.3-0.5 मिमी उच्च और व्यास में 1.0-2.0 मिमी में जमना जाएगाeter और coverslip पर न्यूरॉन्स और नीचे glial monolayer (चित्रा 2) के बीच एक जगह उपलब्ध कराने के कार्य करेंगे।
- 30 मिनट के लिए यूवी के प्रकाश में बर्तन नसबंदी, और फिर उन्हें कमरे के तापमान पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ कवर किया। तैयार coverslips संग्रहीत और एक माह तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पैराफिन मोती उपयोग करने से पहले कम से कम एक सप्ताह के लिए coverslips का पालन करने की अनुमति दी जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल के शेष चरणों के दौरान अलग करने से तेल नहीं कर पाएगा।
- पॉली-एल लाइसिन साथ कोटिंग Coverslips
- तेल की माला से पहले से तैयार coverslips युक्त पेट्री डिश प्राप्त करें।
- प्रत्येक coverslip की सतह के लिए borate बफर में पाली एल लाइसिन की 200 μL जोड़ें और समाधान रातोंरात coverslips पर बैठते हैं, कवर, कमरे के तापमान पर करते हैं। कोट जिस पर तेल मोती स्थित हैं के रूप में ही सतह। ध्यान दें कि यदि ठीक से साफ, पाली एल लाइसिन आसानी से फैल चाहिएcoverslip की सतह को कवर किया।
- एक दिन बाद, 2 घंटे के लिए हर बार के लिए बाँझ विआयनीकृत जल में उन्हें भिगोने से दो बार coverslips धोने। अंतिम धोने के बाद, पकवान प्रति न्यूरोनल चढ़ाना माध्यम के 4 एमएल के साथ पानी की जगह। ध्यान दें कि यह महत्वपूर्ण है कि coverslips नहीं की सतह होने पाली एल लाइसिन के साथ लेपित किया गया के बाद सुखाने के लिए अनुमति दी जानी।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में coverslip युक्त व्यंजन रखें। लेपित coverslips न्यूरॉन संस्कृति पहले कम से कम 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। इस न्यूरॉन संस्कृति के लिए प्रमुख माध्यम से किया जाता है।
4. हिप्पोकैम्पस और प्लेटिंग न्यूरॉन्स के विच्छेदन
- एक गर्भवती चूहा (भ्रूण दिन 18-19, योनि प्लग खोज के दिन से मापा के रूप में) प्राप्त और isoflurane-संज्ञाहरण कत्ल या अन्य अनुमोदित विधि द्वारा euthanize।
- 70% इथेनॉल के साथ चूहे के नीचे स्प्रे, और फिर जघन क्षेत्र अपरोक्ष से एक चीरा बनानेउदर गुहा के अंत करने के लिए ओह। संदूषण से बचने के लिए, केवल इस चरण में त्वचा के माध्यम से कटौती करने के लिए ध्यान रखना।
- 70% इथेनॉल के साथ फिर से विच्छेदन उपकरणों कुल्ला, और फिर गर्भाशय बेनकाब करने के लिए पेट की दीवार के माध्यम से कटौती। दो गर्भाशय सींग निकालें और उन्हें एक बाँझ 100 म पेट्रि डिश में रखें।
- लामिना का प्रवाह हुड में शेष चरण निष्पादित करें। भ्रूण के आसपास के गर्भाशय झिल्ली निकालें। उन्हें सिर काटना और 20 एमएल सीएमएफ-HBSS युक्त एक 100 म पेट्रि डिश में सिर रख दें।
- दिमाग बाहर काटना और उन्हें तुरंत बर्फ पर 2 एमएल सीएमएफ-HBSS युक्त एक 60 म पेट्रि डिश में रखें। अगले कदम के लिए पर्याप्त स्थान की अनुमति के लिए पकवान प्रति केवल 2-3 दिमाग इकट्ठा।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत मस्तिष्क गोलार्द्धों के मध्य रेखा से दूर मेनिन्जेस पट्टी, और फिर हिप्पोकैम्पस बाहर काटना और उन्हें 4.5 एमएल सीएमएफ-HBSS युक्त एक 60 म पेट्रि डिश में रखें। ध्यान दें कि हिप्पोकैम्पस एक चंद्राकार struc के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकताcortical गोलार्द्ध की औसत दर्जे की सतह में संरचना, और के रूप में यह पार्श्व एक वेंट्रिकल की सीमा को दूर करने के लिए आसान है।
- एक 15 एमएल ट्यूब को एकत्र हिप्पोकैम्पस ऊतक और सीएमएफ-HBSS स्थानांतरित करें। 2.5% ट्रिप्सिन की 0.5 एमएल जोड़ें, और फिर 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। Papain ट्रिप्सिन के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह विनम्र है और उपज में वृद्धि हो सकती।
- धीरे, पाश्चर विंदुक द्वारा ट्रिप्सिन समाधान को दूर हिप्पोकैम्पस ऊतक ट्यूब के नीचे तक अछूता छोड़ रहा है।
- धीरे 5 एमएल सीएमएफ-HBSS के साथ दो बार ऊतक धोने, जबकि 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यह विकासशील। दूसरे धोने के बाद, ऊतकों को सीएमएफ-HBSS के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़कर कम से कम 5 एमएल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए। वहाँ 10 से अधिक पिल्ले से हिप्पोकैम्पस, 8 अप करने के लिए कर रहे हैं एमएल सीएमएफ-HBSS जोड़ा जा सकता है।
- ऊतक पृथक्करण के लिए आग से पॉलिश pipettes के दो वेरिएंट तैयार करें। एक संस्करण की नोक पिपेट की लेकिन आग पॉलिश smoothened किनारों के साथ सामान्य व्यास की है। अन्य variचींटी टिप व्यास आधे से कम के साथ एक है। संक्षेप में एक लौ स्रोत के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक तिरछे की युक्ति प्रदर्शित करें, और तब pipettes के सुझावों का परीक्षण करें।
- यह प्रक्रिया दोहराएं जब तक टिप बढ़त smoothened किया गया था या व्यास कम हो गया है। यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक इन कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना एकल कोशिकाओं उपज के लिए अलग है आदर्श व्यास को खोजने के लिए अभ्यास करने के लिए महत्वपूर्ण है।
- एक चिकनी धार सामान्य गिलास पाश्चर विंदुक के माध्यम से पहली के बारे में 10 गुजरता द्वारा हिप्पोकैम्पस ऊतक Triturate, और फिर एक और 5 से 10 कम व्यास के साथ विंदुक के माध्यम से गुजरता है। लक्ष्य या बहुत कम ऊतक गुच्छों कोई साथ कोशिकाओं के एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए है।
- एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारित करें। आमतौर पर, 0.8 1.0 मिलियन करने के लिए पिल्ला प्रति कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं जब दो गोलार्द्धों से हिप्पोकाम्पी मिलाया जाता है।
- व्यंजनों के लिए सेल निलंबन के लिए पर्याप्त मात्रा स्थानांतरणचढ़ाना मध्यम 60 मिमी पकवान प्रति 300,000 कोशिकाओं के एक चढ़ाना घनत्व प्राप्त करने के लिए 4 एमएल में पाली एल लाइसिन लेपित coverslips युक्त। कोशिकाओं के घनत्व का इरादा प्रयोग पर निर्भर करता है, 100,000 से 500,000 से भिन्न हो सकते हैं।
- 3-4 घंटे के बाद, NBG माध्यम में glial कोशिकाओं से युक्त व्यंजन से जुड़ी न्यूरॉन्स के साथ coverslips हस्तांतरण। इस तरह से किया जाना चाहिए कि पक्ष जिस पर न्यूरॉन्स प्लेटेड गया glial सेल परत की ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा है। glia पकवान प्रति 4-5 coverslips की कुल जोड़ें।
- दो या तीन दिनों चढ़ाना के बाद, glial विकास की गिरफ्तारी के लिए पकवान प्रति 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए आरा-सी समाधान जोड़ें।
- प्रत्येक खिला पर ताजा माध्यम के 2.5 एमएल के साथ पुराने माध्यम की 2 एमएल की जगह सप्ताह में एक बार कोशिकाओं फ़ीड। अतिरिक्त मध्यम जोड़ा समय के साथ वाष्पीकरण की भरपाई के लिए है, और केवल मध्यम के एक हिस्से को सुनिश्चित करने के लिए माध्यम के अनुरूप कंडीशनिंग glial कोशिकाओं द्वारा बदला गया है। इन संस्कृतियों में कम से कम एक महीने के लिए आम तौर पर स्वस्थ हैं (चित्रा 3)। न्यूरॉन अस्तित्व 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए संस्कृति माध्यम में APV जोड़कर सुधार किया जा सकता। APV एक NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी है और ग्लूटामेट excitotoxicity को कम करके अस्तित्व को बढ़ावा देता है।
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Representative Results
प्राथमिक तंत्रिका कोशिका संस्कृति के इस "सैंडविच" विधि में, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स (चित्रा 3) glial कोशिकाओं (चित्रा 1) पैराफिन मोती (चित्रा 2) द्वारा अलग के एक बिस्तर पर जाना। इससे यह सुनिश्चित होता है कि न्यूरॉन्स चुनिंदा न्यूनतम glial सेल संदूषण के साथ कांच coverslips पर हो जाना लेकिन टिशू कल्चर पकवान पर बढ़ glia से पर्याप्त पौष्टिकता संबंधी समर्थन प्राप्त करते हैं। आमतौर पर, न्यूरॉन्स> 3 सप्ताह के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है और अच्छी तरह से विकसित एक्सोन और डेन्ड्राइट अपने ठेठ dephospho-ताउ और MAP2 immunostaining क्रमश: (चित्रा 4) से पहचान के साथ व्यापक arborisation का विकास। परिपक्व न्यूरॉन्स इन डिब्बों को पोस्टअन्तर्ग्रथनी मार्कर Drebrin1 के चुनिंदा स्थानीयकरण से पहचान अन्तर्ग्रथनी कांटा का विकास। ये अन्तर्ग्रथनी कांटा बारीकी प्रीसानेप्टिक विशेषज्ञताओं, जो synaptic पुटिका मार्कर Synapsin1 immunostaining द्वारा पहचाने जाते हैं करने के लिए apposed कर रहे हैं।पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों की निकटता अच्छी तरह से विकसित इंगित करता है और सही ढंग से गठबंधन synapses। ये प्राथमिक न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स और synapses के कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। ये शामिल हैं, लेकिन, संकेत पारगमन, न्यूरोनल polarity, subcellular के अवैध व्यापार और अन्तर्ग्रथन विकास और plasticity के अध्ययन के सीमित नहीं हैं।
चित्रा glial संस्कृतियों के 1. चरण विपरीत छवियों जमे हुए glial स्टॉक से चढ़ाना के बाद, 1 दिन लिया 7 दिन, या 14 दिनों के। स्केल बार, 500 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. coverslips prepar की उच्च संकल्प छवियोंतेल की माला से एड। (ए, बी) ठीक से के उदाहरण पैराफिन मोती लागू होता है। (सी, डी) गलत तरीके से लागू तेल मोती के उदाहरण। α: एक से अधिक मनका एक ही स्थान पर लागू किया गया था। β: मनका ठीक से coverslip पर स्थित होने में विफल रहे। χ: मनका भी coverslip के केंद्र के करीब लागू किया गया था। δ: मनका बहुत अधिक थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. संस्कृति में प्राथमिक न्यूरॉन्स के विकास के चरणों के चरण विपरीत छवियों। स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।
चित्रा 4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस इन विट्रो में 17 दिनों में प्राथमिक न्यूरॉन्स की छवियों। न्यूरॉन्स 12 मिनट के लिए 4% formaldehyde और पीबीएस में 4% sucrose के साथ तय कर रहे थे, और फिर 5 मिनट के लिए 0.25% ट्राइटन X-100 के साथ permeabilized। 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% बीएसए के साथ अवरुद्ध करने के बाद, न्यूरॉन्स प्राथमिक प्रतिरक्षी पीबीएस में 3% बीएसए में लागू के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट रहे थे। प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में इस का उपयोग किया गया: विरोधी synapsin मैं (खरगोश, 1: 2,000), विरोधी drebrin (माउस IgG1, 1: 8, क्लोन M2F6, हाइब्रिडोमा सतह पर तैरनेवाला), विरोधी MAP2 (चिकन पॉलीक्लोनल IgY, 1: 5000), और विरोधी ताउ-1 (माउस IgG2a, 1: 2,000, क्लोन PC1C6; dephosphorylated ताऊ को पहचानता है)। कोशिकाओं तो पीबीएस के साथ धोया और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 3% बीएसए में उपयुक्त प्रजाति या isotype विशेष माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट रहे थे। माध्यमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी fol के रूप में थेचढ़ाव: एलेक्सा 488-संयुग्मित विरोधी माउस IgG2a (1: 500), एलेक्सा 568-संयुग्मित विरोधी खरगोश (1: 500), एलेक्सा 647-संयुग्मित विरोधी माउस IgG1 (1: 500), और AMCA-संयुग्मित विरोधी चिकन IgY (गधा आईजीजी, 1: 200)। स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी और 2.5 सुक्ष्ममापी, के रूप में संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
संवर्धन न्यूरॉन्स की "सैंडविच" विधि कहीं और अच्छी तरह से वर्णित किया गया है 2, 11, वहाँ है कि अकेले पाठ में वर्णन करने के लिए काफी मुश्किल हो जाता है प्रोटोकॉल भर कई कदम है, जो जांचकर्ताओं जो इसे अपनाने के लिए इच्छा के लिए निराशा का कारण बन सकता है।
glial संस्कृति, coverslip तैयारी और न्यूरॉन संस्कृति और रखरखाव: विधि मोटे तौर पर तीन वर्कफ़्लो में विभाजित किया जा सकता है। तीन की तैयारी के प्रत्येक उच्च गुणवत्ता वाले न्यूरॉन संस्कृतियों और कई महत्वपूर्ण विचार के लिए महत्वपूर्ण ध्यान में रखा जाना चाहिए। न्यूरॉन्स चढ़ाना से पहले, glial फीडर परत आदर्श astrocytes की एक समरूप जनसंख्या हो सकता है और 50-70% संगम के बीच होना चाहिए। इस glial फीडर परत से पर्याप्त पौष्टिकता समर्थन सुनिश्चित करेगी। ऐसा नहीं है कि astroglial संस्कृति अन्य प्रकार की कोशिकाओं, विशेष रूप से microglia, जो शिथिल हैं attac की न्यूनतम संदूषण है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैhed और गोल कोशिकाओं। Microglia रिहाई साइटोकिन्स, जो न्यूरॉन स्वास्थ्य और अस्तित्व 12 के लिए हानिकारक हैं। सीरम, या तो घोड़े सीरम या गोजातीय वृद्धि सीरम, बहुत कुछ करने के लिए बहुत से चर हो सकता है। सीरम के कई बहुत सारे की सावधानी से जांच के लिए एक विशेष बहुत उपयोग करने के लिए निर्णय लेने से पहले किया जाना चाहिए।
Coverslip तैयारी एक और महत्वपूर्ण कदम है। कांच और इसकी सफाई में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की गुणवत्ता स्वस्थ अच्छी तरह से विकसित न्यूरॉन्स के लिए महत्वपूर्ण हैं। विधि नव एक प्रयोगशाला में अपनाया जा रहा है, तो यह कई आपूर्तिकर्ताओं से कांच coverslips परीक्षण के लायक हो जाएगा। coverslips के सफाई के लिए, कुछ प्रयोगशालाओं 18-36 घंटे के लिए 70% नाइट्रिक एसिड में coverslips सोख जबकि अन्य एक sonicator में केवल 1 घंटे के लिए ऐसा करते हैं। साफ coverslips का एक महत्वपूर्ण कसौटी यह है कि पाली एल लाइसिन समाधान सतह पर समान रूप से बांट देना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार यह है कि पैराफिन मोम coverslips के लिए आवेदन किया मोती उपयुक्त ऊंचाई के हो सकता है और चाहिएके रूप में प्रोटोकॉल में उल्लिखित व्यास और, सही तापमान पर गर्म किया जा।
न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए, हिप्पोकैम्पस भ्रूण दिन 17-19 चूहों से विच्छेदित किया जा सकता है। हालांकि इस स्तर पर विच्छेदन बहुत कम glial कोशिकाओं की ओर जाता है, glial प्रसार संस्कृति के 2-3 दिनों के बाद विरोधी mitotic एजेंट आरा-सी जोड़कर गिरफ्तार किया जा सकता है। आग पॉलिश विंदुक युक्तियाँ द्वारा trypsinized हिप्पोकैम्पस ऊतक के विचूर्णन कोशिकाओं स्वयं को नुकसान पहुँचाए बिना व्यक्ति की कोशिकाओं में ऊतक अलग कर देना करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता न्यूरोनल विकास और रखरखाव मध्यम Neurobasal + L-Glutamine + B27 पूरक है। L-Glutamine GlutaMAX, जो संस्कृति माध्यम में और अधिक स्थिर है द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता। B27 पूरक की गुणवत्ता बहुत से बहुत भिन्न हो सकते हैं, और इसलिए यह लंबी अवधि संस्कृति के लिए एक विशिष्ट बहुत उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। B27 के एक गरीब बहुत न्यूरॉन्स पेड़ों का झुरमुट के कारण हो सकता है। इस तरह के GS21 और SM1 के रूप में वैकल्पिक उत्पादों B27 के लिए अच्छा विकल्प होना पाया गया है।एक लंबे समय तक की तुलना में सप्ताह के लिए बड़े हो न्यूरॉन्स, हर हफ्ते ताजा माध्यम के साथ खिलाया जाना चाहिए जिसमें मध्यम की एक तिहाई हर हफ्ते बदल दिया है।
तंत्रिका कोशिकाओं संवर्धन का यह तरीका प्रयोगों कि कम या कोई glial संदूषण के साथ शुद्ध neuronal आबादी पर भरोसा करने के लिए अमूल्य साबित कर सकते हैं। कम घनत्व इस पद्धति का उपयोग हो गई न्यूरॉन्स आम तौर पर अच्छी तरह से विकसित arbors, synaptic कनेक्शन और नेटवर्क गुणों के साथ कई हफ्तों के लिए जीवित रहते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम CIHR एमओपी-142,209 TJS करने द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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