Summary
Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.
Abstract
La capacidad para sondar la estructura y fisiología de las células nerviosas individuales en cultivo es crucial para el estudio de la neurobiología, y permite la flexibilidad en la manipulación genética y química de las células individuales o redes definidas. Tal facilidad de manipulación es más sencilla en el sistema de cultivo reducido en comparación con el tejido cerebral intacta. Aunque existen muchos métodos para el aislamiento y crecimiento de estas neuronas primarias, cada uno tiene sus propias limitaciones. Este protocolo describe un método para el cultivo de baja densidad y de roedores de alta pureza neuronas del hipocampo embrionarias en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales. Esta 'cultura sándwich' permite el crecimiento exclusiva a largo plazo de una población de neuronas permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son de edad suficiente o nivel de madurez, los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales. Las neuronas grown por este método normalmente sobrevivir durante varias semanas y desarrollar amplias pérgolas, conexiones sinápticas, y propiedades de la red.
Introduction
El cerebro está organizado en intrincadas redes de neuronas. La contribución de las neuronas individuales a la actividad de red y la función cerebral puede ser estudiada por la alteración selectiva de su composición molecular y perturbación de sus propiedades fisiológicas. La manipulación genética y química de las neuronas individuales es posiblemente más fácil en neuronas cultivadas que en el tejido del cerebro intacto, sin el estorbo de la heterogeneidad y complejidad celular de este último. Las neuronas en cultivo desarrollan axonal bien definido y cenadores dendríticas y forman extensas conexiones sinápticas entre sí.
Mientras que la cultura de las neuronas de animales adultos o de otras regiones del sistema nervioso es posible, cultivos de hipocampo embrionarias son frecuentemente preferidos debido a su población celular piramidal definida y una densidad relativamente baja glial 1, 2. Las neuronas del hipocampo cultivadas a baja densidad en cultivo son particularmente AMEnable al estudio de la localización subcelular, el tráfico de proteínas, la polaridad neuronal y desarrollo de sinapsis. Las neuronas en cultivo también se han empleado ampliamente en el estudio de los procesos moleculares en la plasticidad sináptica 3, 4, 5, 6. Preparaciones de cultivos de neuronas de ratones con deleciones genéticas globales que no sobreviven después del nacimiento han sido especialmente útil en el estudio de funciones celulares y sinápticas de ciertos genes 7.
Al igual que en el cerebro, las neuronas del hipocampo en cultivo dependen de soporte trófico de las células gliales. Esto complica su cultura, y ha llevado al desarrollo de varios métodos diferentes de los que se toma este apoyo. Un método comúnmente utilizado implica chapado neuronas directamente sobre una monocapa de células gliales 8, o permitiendo que las células gliales contaminantes de la hipp adquiridotejido ocampal a proliferar y formar una monocapa debajo de las neuronas 9. Si bien este método ha encontrado cierto éxito, la impureza de la cultura neuronal resultante es desventajoso para los experimentos de imagen. Otro método utilizado comúnmente de la cultura neurona es dejar de salida del alimentador glial capa por completo, y en lugar de proporcionar soporte trófico en la forma de un medio de crecimiento definido 10.
A continuación, se describe el método de "banquero" de la cultura de la neurona 2, 11 "sándwich" o. Este método consiste en placas las neuronas del hipocampo en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales separadas por perlas de cera de parafina. Esto facilita cultivo a largo plazo de una población homogénea de neuronas sin contaminar glia permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son mayores de edad o nivel de madurez suficiente,los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales.
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Protocol
Todos los experimentos y protocolos que utilizan animales de laboratorio fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Manitoba y se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.
1. Preparación de instrumentos, tampones y soluciones
- Esterilizar en autoclave todos los equipos de la disección, pipetas Pasteur de vidrio, puntas de pipeta, aparato de filtro, y agua desionizada.
- Preparar un 20% (w / v; 1,1 M) solución madre de glucosa en agua desionizada y se filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de piruvato de sodio 100 mM en agua desionizada y el filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar solución salina equilibrada de calcio y de magnesio libre Hank (CMF-HBSS) haciendo una solución de 10% HBSS (10x), HEPES 10 mM, y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina en agua desionizada. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses.
- Preparar 10 mg / ml de desoxirribonucleasa I (ADNasa) en CMF-HBSS,y luego filtrar-esterilizar y almacenar a -20 ° C.
- Preparar medio glial haciendo una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), 95 U / ml de penicilina-estreptomicina, y 10-15% de suero de crecimiento bovina (BGS) en medio esencial mínimo (MEM).
NOTA: Como se indica en el protocolo, una solución de 5% BGS se puede utilizar si es necesario para frenar la proliferación celular. Suero de Caballo se puede utilizar en lugar de BGS, pero tenga en cuenta que cada lote debe ser probado antes de su uso debido a la variación inter-lote. Almacenar la solución preparada a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. Aunque muchos laboratorios utilizan FBS, se observó consistentemente que el crecimiento glial en BGS es tan robusto como en FBS. BGS se deriva de suero de ternera fetal que se complementa con componentes químicamente definidos. Además, BGS es sustancialmente más económico que FBS. - Preparar el crecimiento de neuronas y medio de mantenimiento (neurobasal-B27, NBG) haciendo una solución de 1x B27 suplemento y 0,5 mM de L-glutamina en 500 ml de Neurobasal Medium. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. L-glutamina puede estar sustituido con GlutaMAX, que ha sido sugerido para ser más estable en el medio de crecimiento.
- Preparar la neurona medio de siembra al hacer una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), piruvato de sodio 1 mM (a partir de la solución estéril), y 10% BGS en MEM. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses.
- Preparar una solución de citarabina 1 mM (Ara-C) y el filtro a esterilizar. Alícuota en porciones de 1 ml y almacenar a -20 ° C.
- Preparar una solución de mM APV 100 en NaOH esterilizada-filtro de 100 mN. Almacenar a -20 ° C.
- Disolver 1 mg / ml de poli-L-lisina en tampón de borato, pH 8,5 (50 mM de ácido bórico y bórax 12 mM) y el filtro a esterilizar. Alícuota y almacenar a -20 ° C. En lugar de poli-L-lisina, se puede usar poli-L-ornitina que puede ser menos tóxico para las células.
2. Glia Cultura Preparación
- Preparar cultivo celular astroglia cortical
- Pulverizar las crías con 70% de etanol y decapitar a ellos.
- Colocar las cabezas en un plato de 100 mm en el hielo que contiene 15 ml CMF-HBSS.
- Diseccionar cada cerebro cortando el cuero cabelludo, abrir el cráneo, cortando el tronco cerebral, y luego transferir el cerebro a 60 mm placas de Petri en el hielo que contenía 3 ml CMF-HBSS.
- Separar los hemisferios cerebrales del hipocampo y luego tira lejos las meninges que rodean ellos. Ejercer precaución adecuada para asegurar la contaminación mínima a partir de fibroblastos meníngeos. fibroblastos meníngeos en la cultura puede competir con la glía para el crecimiento y ser perjudiciales para la salud de las neuronas. Recoge todas las hemisferios cerebrales en un 60 mm placa de Petri en el hielo que contiene 5 ml CMF-HBSS.
- Eliminar la CMF-HBSS y luego picar el tejido cortical recogido tan finamente como sea posible usando resorte-tijeras-micro disección.
- Añadir suficiente CMF-HBSS para la chuletatejido ped. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir las piezas de tejido a un tubo de 15 ml. Llevar el volumen total a 12 ml mediante la adición de CMF-HBSS.
- Añadir 1,5 ml de cada uno de 2,5% de tripsina y 10 mg / ml de solución de DNasa. Incubar la mezcla resultante a 37 ° C en un baño de agua durante 12 min.
- Se tritura el tejido 10-15 veces usando una pipeta Pasteur de vidrio, y más en incubar en un baño de agua a 37 ° durante 3 min.
- Filtrar el sobrenadante a través de papel de la lente o de una malla de filtro en un tubo de 50 ml que contenía 5 ml de BGS. Esto se hace para eliminar trozos de tejido no disociado. Alternativamente, utilizar tamices de células disponibles comercialmente.
- Añadir 13,5 ml de CMF-HBSS y 1,5 ml de 2,5% de tripsina al tubo que contiene las piezas de tejido restantes y además incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 10 min adicionales.
- Se tritura el tejido restante una vez más, y luego filtrar la suspensión de nuevo en el tubo de 50 ml que contiene el filtrado inicial. A continuación, enjuagar la lepapel ns con 3 ml de BGS. El volumen final debe ser de aproximadamente 38 ml.
- Centrifugar la suspensión que contiene las células gliales disociadas durante 6 min a 130 x g. deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. Asegúrese de que las células sedimentadas en el fondo no se vean perturbadas. La parte inferior de la pastilla aparece ligeramente rojizo que contienen componentes de la sangre.
- Transferencia de las células gliales en 1 ml de medio glial en un tubo nuevo, teniendo cuidado de no perturbar la porción rojizo de la pastilla.
- Añadir hasta 2 ml de medio glial por pup para resuspender el combinado disociarse células gliales. Por ejemplo, se utilizaron si 10 crías, y después el volumen total resuspensión fuera 20 ml.
- Preparar matraz de cultivo de uno 75 cm 2 de células por cachorro. Añadir 18 ml de medio de glial pre-calentado a cada matraz.
- Transferencia de 2 ml de suspensión celular a cada matraz y se incuban en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
- Después de un día, reemplazar con 20 ml glial medio. En esta etapa, el cultivo es una mezcla de glial y otros tipos de células no deseadas.
- Cuatro días después de sembrar las células, agitar vigorosamente los matraces para desalojar las células no de astrocitos. Para ello, enjuagar los matraces una vez con CMF-HBSS, y luego añadir 10 ml fresco CMF-HBSS a cada matraz. Agitar vigorosamente los matraces de 5-10 veces, y luego aspirar fuera de la CMF-HBSS. Enjuague dos veces con CMF-HBSS y, a continuación añadir 20 ml de medio de glial.
NOTA: Este paso es crucial para asegurar la eliminación de tipos de células no objetivo, y no debe dar lugar a la pérdida de los astrocitos deseados. - Reemplazar con medio glial fresco dos veces a la semana hasta que las células son confluentes (Figura 1).
- glía congelación
- Una vez que son confluentes las culturas, aspirar fuera el medio y lavar la monocapa de células con 10 ml de CMF-HBSS.
- Añadir 10 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a cada matraz y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
- matraces golpear suavemente para desalojar las células. Añadir 1 ml BGS to cada matraz y la transferencia de las suspensiones de células en tubos de 15 ml.
- Centrifugar los tubos a 130 xg durante 6 min. Descartar el sobrenadante resultante.
- Resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de glial.
- Preparar el medio de congelación glial (dimetilsulfóxido 1-parte y 4 partes BGS). Añadir 0,5 ml de esta solución a cada uno de 4 viales criogénicos por matraz.
- Transferir 0,5 ml de suspensión celular a cada vial, y a continuación, congelar las células lentamente mediante la colocación de los viales en un recipiente aislado en un congelador C -80 ° durante la noche. Después de un día, la transferencia de los viales a un congelador de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
- Chapado revivió glía
- glía Plate 1-2 semanas antes del día de la cultura de las neuronas.
- Preparar un ml tubo 50 con 10 ml calentó medio glial.
- Descongelar 1 vial congelado de la glía en un baño de agua a 37 ° durante 2-3 min.
- Transferir el contenido del vial en el tubo de 50 ml que contiene 10 ml de medio de glial.
- centrifuge el tubo durante 5 minutos a 130 xg y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 20 ml de medio de glial.
- Añadir 3 ml de medio de glial fresco a cada una de las placas de cultivo (60 mm), y luego transferir 1 mL de la suspensión celular a cada plato. Incubar los cultivos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
- Alimentar las células dos veces a la semana. Si la densidad celular alcanza% de confluencia 50 mucho antes de la cultura día neurona, cambiar a medio glial que contiene 5% BGS para ralentizar la tasa de crecimiento glial. La confluencia deseada de la monocapa glial para la cultura neurona es 50% - 70%.
- Reemplazar el medio glial con medio NBG (6 ml / placa) 1-2 días antes de la cultura neurona.
3. Coverslip Preparación
- Limpieza y Preparación de perlas de parafina
- Sumergir cubreobjetos en ácido nítrico concentrado (70% peso / peso; PRECAUCIÓN: altamente corrosivo) y someter a ultrasonidos ellos durante 30 min a temperatura ambiente. Otros laboratorios han found que es beneficioso para incubar los cubreobjetos en ácido nítrico al 70% en bastidores de cerámica durante 12-24 h a temperatura ambiente en su lugar.
- desechar cuidadosamente el ácido nítrico en una campana de humos química designada de acuerdo a las directrices institucionales. Lavar los cubreobjetos 3-5 veces con agua desionizada.
- Sumergir los cubreobjetos en agua desionizada y someter a ultrasonidos de nuevo durante 30 min (omitir si siguiendo el método alternativo).
- Eliminar el agua desionizada y enjuagar los cubreobjetos otras tres veces.
- Sumergir los cubreobjetos en 50 ml de agua desionizada y esterilizarlas en autoclave. Alternativamente, esterilizar los cubreobjetos a 225 ° C en un horno durante 6 h. Si se utiliza este enfoque alternativo, vaya al paso 3.1.9.
- Una vez tratada en autoclave, transferir los cubreobjetos a una campana de flujo laminar estéril para los pasos siguientes.
- Eliminar el agua desionizada y enjuague con 20-30 ml de etanol al 100%.
- Añadir 20-30 ml de etanol al 100% y transferir los cubreobjetos y seetanol a una placa de Petri de 100 mm.
- Use pinzas romas para transferir cubreobjetos de 60 mm placas de Petri, 4-5 cubreobjetos por placa, y luego permitir que se seque al aire apoyándose los cubreobjetos contra el borde del plato. Una vez que el etanol se ha evaporado, sentar las cubreobjetos plana en la superficie.
- Transferir 10 g de parafina a una botella de vidrio resistente al calor adecuado. Derretir la parafina y mantenerla a aproximadamente 150-200 ° C sobre una placa caliente durante al menos 1 h. La temperatura ideal a la que la parafina se debe calentar puede tomar algunos ajustes. temperaturas no ideales puede conducir a la dificultad para producir el tamaño correcto de las perlas de parafina. El período de espera después de la fusión ayuda a asegurar una temperatura constante durante todo el líquido.
- Sumergir una pipeta Pasteur en la parafina, y luego rápidamente tocarlo para tres puntos cerca del borde de cada cubreobjetos (cada punto es aproximadamente de 120 ° de separación). Las gotas se solidifican en perlas de aproximadamente 0,3-0,5 mm de alto y 1,0-2,0 mm de diameter y funcionará para proporcionar un espacio entre las neuronas en el cubreobjetos y la monocapa glial a continuación (Figura 2).
- Esterilizar los platos bajo luz UV durante 30 min, y luego cubrir con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente. cubreobjetos preparados pueden ser almacenados y utilizados hasta por un mes. perlas de parafina se debe permitir que se adhieran a los cubreobjetos durante al menos una semana antes de su uso. Esto evitará que la parafina se desprenda durante los pasos restantes del protocolo.
- Los cubreobjetos de recubrimiento con poli-L-lisina
- Obtener placas de Petri que contienen cubreobjetos previamente preparadas con las perlas de parafina.
- Añadir 200! L de poli-L-lisina en tampón de borato a la superficie de cada cubreobjetos y dejar que la solución se asiente en los cubreobjetos durante la noche, cubierto, a temperatura ambiente. Escudo la misma superficie que aquella en la que están situadas las perlas de parafina. Tenga en cuenta que si se limpian adecuadamente, la poli-L-lisina debe propagarse fácilmentepara cubrir la superficie del cubreobjetos.
- Después de un día, lavar los cubreobjetos dos veces por remojo en agua desionizada estéril para 2 h cada vez. Después del lavado final, reemplazar el agua con 4 ml de medio de chapado neuronal por plato. Tenga en cuenta que es importante que la superficie de los cubreobjetos no permitir que se seque después de haber sido revestido con poli-L-lisina.
- Colocar las cápsulas que contienen cubreobjetos-en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Los cubreobjetos recubiertos deben incubarse durante al menos 24 h antes de la cultura neurona. Esto se hace para preparar el medio para el cultivo de neuronas.
4. La disección del hipocampo y neuronas Plating
- Obtener una rata preñada (día embrionario 18-19, medido desde el día del descubrimiento tapón vaginal) y la eutanasia por decapitación isoflurano anestesiados u otro método aprobado.
- Pulverizar la parte inferior de la rata con 70% de etanol, y luego hacer una incisión de la región púbica throuf al extremo de la cavidad abdominal. Para evitar la contaminación, tener cuidado de cortar sólo a través de la piel en este paso.
- Enjuagar los instrumentos de disección de nuevo con 70% de etanol, y luego se corta a través de la pared abdominal para exponer el útero. Retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un 100 mm placa de Petri estéril.
- Realizar los pasos restantes en una campana de flujo laminar. Retire la membrana uterina que rodea a los fetos. Decapitar a ellos y colocar las cabezas en una placa de Petri de 100 mm que contiene 20 ml CMF-HBSS.
- Diseccionar el cerebro e inmediatamente colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 2 ml CMF-HBSS en hielo. Recoger sólo 2-3 cerebros por placa para permitir espacio suficiente para el paso siguiente.
- Bajo un microscopio de disección tira lejos las meninges de la línea media de los hemisferios cerebrales, y luego diseccionar los hipocampos y colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 4,5 ml CMF-HBSS. Tenga en cuenta que el hipocampo puede ser distinguido como una estruc forma de media lunatura en la superficie medial del hemisferio cortical, y es fácil de eliminar, ya que está bordeado lateralmente por un ventrículo.
- Transferir el tejido del hipocampo recogido y CMF-HBSS a un tubo de 15 ml. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina, y luego se incuba a 37 ° C durante 10 min. La papaína se puede utilizar en lugar de la tripsina, ya que es más suave y puede aumentar el rendimiento.
- eliminar suavemente la solución de tripsina por pipeta Pasteur, dejando el tejido del hipocampo no alterados en la parte inferior del tubo.
- Lavar suavemente el tejido dos veces con 5 ml CMF-HBSS mientras que la incubación a 37 ° C durante 5 min. Después del segundo lavado, llevar el volumen total a al menos 5 ml mediante la adición de un volumen suficiente de CMF-HBSS al tejido. Si hay hipocampos de más de 10 crías, hasta 8 ml CMF-HBSS se puede añadir.
- Preparar dos variantes de pipetas pulida al fuego para la disociación del tejido. La punta de una variante es del diámetro normal de la pipeta, pero con bordes smoothened pulida al fuego. La otra varihormiga es uno con el diámetro de la punta reducido a la mitad. Brevemente exponer la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en diagonal a una fuente de llama, y luego examinar las puntas de las pipetas.
- Repita este paso hasta que el borde de la punta había sido smoothened o el diámetro se ha reducido. Es importante practicar para encontrar el diámetro ideal para asegurar que el tejido se disocia para producir células individuales sin dañar estas células.
- Se tritura el tejido del hipocampo primero por cerca de 10 pases a través de una pipeta Pasteur de vidrio normal, de bordes lisos, y luego un adicional de 5 a 10 pases a través de la pipeta con el diámetro reducido. El objetivo es obtener una solución homogénea de células sin o con muy pocos grumos de tejido.
- Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Típicamente, se obtienen 0,8 a 1,0 millones de células por pup cuando se combinan hipocampos de los dos hemisferios.
- Transferir un volumen suficiente de la suspensión de células a platosque contiene cubreobjetos de poli-L-lisina en 4 ml medio de siembra para obtener una densidad de placas de 300.000 células por placa de 60 mm. La densidad de las células puede variar de 100.000 a 500.000, dependiendo del experimento previsto.
- Después de 3-4 h, transferir los cubreobjetos con las neuronas unidos a platos que contienen células gliales en medio NBG. Esto debe hacerse de tal manera que el lado en el que se sembraron las neuronas se enfrenta hacia abajo hacia la capa de células glial. Añadir un total de 4-5 cubreobjetos por placa de células gliales.
- Dos o tres días después de la siembra, añadir la solución de Ara-C a una concentración final de 5 mM por placa para detener el crecimiento glial.
- Alimentar a las células una vez a la semana mediante la sustitución de 2 ml de la vieja medio con 2,5 ml de medio fresco en cada alimentación. El medio extra añadido es para compensar la evaporación con el tiempo, y sólo una parte del medio se cambia para garantizar acondicionado coherente del medio por las células gliales. Estos cultivos son típicamente sanos durante al menos un mes (La Figura 3). la supervivencia neuronal se puede mejorar mediante la adición de APV al medio de cultivo a una concentración final de 100? M. APV es un antagonista del receptor NMDA y promueve la supervivencia mediante la reducción de la excitotoxicidad del glutamato.
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Representative Results
En este método "sandwich" de cultivo de células de nervio primario, las neuronas del hipocampo (Figura 3) crecen en una cama de células gliales (Figura 1) separadas por perlas de parafina (Figura 2). Esto asegura que las neuronas crezcan selectivamente en cubreobjetos de vidrio con la contaminación de células glial mínima, pero reciben soporte trófico adecuada de la glía que crecen en la placa de cultivo tisular. Típicamente, las neuronas se pueden mantener en cultivo durante> 3 semanas y se desarrollan extensa arborización con axones y dendritas bien desarrollados identificados por su típico inmunotinción dephospho-Tau y MAP2, respectivamente (Figura 4). neuronas maduras desarrollan espinas sinápticas identificados por localización selectiva de marcador postsináptica Drebrin1 a estos compartimentos. Estas espinas sinápticas están estrechamente yuxtapuestas a las especializaciones presinápticos, que se identifican por sináptica marcador vesícula Synapsin1 inmunotinción. losproximidad de los sitios de pre y postsinápticos indica bien desarrollada y las sinapsis correctamente alineados. Estas neuronas primarias son muy adecuados para los estudios funcionales y estructurales de las neuronas y sinapsis. Estos incluyen, pero no se limitan a, los estudios sobre la transducción de señales, la polaridad neuronal, el tráfico subcelular y el desarrollo de sinapsis y la plasticidad.
Figura imágenes de contraste 1. Fase de cultivos gliales tomadas 1 día, 7 días, o 14 días después de la siembra de la acción glial congelado. Barra de escala, 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes de alta resolución de cubreobjetos prepared con los granos de parafina. (A, B) Ejemplos de correctamente aplicadas perlas de parafina. (C, D) Los ejemplos de perlas de parafina aplicadas incorrectamente. α: Más de una perla se aplicó en el mismo lugar. β: La cuenta no pudo ser adecuadamente situado en el portaobjetos. χ: Se aplicó el grano demasiado cerca del centro del cubreobjetos. δ: El cordón era demasiado alto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes de contraste de fase de las etapas de desarrollo de las neuronas primarias en cultivo. Barra de escala, 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.
Figura 4. Imágenes de inmunofluorescencia de las neuronas primarias a los 17 días in vitro. Las neuronas se fijaron con formaldehído al 4% y 4% de sacarosa en PBS durante 12 min, y luego se permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 durante 5 min. Después de bloquear con 10% de BSA en PBS durante 30 min, las neuronas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios aplican en 3% de BSA en PBS. Los anticuerpos primarios se utilizaron como sigue: anti-sinapsina I (conejo, 1: 2000), anti-drebrin (IgG1 de ratón, 1: 8, clon M2F6, sobrenadante de hibridoma), anti-MAP2 (policlonal de IgY de pollo, 1: 5000), y anti-Tau-1 (IgG2a de ratón, 1: 2000, clon PC1C6; reconoce tau desfosforilado). Después, las células se lavaron con PBS y se incubaron con especies o apropiado anticuerpos secundarios específicos de isotipo en 3% de BSA en PBS durante 1 h a 37 ° C. Los anticuerpos secundarios utilizados eran como folmínimos: Alexa 488-conjugado anti-ratón IgG2a (1: 500), Alexa 568-conjugado anti-conejo (1: 500), Alexa 647 conjugado con anti-IgG1 de ratón (1: 500), y AMCA-conjugado anti-pollo IgY (burro IgG, 1: 200). Barra de escala, 10 m y 2,5 m, como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mientras que el método "sandwich" de las neuronas que el cultivo haya sido bien descrito en otras partes 2, 11, hay varios pasos a lo largo del protocolo que son muy difíciles de describir en texto por sí solo, que puede conducir a la frustración para los investigadores que desean adoptarlo.
El método se puede dividir en tres grandes flujos de trabajo: cultura glial, preparación cubreobjetos y cultivo de neuronas y de mantenimiento. Cada una de las tres preparaciones son críticos para cultivos de neuronas de alta calidad y varias consideraciones importantes que deben tenerse en cuenta. Antes de chapado neuronas, la capa alimentadora glial ideal debería ser una población homogénea de astrocitos y estar entre 50-70% de confluencia. Esto aseguraría suficiente soporte trófico de la capa alimentadora glial. Es importante asegurarse de que la cultura astroglial tiene la mínima contaminación de otros tipos de células, en particular microglia, que son libremente attaccélulas HED y redondeadas. Citoquinas de liberación de microglia, que son perjudiciales para la salud de las neuronas y la supervivencia 12. El suero de suero, ya sea caballo o suero bovina del crecimiento, pueden ser variables de lote a lote. una cuidadosa selección de varios lotes de suero se debe realizar antes de decidir utilizar un lote específico.
preparación Coverslip es otro paso importante. La calidad del vidrio y el protocolo aplicado para su limpieza son críticos para la salud neuronas bien desarrollados. Si el método está siendo adoptado recientemente en un laboratorio, que valdría la pena probar cubreobjetos de vidrio de varios proveedores. Para la limpieza de los cubreobjetos, algunos laboratorios remojo cubreobjetos en ácido nítrico al 70% para 18-36 h, mientras que otros lo hacen por sólo 1 h en un aparato de ultrasonidos. Un criterio importante de cubreobjetos limpio es que la solución de poli-L-lisina debe extender uniformemente sobre la superficie. Otra consideración importante es que las perlas de cera de parafina aplicadas a los cubreobjetos deben ser de altura apropiada yde diámetro y se calienta a la temperatura adecuada, tal como se describe en el protocolo.
Para la obtención de las neuronas, hipocampos se pueden disecados de embriones de día 17-19 ratas. Aunque la disección en esta etapa conduce a muy pocas células gliales, la proliferación glial puede ser detenido mediante la adición del agente anti-mitótico Ara-C después de 2-3 días de cultivo. La trituración del tejido del hipocampo se trataron con tripsina con puntas de pipeta pulida al fuego es fundamental para disociar el tejido en células individuales sin dañar las propias células. El medio de crecimiento y mantenimiento neuronal utilizado en este protocolo es suplemento Neurobasal + L-glutamina + B27. L-Glutamina puede estar sustituido por GlutaMAX, que es más estable en el medio de cultivo. La calidad del suplemento B27 puede variar de un lote a otro, y lo que debe ser probado antes de usar un lote específico para el cultivo a largo plazo. Una gran cantidad de pobres B27 puede provocar que las neuronas se agrupan. Alternativas tales como GS21 y SM1 se han encontrado para ser buenos sustitutos de B27.Las neuronas cultivadas por más de una semana deben ser alimentados con medio fresco cada semana, en el que un tercio del medio se sustituye cada semana.
Este método de cultivo de células nerviosas puede resultar muy valiosa para los experimentos que se basan en poblaciones neuronales puros con poca o ninguna contaminación de la glía. neuronas de baja densidad cultivadas usando este método típicamente sobreviven durante varias semanas con cenadores bien desarrollados, las conexiones sinápticas y propiedades de red.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por CIHR RP-142209 a TJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
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