Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for dyrking av lav tetthet primære hippocampale nerveceller som vokser på dekkglass på hodet over en glial monolag. Neuron og glial sjiktene er adskilt av parafinvoksperler. Nervecellene dyrkes ved denne metode er egnet for høy oppløsning optisk avbildning og funksjonelle analyser.
Abstract
Evnen til å undersøke strukturen og fysiologi av individuelle nerveceller i kultur er avgjørende for studiet av nevrobiologi, og gir rom for fleksibilitet i genetisk og kjemisk manipulering av enkeltceller eller definerte nettverk. En slik lett manipulering er enklere i det reduserte kultursystemet sammenlignet med det intakte hjernevev. Selv om mange fremgangsmåter for isolering og vekst av disse primære neuroner finnes, hver har sine egne begrensninger. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for dyrking av lav tetthet og med høy renhet embryoniske gnager hippocampalneuroner på dekkglass, som deretter forløper over et monolag av gliaceller. Denne 'sandwich-kultur' gir mulighet for eksklusive langsiktig vekst av en populasjon av nerveceller, samtidig som for trofisk støtte fra den underliggende glial monolayer. Når neuroner er av tilstrekkelig alder eller modenhet, kan nervecellen Dekk vippes ut av glial fatet og anvendt i avbildning eller funksjonelle analyser. Nerveceller grown av denne metoden vanligvis overleve i flere uker og utvikle omfattende lysthus, synaptiske forbindelser og nettverksegenskaper.
Introduction
Hjernen er organisert i intrikate nettverk av nerveceller. Bidraget av individuelle neuroner overfor nettaktivitet og hjernefunksjonen kan studeres ved selektiv endring av deres molekylære sammensetning og perturbance av deres fysiologiske egenskaper. Genetisk og kjemisk manipulering av individuelle nevroner er kanskje enklere i dyrkede nerveceller enn i intakte hjernevev, uhemmet av sistnevntes cellulær heterogenitet og kompleksitet. Neuroner i kultur utvikle veldefinert aksonal og dendrittiske arbors og danner omfattende synaptiske forbindelser med hverandre.
Mens neuron kultur fra voksne dyr eller fra andre regioner av nervesystemet er mulig, blir embryoniske hippocampale kulturer ofte foretrukket grunnet sin definert pyramidal cellepopulasjon og forholdsvis lav densitet glial 1, 2. Hippocampalneuroner dyrket ved lav tetthet i kulturen er spesielt amenable til studiet av subcellulære lokalisering, protein handel, neuronal polaritet og synapse utvikling. Neuroner i kultur er også blitt omfattende anvendt for å studere molekylære prosesser i synaptisk plastisitet 3, 4, 5, 6. Neuron kultur preparater fra mus med globale genetiske slettinger som ikke overlever fødselen har vært spesielt nyttig i å studere cellulære og synaptiske roller visse gener 7.
Som i hjernen, dyrkede hippocampale neuroner er avhengig av trofisk støtte fra gliaceller. Dette kompliserer deres kultur, og har ført til utvikling av flere forskjellige fremgangsmåter ved hvilke denne støtten er som følger. En vanlig anvendt metode omfatter plette neuroner direkte på et monolag av gliaceller 8, eller slik at forurensende gliaceller fra den innhentede Hippocampal vev å proliferere og danne et monolag under neurons 9. Selv om denne metoden har funnet en viss suksess, forurensningen av den resulterende neuronal kulturen er ufordelaktig for bildebehandling eksperimenter. En annen vanlig anvendt metode for neuron kulturen er å la ut glial matelag helt, og i stedet gi trofisk støtte i form av en definert vekstmedium 10.
Her beskriver vi "sandwich" eller "Banker" metode for neuron kultur 2, 11. Denne metoden innebærer å belegge hippocampalneuroner på dekkglass, som deretter forløper over et monolag av gliaceller adskilt av parafinvoksperler. Dette muliggjør langtidskultur av en homogen populasjon av nerveceller uten å forurense glia, samtidig som for trofisk støtte fra den underliggende glial monolag. Når nerveceller er av tilstrekkelig alder eller modenhetsnivå,nervecellen Dekkglass kan vippes ut av glial fatet og anvendt i avbildning eller funksjonelle analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter og protokoller som bruker forsøksdyr ble godkjent av University of Manitoba dyreetikk komité og var i samsvar med retningslinjene fra det kanadiske Council on Animal Care.
1. Fremstilling av Instrumenter, buffere og løsninger
- Steriliser ved autoklavering alt disseksjon utstyr, glass Pasteur pipetter, pipettespisser, filterinnretning, og avionisert vann.
- Fremstill en 20% (vekt / volum; 1,1 M) lagerglukoseløsning i avionisert vann og filter-steriliseres. Oppbevar ved 4 ° C.
- Fremstill en 100 mM natrium-pyruvat-oppløsning i avionisert vann og filter-steriliseres. Oppbevar ved 4 ° C.
- Forbered kalsium- og magnesium-fri Hanks balanserte saltløsning (CMF-HBSS) ved å lage en løsning av 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES og 100 U / ml penicillin-streptomycin i avionisert vann. Oppbevar ved 4 ° C for ikke mer enn en til to måneder.
- Forbered 10 mg / ml deoksyribonuklease I (DNase) i CMF-HBSS,og deretter filtrere-sterilisere og oppbevar ved -20 ° C.
- Forbered glial medium ved å lage en oppløsning av 30 mM glukose (fra den sterile løsning), 95 U / ml penicillin-streptomycin, og 10-15% bovint serum vekst (BGS) i Minimum Essential Medium (MEM).
MERK: Som angitt i protokollen, kan det brukes en oppløsning av 5% BGS hvis det er nødvendig å bremse celleproliferasjon. Hesteserum kan anvendes i stedet for BGS, men merk at hver gruppe må testes før bruk på grunn av inter-sats variasjon. Oppbevar den fremstilte oppløsning ved 4 ° C i ikke mer enn 1 til 2 måneder. Selv om mange laboratorier bruker FBS, vi konsekvent observert at glial vekst i BGS er så robust som i FBS. BGS er avledet fra kalvefosterserum som er supplert med kjemisk definerte komponenter. I tillegg er BGS vesentlig mer økonomisk enn FBS. - Klargjør neuronvekst og vedlikeholdsmedium (Neurobasal-B27, NBG) ved å lage en løsning av 1x B27 supplement og 0,5 mM L-glutamin i 500 ml Neurobasal Medium. Oppbevar ved 4 ° C for ikke mer enn en til to måneder. L-Glutamin kan være substituert med Glutamax, som er blitt foreslått å være mer stabil i vekstmediet.
- Klargjør neuron pletteringsmedium ved å lage en oppløsning av 30 mM glukose (fra den sterile løsning), 1 mM natrium pyruvat (fra den sterile løsning), og 10% BGS i MEM. Oppbevar ved 4 ° C for ikke mer enn en til to måneder.
- Fremstill en løsning av 1 mM cytarabin (Ara-C) og filter-steriliseres. Alikvoter inn i 1 ml porsjoner og lagre ved -20 ° C.
- Fremstill en løsning av 100 mM APV i 100 mN filtersterilisert NaOH. Oppbevar ved -20 ° C.
- Oppløs 1 mg / ml poly-L-lysin i boratbuffer, pH 8,5 (50 mM borsyre og boraks 12 mM) og filter-steriliseres. Delmengde og oppbevar ved -20 ° C. I stedet for poly-L-lysin, kan man anvende poly-L-ornitin, som kan være mindre toksisk for cellene.
2. Glia Culture Preparat
- Forbered kortikale astroglia cellekultur
- Spray valpene med 70% etanol og fremrykning dem.
- Plasser hodene i en 100 mm skål på is inneholdende 15 ml CMF-HBSS.
- Dissekere ut hver hjerne ved å kutte i hodebunnen, åpning av skallen og skjærer hjernestammen, og deretter overføre hjernen til 60 mm Petri skåler på is inneholdende 3 ml CMF-HBSS.
- Separer cerebrale hemisfærer fra hippocampi og deretter fjerner hjernehinnene som omgir dem. Utøve tilstrekkelig forholdsregler for å sikre minimal forurensning fra meningeal fibroblaster. Meningeale fibroblaster i kultur kan konkurrere med gliaceller for vekst og være skadelig for neuron helse. Samle alle de cerebrale hemisfærer i en 60 mm Petri skål på is inneholdende 5 ml CMF-HBSS.
- Fjern CMF-HBSS og deretter hakke oppsamlet kortikale vev så fint som mulig ved hjelp av mikro-dissekere fjær-saks.
- Legg tilstrekkelig CMF-HBSS å hoggeped vev. Ved hjelp av en glass Pasteur pipette overføres vevsstykkene til et 15 ml rør. Bringe det totale volum til 12 ml ved tilsetning av CMF-HBSS.
- Tilsett 1,5 ml hver av 2,5% trypsin og 10 mg / ml DNase-løsning. Inkuber den resulterende blanding ved 37 ° C i et vannbad i 12 min.
- Triturer det vev 10-15 ganger ved anvendelse av et glass Pasteur-pipette, og ytterligere inkuber det i et 37 ° C vannbad i 3 min.
- Filtrer supernatanten gjennom linsepapir eller en filterduk i et 50 ml rør inneholdende 5 ml av BGS. Dette gjøres for å fjerne biter av dissosiert vev. Alternativt kan bruke kommersielt tilgjengelig celle siler.
- Legg 13,5 ml CMF-HBSS, og 1,5 ml av 2,5% trypsin til røret som inneholdt de resterende vevsstykker og videre inkuberes det ved 37 ° C i et vannbad i ytterligere 10 minutter.
- Triturer det gjenværende vevet en gang til, og deretter filtreres suspensjonen på nytt inn i 50 ml rør inneholdende den opprinnelige filtrat. Deretter skylle lens papir med 3 ml BGS. Det endelige volum skal være ca. 38 ml.
- Sentrifuger suspensjonen inneholdende de dissosierte gliacellene i 6 minutter ved 130 x g. forkaste nøye supernatanten ved bruk av en glass Pasteur pipette. Sørg for at de pelleterte cellene i bunnen ikke blir forstyrret. Bunnen av pelleten vises noe rødlig inneholdende blodkomponenter.
- Overfør gliacellene i 1 ml glial medium inn i et nytt rør, tar seg ikke å forstyrre den rødlige delen av prosjektilet.
- Legg opp til 2 ml av glial medium pr pup for å resuspendere den kombinerte dissosierte gliaceller. For eksempel ble 10 hvis pups brukes, og da den totale resuspensjon volum ville være 20 ml.
- Fremstill en 75 cm2 cellekulturkolbe per pup. Legg 18 ml forvarmet glial medium i hver kolbe.
- Overføring 2 ml cellesuspensjon til hver kolbe og inkuberes i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Etter en dag, erstatt med 20 ml glial medium. På dette stadiet, er kulturen en blanding av glial og andre uønskede celletyper.
- Fire dager etter utsåing av cellene, kraftig rist flaskene for å fjerne ikke-astrocyttkulturer celler. For å gjøre dette, skyll flaskene gang med CMF-HBSS, og deretter tilsett 10 ml frisk CMF-HBSS til hver kolbe. Rist flaskene kraftig 5-10 ganger, og deretter aspirer av CMF-HBSS. Skyll to ganger med CMF-HBSS, og deretter legge til 20 ml glial medium.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å sikre fjerning av ikke-target celletyper, og bør ikke føre til tap av de ønskede astrocytter. - Erstatte med frisk glial medium to ganger i uken inntil cellene er konfluente (figur 1).
- frysing gliaceller
- Når kulturene blir konfluente, aspireres av mediet og vask cellemonolaget med 10 ml CMF-HBSS.
- Tilsett 10 ml av 0,25% trypsin / EDTA til hver kolbe og inkubert ved 37 ° C i 3 minutter.
- Trykk kolber forsiktig for å løsne cellene. Tilsett 1 ml BGS to hver kolbe og overføre cellesuspensjonen inn i 15 ml rør.
- Sentrifugere rørene ved 130 x g i 6 minutter. Kast den resulterende supernatant.
- Cellepelleten suspenderes i 2 ml glial medium.
- Klargjør glial frysemediet (1-del dimetylsulfoksid og 4-deler BGS). Tilsett 0,5 ml av denne løsning til hver av 4 kryogene ampuller pr kolbe.
- Overfør 0,5 ml cellesuspensjon til hver kolbe, og deretter fryse cellene langsomt ved å plassere ampullene i en isolert beholder i en -80 ° C fryser over natten. Etter en dag, overføres ampullene til en flytende nitrogenfryser for langtidslagring.
- Plating gjenopplivet gliaceller
- Plate gliaceller 1-2 uker før neuron kultur dagen.
- Fremstill en 50 ml rør med 10 mL varmet glial medium.
- Tine en frossen ampulle av gliaceller i et 37 ° C vannbad i 2-3 min.
- Overfør innholdet i hetteglasset inn i 50 ml rør inneholdende 10 ml medium glial.
- sentrifugee røret i 5 min ved 130 x g og aspireres av supernatanten.
- Resuspender pelleten i 20 ml glial medium.
- Tilsett 3 ml frisk glial medium til hver av de kulturskåler (60 mm), og deretter overføre 1 ml av cellesuspensjonen til hver skål. Inkuber kulturene i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Mate cellene to ganger i uken. Når celletettheten har nådd 50% konfluens i god tid før neurondyrking dag, skifte til glial medium inneholdende 5% BGS å bremse glial vekstrate. Den ønskede løpet av glial monolagskultur for neuron er 50% - 70%.
- Sett på glial medium med NBG medium (6 ml / skål) 1-2 dager før den neuron kulturen.
3. Fremstilling Coverslip
- Rengjøring og forberedelse av parafin Beads
- Senk Dekk i konsentrert salpetersyre (70% vekt / vekt; FORSIKTIG: sterkt etsende) og sonicate dem i 30 minutter ved romtemperatur. Andre laboratorier har found det fordelaktig å inkubere glassene i 70% salpetersyre i keramiske stativer i 12-24 timer ved romtemperatur i stedet.
- forkaste nøye salpetersyre i et utpekt avtrekksskap i henhold til institusjonens retningslinjer. Skyll glassene 3-5 ganger med avionisert vann.
- Senk glassene i avionisert vann, og sonicate dem på nytt i 30 minutter (hopp hvis etter den alternative metode).
- Fjern det avioniserte vann og skylles glassene ytterligere tre ganger.
- Senk glassene i 50 ml avionisert vann, og steriliseres ved autoklavering ved. Alternativt kan sterilisere glassene ved 225 ° C i en ovn i 6 timer. Hvis du bruker dette alternativ tilnærming, hopp til trinn 3.1.9.
- Når autoklavert, overføre Dekk til en steril laminær strømningshette for de følgende trinn.
- Fjern det avioniserte vann og skylles med 20 til 30 ml av 100% etanol.
- Legg 20-30 ml av 100% etanol og overføre glassene ogetanol, til en 100 mm petriskål.
- Bruk butte pinsett til å overføre dekkglass til 60 mm Petri skåler, 4-5 Dekk per skål, og deretter la dem lufttørke ved skjev glassene mot kanten av skålen. Når etanolen har fordampet, lå Dekk flatt på overflaten.
- Overfør 10 g parafin til et passende varmebestandig glassflaske. Smelt parafin og opprettholde den ved omtrent 150-200 ° C på en varm plate i minst 1 time. Den ideelle temperaturen som parafinen skal varmes opp kan ta litt tweaking. Ikke-ideelle temperaturer kan føre til problemer med å produsere den riktige størrelsen på parafin perler. Ventetiden etter smelting bidrar til å sikre jevn temperatur gjennom væsken.
- Dypp en Pasteur-pipette inn i parafin, og deretter raskt å berøre det til tre flekker nær kanten av hver dekkglass (hver flekk er tilnærmet 120 ° fra hverandre). Dråpene vil størkne i form av kuler omtrent 0,3 til 0,5 mm høye og 1,0-2,0 mm i diameter, og vil virke til å tilveiebringe et rom mellom neuronene på dekkglass og glial monolag nedenfor (figur 2).
- Steril tallerkener under UV-lys i 30 minutter, og deretter dekke dem med aluminiumsfolie og oppbevares ved romtemperatur. Preparerte Dekk kan lagres og brukes i opptil én måned. Parafin perler bør få lov til å følge de Dekk i minst en uke før bruk. Dette vil forhindre at parafin løsner i løpet av de gjenværende trinnene i protokollen.
- Belegg Dekk med Poly-L-lysin
- Skaff petriskåler som inneholder tidligere utarbeidet Dekk med parafin perler.
- Tilsett 200 ul av poly-L-lysin i boratbuffer til overflaten av hver dekkglass og la løsningen sitte på objektglassene over natt, dekket, ved romtemperatur. Coat den samme flate som den på hvilken parafin kulene er plassert. Merk at hvis skikkelig rengjort, bør poly-L-lysin spres lettfor å dekke overflaten av dekkglasset.
- Etter en dag, vaske objektglassene to ganger ved å dyppe dem i sterilt, deionisert vann i 2 timer hver gang. Etter den siste vaskingen, erstatte vannet med 4 ml av neuronal pletteringsmedium per skål. Legg merke til at det er viktig at overflaten av objektglassene ikke få lov til å tørke etter å ha blitt belagt med poly-L-lysin.
- Plasser dekkholdige retter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. De belagte dekkglass bør inkuberes i minst 24 timer før neuron kulturen. Dette gjøres for å klargjøre medium for neuron kultur.
4. Disseksjon av Hippocampus og Plating Neurons
- Oppnå en gravid rotte (embryonisk dag 18 til 19, målt fra dagen for vaginal plugg oppdagelse) og avlive av isofluran-bedøvet halshugging eller annet godkjent metode.
- Spray undersiden av rotte med 70% etanol, og deretter lage et innsnitt fra skam-region throHuff til enden av bukhulen. For å unngå forurensning, ta vare å kutte bare gjennom huden på dette trinnet.
- Skyll disseksjon instrumentene igjen med 70% etanol, og deretter skjære gjennom bukveggen for å eksponere livmoren. Fjern de to livmor horn og legg dem i en steril 100 mm petriskål.
- Utfør resten av trinnene i en laminær hette. Fjern livmor membran som omgir fostre. Decapitate dem og plassere hodene i en 100 mm Petri skål inneholdende 20 ml CMF-HBSS.
- Skjær ut hjernen og straks legges i en 60 mm Petri skål inneholdende 2 ml CMF-HBSS på is. Samle bare 2-3 hjerner per tallerken å gi tilstrekkelig plass for neste trinn.
- Under et disseksjonsmikroskop strippe bort hjernehinnene fra midtlinjen av de cerebrale hemisfærer, og deretter dissekere ut hippocampi og plassere dem i en 60 mm Petri skål inneholdende 4,5 ml CMF-HBSS. Merk at hippocampus kan erklæres som en halvmåneformet strukture i den mediale overflate av det kortikale halvkule, og er lett å fjerne slik det er avgrenset sideveis av en ventrikkel.
- Overfør den oppsamlede hippocampalt vev og CMF-HBSS til et 15 ml rør. Tilsett 0,5 ml av 2,5% trypsin, og deretter inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Papain kan brukes i stedet for trypsin, fordi det er mildere og kan øke utbyttet.
- Fjern forsiktig trypsinoppløsning ved Pasteur pipette, slik at hippocampalt vev uforstyrret i bunnen av røret.
- Forsiktig vaske vevet to ganger med 5 ml CMF-HBSS mens inkubere det ved 37 ° C i 5 min. Etter den annen vask, bringe det totale volum til minst 5 ml ved tilsetning av et tilstrekkelig volum av CMF-HBSS til vevet. Hvis det er Hippocampi fra mer enn 10 unger, opp til 8 ml CMF-HBSS kan tilsettes.
- Forbered to varianter av brann-polert pipetter for vev dissosiasjon. Spissen av en variant er av den normale diameter av pipetten men med flammepolert mykgjorte kanter. Den andre varimaur er ett med toppdiameter redusert med halvparten. I korthet utsette spissen av et glass Pasteur pipette diagonalt til en flammekilden, og deretter undersøke tuppene av pipetter.
- Gjenta dette trinnet til spissen som hadde blitt glattet eller diameteren er redusert. Det er viktig å øve for å finne den ideelle diameter for å sikre at vevet er dissosieres under dannelse av enkeltceller uten å skade disse cellene.
- Triturer det hippocampale vev først ved omtrent 10 ganger gjennom en glattkantet vanlig glass Pasteur-pipette, og deretter en ytterligere 5 til 10 passeringer gjennom pipetten med redusert diameter. Målet er å oppnå en homogen løsning av celler med svært få eller ingen klumper vev.
- Bestemme celletetthet ved anvendelse av et hemocytometer eller en automatisk celleteller. Vanligvis er 0,8 til 1,0 million celler per pup oppnås når Hippocampi fra de to halvkuler er kombinert.
- Overfør et tilstrekkelig volum av cellesuspensjonen til retterinneholdende poly-L-lysin-belagte dekkglass i 4 ml pletteringsmedium for å oppnå en plette tetthet på 300.000 celler pr 60 mm skål. Tettheten av cellene kan variere fra 100 000 til 500 000, avhengig av den tiltenkte eksperimentet.
- Etter 3-4 timer, overføre Dekkglass med nevronene er knyttet til skåler inneholdende glialceller i NBG medium. Dette bør gjøres slik at den side på hvilken neuroner ble sådd vender ned mot glial cellelaget. Legg totalt 4-5 dekk per gliaceller parabolen.
- To eller tre dager etter plettering, tilsett Ara-C-løsning til en sluttkonsentrasjon på 5 pM pr skål for å arrestere glial vekst.
- Mate cellene en gang i uken ved å erstatte 2 ml av det gamle medium med 2,5 ml friskt medium ved hver foring. Den ekstra medium som tilsettes er for å kompensere for fordampning over tid, og bare en del av mediet endres for å sikre konsistent kondisjonering av mediet ved gliacellene. Disse kulturene er vanligvis sunt for minst en måned (Figur 3). Neuronoverleving kan forbedres ved tilsetning av APV til kulturmediet til en endelig konsentrasjon på 100 uM. APV er en NMDA-reseptorantagonist og fremmer overlevelse ved å redusere glutamat eksitotoksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne "sandwich" Fremgangsmåte for primær nervecellekultur, hippocampus-neuroner (figur 3) vokser på en seng av gliaceller (figur 1) er adskilt av parafin kuler (figur 2). Dette sikrer at nerveceller selektivt vokse på dekkglass med minimal gliacelle forurensning, men får tilstrekkelig trofisk støtte fra gliaceller som vokser på vevskulturskål. Typisk kan neuroner bli opprettholdt i kultur i> 3 uker og utvikle omfattende arborisation med velutviklede aksoner og dendritter som er identifisert ved deres typiske dephospho-Tau og MAP2 immunofarging, henholdsvis (figur 4). Modne neuroner utvikle synaptiske pigger som er identifisert ved selektiv lokalisering av postsynaptiske markør Drebrin1 til disse avdelinger. Disse synaptiske piggene nær anbragte til presynaptiske fordypninger, som er identifisert av synaptiske vesikler markør Synapsin1 immunofarging. Denærhet av pre- og postsynaptiske områder indikerer velutviklet og riktig justert synapser. Disse primære neuroner er godt egnet for funksjonelle og strukturelle studier av nerveceller og synapser. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, studier av signaltransduksjon, neuronal polaritet, subcellulære handel og synapse utvikling og plastisitet.
Figur 1. Fase kontrast av gliaceller kulturer tatt en dag, 7 dager, eller 14 dager etter plating fra fryst glial lager. Skalastolpe, 500 pm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Høyoppløselige bilder av dekk FORBEREDELSERed med parafin perler. (A, B) Eksempler på riktig brukt parafin perler. (C, D) Eksempler på ukorrekt måte parafin perler. α: Mer enn en kule ble påført på samme sted. β: Perlen ikke klarte å være riktig plassert på dekkglass. χ: Perlen ble brukt for nær midten av dekkglass. δ: Vulsten var for høy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fase kontrast av utviklingsstadier av primære nevroner i kultur. Skalastolpe, 100 um. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
Figur 4. immunfluorescens bilder av primære neuroner i 17 dager in vitro. Neuronene ble fiksert med 4% formaldehyd og 4% sukrose i PBS i 12 min, og deretter permeabilisert med 0,25% Triton X-100 i 5 minutter. Etter blokkering med 10% BSA i PBS i 30 minutter, ble neuronene inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer anvendt i 3% BSA i PBS. Primære antistoffer ble anvendt som følger: anti-synapsin I (kanin, 1: 2000), anti-drebrin (mus lgG1, 1: 8, klone M2F6, hybridomsupernatant), anti-MAP2 (kylling polyklonalt IgY, 1: 5000), og anti-Tau-1 (mus IgG2a, 1: 2000, klon PC1C6; gjenkjenner defosforylert tau). Cellene ble deretter vasket med PBS og inkubert med egnede arter eller isotypespesifikke sekundære antistoffer i 3% BSA i PBS i 1 time ved 37 ° C. Sekundære antistoffer som ble anvendt var som follavtrykk: Alexa 488-konjugert anti-muse-IgG2a (1: 500), Alexa 568-konjugert anti-kanin (1: 500), Alexa 647-konjugert anti-mus lgG1 (1: 500), og AMCA-konjugert anti-kylling IgY (esel IgG, 1: 200). Skalastolpe, 10 um og 2,5 pm, som indikert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens "sandwich" metode for dyrking nevroner har vært godt beskrevet andre steder 2, 11, er det flere trinn i hele protokollen som er ganske vanskelig å beskrive med tekst alene, som kan føre til frustrasjon for forskere som ønsker å adoptere den.
Fremgangsmåten kan deles inn i tre hovedarbeidsprosesser: glial kultur, dekkglass og forberedelse neurondyrking og vedlikehold. Hver av de tre preparatene er avgjørende for høy kvalitet neuronkulturer og flere viktige hensyn må tas i betraktning. Før utplating neuroner, bør det gliale matelag ideelt sett være en homogen populasjon av astrocytter og være mellom 50-70% konfluens. Dette vil sikre tilstrekkelig trofisk støtte fra glial matelag. Det er viktig å sikre at astrogliale kulturen har minimal forurensning av andre celletyper, særlig mikroglia, som er løst angHed og avrundede celler. Mikroglia frigjørings cytokiner, som er skadelig for helsen og neuron overlevelse 12. Serumet, enten hest serum eller storfe vekst serum, kan være variabel fra parti til parti. Nøye screening av flere mange serum bør utføres før de bestemmer seg for å bruke et bestemt parti.
Dekkglass preparatet er et viktig skritt. Kvaliteten av glasset og den protokoll som brukes i rense er kritiske for friske velutviklede neuroner. Hvis metoden blir nylig vedtatt i en lab, ville det være verdt å teste dekkglass fra flere leverandører. For rengjøring av dekkglass, noen laboratorier suge dekkglassene i 70% salpetersyre i 18 til 36 timer mens andre ikke gjør det for kun 1 time i en sonikator. Et viktig kriterium for rene dekkglass er at den poly-L-lysin løsning bør spres jevnt på overflaten. Et annet viktig hensyn er at parafinvoksperler tilføres glassene bør være av passende høyde ogdiameter og være oppvarmet til den rette temperatur, som beskrevet i protokollen.
For oppnåelse av neuroner, kan hippocampi bli dissekert fra embryoniske dag 17-19 rotter. Selv om disseksjon på dette trinn fører til svært få gliaceller, kan gliaproliferasjon bli arrestert ved tilsetning av anti-mitotisk middel Ara-C etter 2-3 dagers kultur. Gniing av tryptinisert hippocampus vev ved brann polert pipettespisser er kritisk til distansere vevet inn i enkeltceller uten å skade cellene selv. Den neuronal vekst og vedlikehold medium anvendt i denne protokollen er Neurobasal + L-glutamin + B27 supplement. L-Glutamin kan være substituert med Glutamax, som er mer stabil i kulturmediet. Kvaliteten på B27 supplement kan variere fra parti til parti, og så det bør testes før du bruker en bestemt mye for lengre sikt kultur. En dårlig mye av B27 kan føre til nerveceller til å klumpe seg. Alternative produkter som GS21 og SM1 har vist seg å være gode erstatninger for B27.Nerveceller dyrket i mer enn en uke skal fôres med friskt medium hver uke, hvor en tredjedel av mediet blir erstattet hver uke.
Denne fremgangsmåte for dyrking av nervecellene kan vise seg å være uvurderlig til eksperimenter som er avhengige av rene nevronale populasjoner med liten eller ingen forurensning glial. Lav tetthet nevroner dyrket ved hjelp av denne metoden vanligvis overleve i flere uker med velutviklede lysthus, synaptiske forbindelser og nettverksegenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CIHR MOP-142209 til TJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
