Summary
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.
Abstract
היכולת לחקור את המבנה והפיזיולוגיה של תאי עצב בודדים בתרבות חיונית לחקר בנוירוביולוגיה, מקנה גמישות מניפולציה גנטית וכימי של תאים בודדים או רשתות מוגדרות. הקלות של מניפולציה כזו היא פשוטה במערכת התרבות המופחתת בהשוואת רקמת המוח השלמה. בעוד שיטות רבות עבור הבידוד והצמיחה של הנוירונים העיקריים האלה קיימות, לכל אחד מהם יש מגבלות משלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה culturing נוירונים בהיפוקמפוס עובריים בצפיפות נמוכה גבוהה טוהר מכרסם על coverslips זכוכית, אשר מושעים אז מעל בשכבה של תאי גליה. זו "תרבות הכריך" מאפשרת לצמיחה ארוך טווח בלעדי של אוכלוסייה של נוירונים ובה בעת לאפשר תמיכה טרופית מן בשכבת גליה הבסיסית. כאשר הנוירונים הם גילו מספיק או לרמת בשלות, את coverslips נוירון ניתן ודפוק של מנת גליה ו המשמש להדמיה או מבחנים תפקודיים. נוירונים grown בשיטה זו בדרך כלל לשרוד במשך כמה שבועות ולפתח סוכות נרחבות, קשרים סינפטיים, ואת מאפייני רשת.
Introduction
המוח מאורגן רשתות מורכבות של נוירונים. תרומתו של נוירונים בודדים לפעילות הרשת תפקוד המוח יכול להיחקר על ידי שינוי סלקטיבית של ההרכב המולקולרי שלהם perturbance של המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם. מניפולציה גנטית וכימית של נוירונים בודדים היא ללא ספק קל יותר ב נוירונים בתרבית מאשר רקמת מוח שלמה, משוחרר על ידי ההטרוגניות המורכבות הסלולר של האחרונים. נוירונים בתרבית לפתח אקסונלית מוגדרת היטב סוכות דנדריטים וליצור קשרים סינפטיים נרחבים עם שני.
בעוד נוירון תרבות מחיות מבוגרות או מאזורים אחרים של מערכת העצבים אפשרית, תרבויות בהיפוקמפוס עובריות הם העדיפו לעתים קרובות בשל אוכלוסיית תאי פירמידליים המוגדרת שלהם וצפיפות גליה נמוכה יחסית 1, 2. נוירונים בהיפוקמפוס גדל בצפיפות נמוכה בתרבות במיוחד AMENable ללימוד לוקליזציה subcellular, סחר חלבון, קוטביות עצבית ופיתוח סינפסה. נוירונים בתרבית גם הועסק נרחב בלימוד תהליכים מולקולריים הפלסטיות הסינפטית 3, 4, 5, 6. הכנות תרבות Neuron מעכברים עם מחיקות גנטיות עולמיות כי אינו שורד לאחר לידה כבר שימושיות במיוחד בלימוד התפקידים הסלולר סינפטיים של גנים מסוימים 7.
כמו במוח, נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים תלויים תמיכה טרופית מתא גליה. זה מסבך את התרבות שלהם, והוא הוביל את הפיתוח של מספר שיטות שונות שבאמצעותם תמיכה זו מסופקת. אחת שיטות נפוצות כרוכות ציפוי נוירונים ישירות על בשכבה של תאי גליה 8, או המאפשר ותאי גלייה מזהמים מן Hipp רכשהרקמת ocampal להתרבות וליצור בשכבה מתחת נוירונים 9. אמנם שיטה זו מצאה כמה הצלחה, הטומאה של התרבות העצבית וכתוצאה היא נחה עבור ניסויי הדמיה. שיטה נפוצה נוספת של תרבות נוירון היא לעזוב-אאוט המזין גליה שכבה לגמרי, ובמקום לספק תמיכה טרופית בצורת מדיום גידול מוגדר 10.
כאן, אנו מתארים את "כריך" או "בנקר" השיטה של נוירון תרבות 2, 11. שיטה זו כרוכה ציפוי נוירונים בהיפוקמפוס על coverslips זכוכית, אשר מושעים אז מעל בשכבה של תאי גליה מופרדים חרוזי פראפין. זה מקל על תרבות ארוכת טווח של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מבלי לזהם גליה ובה בעת לאפשר תמיכה טרופית מן בשכבת גליה הבסיסית. כאשר הנוירונים הם גילו מספיק או רמת בגרות,ניתן והדפוק את coverslips נוירון של מנת גליה ו המשמש להדמיה או מבחנים תפקודיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים ופרוטוקולים באמצעות חיות מעבדה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת מניטובה היו תואמת את ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
1. הכנת מכשירים, חוצצים ופתרונות
- לעקר ידי מעוקר כל הציוד לנתיחה, טפטפות פסטר זכוכית, טיפים פיפטה, מנגנון הסינון, ומים ללא יונים.
- הכן 20% (w / v; 1.1 M) פתרון גלוקוז מניות מים ללא יונים ולסנן לעקר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- כן פתרון פירובט נתרן 100 מ"מ מים ללא יונים ולסנן לעקר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הכן סידן ומגנזיום ללא תמיסת מלח מאוזן של האנק (CMF-HBSS) על ידי ביצוע פתרון של 10% HBSS (10x), 10 HEPES מ"מ, ו 100 U / mL פניצילין, סטרפטומיצין ב מים ללא יונים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 עד 2 חודשים.
- הכן 10 מ"ג / מ"ל deoxyribonuclease לי (DNase) ב CMF-HBSS,ואז לסנן לעקר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- הכן בינוני גליה ידי ביצוע פתרון של 30 גלוקוז מ"מ (מפתרון סטרילי), 95 U / mL פניצילין, סטרפטומיצין, ו 10-15% צמיחה שור בסרום (BGS) ב המינימום ההכרחי בינוני (MEM).
הערה: כפי שצוין בפרוטוקול, פתרון של 5% BGS ניתן להשתמש במידת הצורך להאט התפשטות תאים. סרום הסוס עשוי לשמש במקום BGS, אך מציין כי כל אצווה חייב להיבדק לפני השימוש עקב וריאציה-תצווה שאר. אחסן את הפתרון המוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 עד 2 חודשים. למרות מעבדות רבות משתמשות FBS, צפינו בעקביות כי צמיחת גליה ב BGS היא חזקה כמו ב FBS. BGS נגזר נסיוב עגל העוברי אשר השלים עם רכיבי הגדרה כימית. בנוסף, BGS הוא משמעותי יותר חסכוני מ FBS. - הכן את הצמיחה נוירון ובינוניים תחזוקה (neurobasal-B27, NBG) על ידי ביצוע פתרון של 1x B27 תוספת ו 0.5 מ"מ L- גלוטמין ב 500 מ"ל Neurobasal Mediאממ. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 עד 2 חודשים. L-Glutamine ניתן להחליף עם Glutamax, אשר הוצע להיות יציב יותר בטווח הבינוני הצמיחה.
- הכן הנוירון ציפוי בינוני ידי ביצוע פתרון של גלוקוז 30 מ"מ (מפתרון סטרילי), 1 פירובט סודיום מ"מ (מפתרון סטרילי), ו 10% BGS ב MEM. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 עד 2 חודשים.
- הכן תמיסה של 1 מ"מ cytarabine (Ara-C) ולסנן לעקר. Aliquot לתוך 1 חלקים מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון של 100 מ"מ APV ב 100 MN מסנן-מעוקרים NaOH. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
- ממיסים 1 מ"ג / מ"ל פולי- L- ליזין במאגר borate, pH 8.5 (חומצה בורית 50 מ"מ ו 12 מ"מ בורקס) ולסנן לעקר. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. במקום-פולי- L- ליזין, אפשר להשתמש פולי- L-ornithine אשר עשוי להיות פחות רעיל לתאים.
2. הכנת תרבות גליה
- הכן תרבית תאים בקליפת המוח astroglia
- תרסיס הגורים עם אתנול 70% לערוף להם.
- מניחים את הראש בצלחת 100 מ"מ על הקרח המכיל 15 מ"ל CMF-HBSS.
- לנתח את כל המוח על ידי חיתוך הקרקפת, פתיחת הגולגולת, ניתוק גזע המוח, ולאחר מכן להעביר את המוח כדי 60 מ"מ צלחות פטרי על קרח המכיל 3 מ"ל CMF-HBSS.
- הפרד את אונות המוח מן hippocampi ולאחר מכן לקלף ממנה את קרומי המוח שמסביב להם. במשנה זהירות נאותים כדי להבטיח זיהום מינימלי מ פיברובלסטים קרום המוח. הפיברובלסטים meningeal בתרבות יכול להתחרות עם גליה לצמיחה להזיק לבריאות נוירון. לאסוף את כל אונות המוח בצלחת 60 מ"מ פטרי על קרח המכיל 5 מ"ל CMF-HBSS.
- הסר את CMF-HBSS ולאחר מכן לקצץ את רקמת קליפת המוח שנאספה כמו דק ככל האפשר באמצעות מייקרו לנתח אביב-מספרי.
- להוסיף מספיק CMF-HBSS אל צלעותרקמת PED. בעזרת פיפטה זכוכית פסטר, להעביר את חתיכות רקמה לצינור 15 מ"ל. תביאו את הנפח הכולל עד 12 מ"ל ידי הוספת CMF-HBSS.
- להוסיף 1.5 מ"ל כל אחת טריפסין 2.5% ו 10 מ"ג / מ"ל פתרון DNase. דגירת התערובת המתקבלת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 12 דקות.
- Triturate הרקמה 10-15 פעמים בעזרת פיפטה זכוכית פסטר, ובהמשך דגירה אותו באמבט מים C 37 ° עבור 3 דקות.
- סנן את supernatant באמצעות נייר העדשה או רשת המסנן לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של BGS. הדבר נעשה כדי להסיר גושים של רקמות undissociated. לחלופין, להשתמש מסננות סלולריות זמינות מסחרית.
- להוסיף 13.5 מ"ל של CMF-HBSS ו 1.5 מ"ל של טריפסין 2.5% ל הצינור המכיל חתיכות רקמה הנותרים ועוד דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך דקות 10 נוספים.
- Triturate הרקמה הנותרת פעם נוספת, ולאחר מכן לסנן את ההשעיה שוב לתוך צינור 50 המ"ל המכיל התסנין הראשוני. בשלב הבא, יש לשטוף את leNS נייר עם 3 מ"ל של BGS. ההיקף הסופי צריך להיות כ 38 מיליליטר.
- צנטריפוגה ההשעיה המכיל תאי גליה ניתק עבור 6 דקות ב 130 גרם x. בזהירות וזורקים supernatant בעזרת פיפטה פסטר זכוכית. ודא כי התאים pelleted בתחתית לא מוטרדים. תחתית הגלולה מופיעה אדמדמה מעט המכילים מרכיבי דם.
- העברת תאי גליה ב 1 מיליליטר של מדיום גליה לתוך צינור טרי, נזהרת שלא להפריע את החלק האדמדם של הגלולה.
- הוסיפו עד 2 מ"ל של מדיום גליה לכל גור כדי להשעות את בשילוב ניתק ותאי גלייה. לדוגמה, אם 10 גורים שימשו, ולאחר מכן נפח resuspension הכולל יהיה 20 מ"ל.
- הכן בקבוק התרבות תא אחד 75 ס"מ 2 לכל גור. להוסיף 18 מ"ל מחומם מראש בינוני גליה בקבוק אחד.
- העברת 2 מ"ל של השעיה תא בקבוק אחד דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור.
- אחרי יום אחד, להחליף עם 20 מ"ל גליה מedium. בשלב זה, את התרבות היא שילוב של גליה ו-סוגי תאים לא רצויים אחרים.
- ארבעה ימים לאחר זריעת התאים, במרץ לנער את הצלוחיות כדי לסלק תאים שאינם astrocyte. לשם כך, יש לשטוף את צלוחיות פעם עם CMF-HBSS, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל טריים CMF-HBSS בקבוק אחד. Shake צלוחיות במרץ 5-10 פעמים, ולאחר מכן לשאוב את CMF-HBSS. שטפו פעמיים עם CMF-HBSS, ולאחר מכן להוסיף 20 מ"ל בינוני גליה.
הערה: שלב זה הוא חיוני כדי להבטיח את הסרת סוגי תאים שאינם יעד, ואת לא צריך לגרום לאובדן של האסטרוציטים הרצויים. - החלף בינוני גליה טרי פעמיים בשבוע עד התאים הם ומחוברות (איור 1).
- גליה הקפאה
- לאחר תרבויות הם ומחוברות, לשאוב את המדיום ולשטוף את monolayer תא עם 10 מ"ל CMF-HBSS.
- להוסיף 10 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA בקבוק אחד לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
- צלוחיות קש בעדינות כדי לסלק את התאים. להוסיף 1 מ"ל BGS to כל בקבוק ולהעביר את השעיות התא לתוך 15 מ"ל צינורות.
- בצנטריפוגה צינורות ב 130 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant שהתקבל.
- Resuspend התא גלולה ב 2 בינוני גליה מ"ל.
- הכן את המדיום מקפיא גליה (sulfoxide דימתיל 1-חלק 4-חלקים BGS). להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון זה לכל אחד 4 מבחנות קריוגני לכל בקבוק.
- העבר 0.5 מ"ל של תרחיף תאים בקבוקון אחד, ולאחר מכן להקפיא את התאים לאט על ידי הצבת צלוחיות במיכל מבודד במקפיא C -80 ° לילה. אחרי יום אחד, להעביר את הצלוחיות במקפיא חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
- ציפוי לתחיית גליה
- גליה פלייט 1-2 שבועות לפני יום תרבות נוירון.
- הכן צינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל חימם בינוני גליה.
- להפשיר 1 בקבוקון קפוא של גליה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות.
- מעבירים את תכולת הבקבוקון לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל בינוני גליה.
- צנטריפוגהדואר הצינור עבור 5 דקות ב 130 XG לשאוב את supernatant.
- Resuspend גלולה 20 בינוני גליה מ"ל.
- להוסיף 3 בינוני גליה טרי מ"ל לכל אחד את הכלים תרבות (60 מ"מ), ולאחר מכן להעביר 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל צלחת. דגירת תרבויות חממת 2 CO 37 מעלות צלזיוס, 5%.
- להאכיל את התאים פעמיים בשבוע. אם צפיפות התאים מגיע 50% המפגש היטב לפני יום תרבות נוירון, לעבור בינוני גליה המכילים 5% BGS כדי להאט את קצב הצמיחה גליה. המפגש הרצוי בשכבה גליה לתרבות נוירון הוא 50% - 70%.
- החלף את המדיום גליה עם המדיום NBG (6 מ"ל / צלחת) 1-2 ימים לפני תרבות נוירון.
3. הכנת Coverslip
- ניקוי והכנת חרוזי פרפין
- לצלול coverslips ב חומצה חנקתית מרוכזת (70% wt / wt; זהירות: מאכל מאוד) ו sonicate אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מעבדות אחרות יש Found זה מועיל דגירה coverslips חומצה חנקתית 70% ב מתלים קרמיקה עבור 12-24 שעות בטמפרטורת החדר במקום.
- בזהירות להתעלמות חומצה חנקתית במנדף כימי המיועד בהתאם להנחיות מוסדיים. שוטפים את coverslips 3-5 פעמים עם מים ללא יונים.
- לצלול coverslips במים שעברו דה-יוניזציה sonicate אותם שוב למשך 30 דקות (לדלג אם בעקבות השיטה החלופית).
- הסר את המים ללא יונים ולשטוף את coverslips עוד שלוש פעמים.
- לצלול coverslips ב 50 מ"ל מים ללא יונים לעקר אותם על ידי מעוקר. לחלופין, לעקר את coverslips ב 225 מעלות צלזיוס בתנור במשך 6 h. אם באמצעות גישה חלופית זו, דלגו לשלב 3.1.9.
- לאחר autoclaved, להעביר את coverslips כדי ברדס זרימה למינרית סטרילי עבור השלבים הבאים.
- הסר את המים ללא יונים ולשטוף עם 20-30 מ"ל של אתנול 100%.
- להוסיף 20-30 מ"ל של 100% אתנול ו להעביר את coverslipsאתנול צלחת 100 מ"מ פטרי.
- להשתמש בפינצטה בוטה להעביר coverslips אל 60 מ"מ צלחות פטרי, 4-5 coverslips לכל צלחת, ולאחר מכן לאפשר להם להתייבש באוויר על ידי הטיית coverslips נגד דופן הקערה. לאחר אתנול התאדה, להניח את coverslips שטוח על פני השטח.
- העבר 10 גרמו פרפין כדי בקבוק זכוכית חום עמיד מתאים. ממיסים את פרפין ולתחזק אותו בסביבות 150-200 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית במשך לפחות 1 h. הטמפרטורה האידיאלית שאליה פרפין צריך להיות מחומם עלולה לקחת קצת tweaking. טמפרטורות ללא אידיאליות יכולות להוביל לקושי לייצר את הגודל הנכון של חרוזי פרפין. תקופת ההמתנה לאחר ההיתוך מסייעת להבטיח טמפרטורה קבועה במהלך נוזלי.
- טובלים פיפטה פסטר לתוך פרפין, ולאחר מכן במהירות לגעת בו שלוש נקודות בסמוך לקצה כל coverslip (כל נקודה להיות כ 120 מעלות זה מזה). טיפות יהיה לגבש לתוך חרוזים כ 0.3-0.5 מ"מ גבוה 1.0-2.0 מ"מ קוטרeter ו יתפקד לספק רווח בין הנוירונים על coverslip ואת בשכבה גליה להלן (איור 2).
- לעקר את הכלים תחת אור UV למשך 30 דקות, ולאחר מכן לכסות אותן בנייר כסף וחנות בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן ולהשתמש בהם coverslips הוכן עבור עד חודש. חרוזים פרפין צריך להיות מותר לדבוק coverslips עבור לפני השימוש שבוע לפחות. זה ימנע את פרפין מן הניתוק במהלך השלבים הנותרים של הפרוטוקול.
- Coverslips ציפוי עם פולי- L- ליזין
- השג צלחות פטרי המכילות coverslips הכין בעבר עם חרוזי פרפין.
- הוספת 200 μL של פולי- L- ליזין במאגר borate אל פני השטח של כל coverslip ולתת פתרון לשבת על coverslips לילה, מכוסה, בטמפרטורת החדר. מעיל זהה משטח לזו שעליה חרוזים פרפין נמצאים. שים לב שאם ניקו כראוי, פולי- L- ליזין צריך להתפשט בקלותכדי לכסות את פני השטח של coverslip.
- אחרי יום אחד, לשטוף את coverslips פעמיים על ידי טבילתם במים סטריליים deionized עבור 2 h בכל פעם. לאחר השטיפה של הדבר, להחליף את המים עם 4 מיליליטר של מדיום ציפוי עצבי לכל צלחת. שים לב חשוב כי פני השטח של coverslips לא יורשו לייבש לאחר שהיה מצופה-פולי- L- ליזין.
- מניחים את הכלים המכילים coverslip חממה 37 ° C, 5% CO 2. את coverslips מצופה יש וטופח במשך 24 שעות לפחות לפני תרבות נוירון. הדבר נעשה כדי ממשלת המדיום לתרבות נוירון.
Dissection 4. של נוירונים בהיפוקמפוס ואת הציפוי
- השג חולדה בהריון (עוברי יום 18-19, כפי שנמדד מיום גילוי תוסף נרתיק) ו להרדים ידי עריפת isoflurane-מורדם או בשיטת אושר אחרת.
- ספריי התחתון של עכברוש עם 70% אתנול, ולאחר מכן לבצע חתך מאזור הערווה ט.ר.ו.איכס עד הסוף של חלל הבטן. כדי למנוע זיהום, לטפל לחתוך רק דרך העור בשלב זה.
- יש לשטוף את הכלים דיסקציה שוב עם 70% אתנול, ולאחר מכן לחתוך דרך דופן הבטן לחשוף את הרחם. הסר את שני קרני הרחם ומניחים אותם בצלחת פטרי סטרילית 100 מ"מ.
- בצע את השלבים הנותרים במנדף זרימה למינרית. הסר את קרום הרחם סביב עובר. לערוף להם להציב את הראשים בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכיל 20 מ"ל CMF-HBSS.
- לנתח את המוח ומיד למקם אותם בצלחת פטרי 60 מ"מ המכיל 2 מ"ל CMF-HBSS על הקרח. אסוף בלבד 2-3 מוחות לכל צלחת כדי לאפשר מספיק מקום לשלב הבא.
- תחת מיקרוסקופ לנתח רצועת משם את קרומי המוח קו האמצע של אונות המוח, ולאחר מכן לנתח את hippocampi ומניחים אותם בצלחת 60 מ"מ פטרי המכילה 4.5 מ"ל CMF-HBSS. שים לב בהיפוקמפוס ניתן להבחין בתור struc כסהרture על פני השטח המדיאלי של אונת קליפת המוח, והוא קל להסיר כפי שהוא גובל רוחבי על ידי חדר.
- העברת רקמה בהיפוקמפוס נאסף CMF-HBSS לצינור 15 מ"ל. להוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין 2.5%, ולאחר מכן לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. Papain ניתן להשתמש במקום טריפסין כי זה עדין ועשוי להגדיל את התשואה.
- הוצא בעדינות את פתרון טריפסין ידי פיפטה פסטר, עוזב את הרקמה בהיפוקמפוס המופרעת בתחתית הצינור.
- לשטוף בעדינות את הרקמה פעמיים עם 5 מ"ל CMF-HBSS תוך דוגרים אותו 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר לשטוף את השני, להביא את הנפח הכולל עד 5 מ"ל לפחות על ידי הוספת נפח מספיק של CMF-HBSS אל הרקמה. אם יש hippocampi יותר מ 10 גורים, עד 8 מ"ל CMF-HBSS ניתן להוסיף.
- הכן שתי גרסאות של טפטפות אש מלוטש עבור ניתוק הרקמה. הטיפ של גרסה אחת היא של הקוטר הרגיל של פיפטה אבל עם קצות smoothened אש מלוטשת. וארי אחריםהנמלה היא אחד עם קוטר קצה מצטמצם בחצי. בקצרה לחשוף את קצה פיפטה פסטר זכוכית באלכסון למקור אש, ולאחר מכן לבחון את הטיפים של טפטפות.
- חזור על שלב זה עד קצה הקצה היה smoothened או הקוטר הופחת. חשוב לתרגל כדי למצוא את הקוטר האידיאלי כדי להבטיח כי הרקמה הוא ניתק להניב תאים בודדים ללא פגיעה בתאים אלה.
- Triturate הרקמה בהיפוקמפוס הראשון בכ 10 עובר דרך פיפטה פסטר זכוכית רגילה חלקה פיפיות, ואז עוד 5 עד 10 עובר פיפטה עם קוטר מופחת. המטרה היא להשיג פתרון הומוגני של תאים עם שום או מעט מאוד גושים ברקמה.
- לקבוע את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי. בדרך כלל, 0.8 1.0 מיליון תאים לכל גור מתקבלים כאשר hippocampi משני ההמיספרות משולבים.
- עבר נפח מספיק של השעית תא מנותהמכיל coverslips פולי- L- מצופה ליזין ב 4 מיליליטר ציפוי בינוני להשיג צפיפות ציפוי של 300,000 תאים לכל צלחת 60 מ"מ. הצפיפות של התאים יכולה לנוע בין 100,000 ל 500,000, בהתאם הניסוי המיועד.
- לאחר 3-4 שעות, להעביר את coverslips עם הנוירונים המחוברים מנות המכילות תאי גליה במדיום NBG. זה צריך להיעשות כך הצד שעליו נוירונים היו מצופים פונה כלפי מטה לכיוון שכבת תאי גליה. להוסיף סך של 4-5 coverslips לכל צלחת גליה.
- יומיים-שלושה לאחר ציפוי, להוסיף את הפתרון ערה-C לריכוז סופי של 5 מיקרומטר לכל צלחת לעצור צמיחה גליה.
- להאכיל את התאים פעם בשבוע על ידי החלפת 2 מ"ל של המדיום הישן עם 2.5 מ"ל של מדיום חדש בכל האכלה. המדיום הנוסף שנוסף הוא לפצות על אידוי לאורך זמן, ורק חלק המדיום משתנה כדי להבטיח מיזוג עקבי של המדיום על ידי תאי גליה. תרבויות אלה הן בדרך כלל בריאות במשך לפחות חודש אחד (איור 3). הישרדות Neuron ניתן לשפר על ידי הוספת APV עד בינוני התרבות לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. APV הוא אנטגוניסט לקולטן NMDA ומקדם הישרדות ידי צמצום יתר רעיל גלוטמט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשיטת "כריך" זו תרבות תא העצב העיקרית, נוירונים בהיפוקמפוס (איור 3) לגדול על מצע של תאי גליה (איור 1) מופרדות חרוזי פרפין (איור 2). הדבר מבטיח כי נוירונים לגדול באופן סלקטיבי על coverslips זכוכית עם זיהום תא גלייה מינימאלי אבל מקבלים תמיכה טרופית מהאג גליה גדלה על הצלחת בתרבית הרקמה. בדרך כלל, הנוירונים יכול להישמר בתרבות עבור> 3 שבועות ולפתח arborisation הנרחב עם אקסונים מפותחים דנדריטים המזוהה על ידי dephospho-טאו ו MAP2 immunostaining הטיפוסי שלהם, בהתאמה (איור 4). נוירונים בוגרים לפתח עמוד שדרה הסינפטי מזוהה על ידי לוקליזציה סלקטיבית של Drebrin1 סמן postsynaptic כדי תאים אלה. הקוצים הסינפטי אלה apposed מקרוב להתמחויות presynaptic, אשר מזוהים על ידי immunostaining Synapsin1 סמן שלפוחית סינפטית. ההקרבה של אתרים טרום postsynaptic מציינת מפותח כראוי מיושרת סינפסות. הנוירונים עיקריים אלו מתאימים במידה רבה ביותר ללימודים תפקודיים מבניים של נוירונים וסינפסות. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, מחקרים של הולך אותות, קוטביות עצבית, סחר התת-תאי ופיתוח סינפסה פלסטיות.
תמונות עם ניגודיות איור 1. שלב של תרבויות גליה נלקחו 1 יום, 7 ימים, או 14 ימים לאחר הציפוי ממלאי גליה קפוא. בר סולם, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונות ברזולוציה גבוהה של הכנת coverslipsed עם חרוזי פרפין. (A, B) דוגמאות כמו שצריך להחיל חרוזי פרפין. (C, D) דוגמאות של חרוזים פרפין מיושם באופן שגוי. α: יותר מ חרוז אחד יושם באותו המיקום. β: החרוז הצליח להיות ממוקם כראוי על coverslip. χ: החרוז היה מיושם קרוב מדי למרכז coverslip. δ: החרוז היה גבוה מדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. בניגוד שלב תמונות של שלבי ההתפתחות של הנוירונים העיקריים בתרבות. בר סולם, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ההוא דמות.
איור 4. תמונות Immunofluorescence של נוירונים העיקרי ב 17 ימים במבחנה. הנוירונים תוקנו עם פורמלדהיד 4% סוכרוז 4% ב PBS עבור 12 דקות, ולאחר מכן permeabilized עם 0.25% Triton X-100 עבור 5 דקות. לאחר חסימת עם BSA 10% ב PBS עבור 30 דקות, הנוירונים הודגרו לילה בשעה 4 ° C עם נוגדנים ראשוניים מיושם BSA 3% ב PBS. נוגדנים ראשיים שימשו כדלקמן: אנטי synapsin לי (ארנב, 1: 2000),-drebrin אנטי (IgG1 העכבר, 1: 8, שיבוט M2F6, supernatant היברידומה), אנטי-MAP2 (polyclonal עוף IgY, 1: 5000), ואנטי-טאו-1 (עכבר IgG2a, 1: 2000, שיבוט PC1C6; מזהה טאו dephosphorylated). התאים נשטפו אז עם PBS וטופחו עם מינים-או מתאימים נוגדנים משני ספציפי אלוטיפ ב BSA 3% ב PBS עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס. נוגדנים משניים משמשים היו כמו folלשפל: אלקסה 488 מצומדות אנטי עכבר IgG2a (1: 500), Alexa 568 מצומדות ארנבת אנטי (1: 500), אלקסה 647 מצומדות אנטי עכבר IgG1 (1: 500), ו AMCA מצומדות אנטי-עוף IgY (החמור IgG, 1: 200). בר סולם, 10 מיקרומטר ו 2.5 מיקרומטר, כמצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד השיטה "כריך" של נוירונים culturing כבר היטב תיאר במקום 2, 11, ישנם מספר צעדים בכל פרוטוקול כי הם די קשה לתאר בצורה של טקסט בלבד, מה שעלול להוביל לתסכול עבור חוקרים המבקשים לאמץ אותו.
השיטה ניתן לחלק לשלוש זרימות עבודה רחבות: תרבות גליה, הכנת coverslip ותרבות נוירון ותחזוקה. כל אחד מהשלוש ההכנות הם קריטיים עבור תרבויות נוירון איכותיות ושיקולים חשובים חייבים לזכור. לפני הציפוי הנוירונים, שכבת מזין גליה אידיאלית צריכה להיות אוכלוסייה הומוגנית של אסטרוציטים להיות בין 50-70% מפגש. זה יבטיח תמיכה טרופית מספיק מהשכבה המזינה גליה. חשוב להבטיח כי התרבות astroglial יש זיהום מינימלי של סוגי תאים אחרים, במיוחד microglia, אשר באופן רופף attacתאי הד ופרופ מעוגלים. Microglia ציטוקינים שחרורו, אשר משפיעים לרעה על בריאות הנוירון הישרדות 12. הסרום, או סוס בסרום או בסרום צמיחה שור, יכול להיות משתנה ממגרש למגרש. סינון קפדני של כמה הרבה בסרום צריכה להתבצע לפני שתחליט להשתמש הרבה ספציפי.
הכנת Coverslip היא צעד חשוב נוסף. איכות הזכוכית ואת הפרוטוקול המשמש לניקוי שלה הן קריטית עבור נוירונים מפותחים ובריאים. אם השיטה היא להיות מאומצת חדש במעבדה, זה יהיה שווה בדיקת coverslips זכוכית ממספר ספקים. עבור ניקוי של coverslips, כמה מעבדות לספוג coverslips ב 70% חומצה חנקתית עבור 18-36 h בעוד שאחרים עושים זאת רק 1 שעות ב sonicator. קריטריון חשוב של coverslips הנקי הוא שפתרון פולי- L- ליזין צריך להתפשט באופן שווה על פני השטח. שיקול חשוב נוסף הוא כי חרוזי פראפין להחיל את coverslips צריכים להיות בגובה מתאיםקוטר להיות מחומם בטמפרטורה הנכונה, כפי שמתואר בפרוטוקול.
לקבלת נוירונים, יכול להיות גזור hippocampi מן 17-19 חולדות יום עובריים. למרות דיסקציה בשלב זה מוביל מעט מאוד תאי גליה, התפשטות גליה יכול להיעצר על ידי הוספת סוכן אנטי mitotic ערה-C לאחר 2-3 ימים של תרבות. טחינה הדקה של רקמה בהיפוקמפוס trypsinized ידי טיפי פיפטה אש מלוטשת היא קריטית כדי לנתק את הרקמה לתוך תאים בודדים מבלי לפגוע בתאים עצמם. מדיום הצמיחה ותחזוקה העצבי להשתמש בפרוטוקול זה הוא תוספת Neurobasal + L-Glutamine + B27. L-Glutamine עשוי להיות מוחלף על ידי Glutamax, שהוא יציב יותר במדיום התרבות. איכות תוסף B27 יכול להשתנות ממגרש למגרש, וכך זה צריך להיבדק לפני השימוש הרבה ספציפיים לתרבות לטווח ארוך יותר. הרבה עניים של B27 עלול לגרום נוירונים להתגבש. מוצרים חלופיים כגון GS21 ו SM1 כבר מצאו להיות תחליפים טובים B27.נוירונים גדלו במשך יותר משבוע צריכים להיות מוזנים עם מדיום חדש כל שבוע, שבה שליש המדיום מוחלף מדי שבוע.
שיטה זו של culturing לתאי עצב יכול להוכיח שלא תסולא בפז ניסויים המסתמכים על אוכלוסיות נוירונים טהורות עם מעט או ללא זיהום גליה. נוירונים בצפיפות נמוכה גדלו בשיטה זו בדרך כלל לשרוד במשך כמה שבועות עם סוכות מפותחות, קשרים סינפטיים ומאפייני רשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי MOP-142,209 CIHR כדי TJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
