Summary
본 프로토콜은 사이토 카인과 같은 인자 -1 (CLF-1 사이의 상호 작용에 의해 전달된다 섬모 향 신경성 인자 수용체 α (CNTFRα)의 하향 조절을 입증 할 수있는 방법을 웨스턴 블랏 및 리소좀 효소의 억제와 함께 면역 세포 설명 )와 세포 내 이입 수용체 sorLA.
Abstract
이종 사이토킨 Cardiotrophin 같은 사이토 카인 : 사이토 카인과 같은 인자 1 (CLC는 : CLF-1)합니다 (glycosylphosphatidylinositol (GPI)에이어서 130 / 백혈병 억제 인자 수용체 β 당단백 모집 삼량 체 복합체를 형성 CNTFRα을 -anchored 대상 gp130을 / 신호에 대한 LIFRβ). CLC 및 CNTFRα 모두 신호하지만 지금까지 CLF-1 만 CLC 분비의 추정 촉진제로 알려져있다위한 필요하다. 그러나, 최근 CLF-1 세 개의 결합 부위 포함 나타났다 : CLC 하나씩; CNTFRα 하나 (즉, 삼량 체 복합체의 어셈블리를 촉진 할 수있다); 및 세포 내 이입 수용체 sorLA 하나. CLF-1뿐 아니라, 삼량 체 (CLC : CLF-1 : CNTFRα) 후자 사이트 CLF-1 CLC의 결합 친 화성이 높은 제공 sorLA에 복잡하고 세포를 가용성 리간드 CLF-1 및 CLC를 sorLA 발현 : CLF-1은 빠르게 흡수하고 내장되어 있습니다. CNTFRα 및 sorLA 공동 발현하는 세포에서 CNTFRα 먼저 CLC 바인딩 : CLF-1은 형성한다멤브레인 - 관련 삼량 착체뿐만 아니라 CLF-1에서의 자유로운 sorLA 결합 부위 sorLA 통해 연결된다. 결과적으로, 자체적으로 엔도 시토 시스에 대한 능력이없는 CNTFRα는 함께 당 겼고되고 CLC의 sorLA - 매개 엔도 사이토 시스에 의해 내재화 : CLF-1.
본 프로토콜)는 sorLA 매개과 CLC 전을 설명하는 데 사용되는 실험 절차에 대해 설명 : 표면 막 CNTFRα 표현의 CLF-1에 의존 하향 조절을; ⅱ) 세포 내 이입과 CNTFRα의 대상으로 리소좀 sorLA이 매개; 및 ⅲ) CLC로 하향 조정 세포 반응 : CNTFRα의 sorLA 매개 하향 조절시 CLF-1-자극.
Introduction
CLF-1 : 1-3 콜레 스테 릭 액정 및 CLF-1 이종 사이토킨 CLC의 두 서브 유닛을 구성한다. 셀룰러 신호 유도, CLC : CLF-1 제 대상은 CNTFRα 그 차 및 GPI-고정 리셉터는 멤브레인 결합 된 삼량 체 복합체를 형성한다. 콜레 스테 릭 액정 : CLF-1 : CNTFRα 단지 이후 모집 횡단은 야누스 키나제 / 신호 변환기 및 전사 3 (JAK / STAT3) 경로 4 활성제를 통해 신호를 중재 gp130을 / LIFRβ. 세 개의 서브 유닛 중 어느 결핍 마우스는 하나의 디스플레이와 같은 표현형 인한 안면 신경 불충분 유아 5-8의 감소 된 수의 출생 후 24 시간 이내에 사망한다. 인간의 연구 결과는 마찬가지로 세 개의 서브 유닛의 기능 일관성을 강조한다. 따라서, 인간의 돌연변이 (동형 접합체 또는 화합물) CLC의 원인이 장애 : CLF-1 또는 CNTFRα, 소위 감기에 의한 발한 / Crisponi 증후군의 모든 결과, 같은 impai 등의 증상을 특징으로하는 조건빨간색 유아 및 삼키는, 다양한 기형 기능, 온도 스파이크, 그리고 역설적 및 저온 9-11에서 땀 관류.
시험 관내에서, CLC 및 CNTFRα의 조합 및 gp130을 필요 / LIFRβ과의 상호 작용 및 셀 (12) 시그널링을 유도하기에 충분한 양이다. 반면에, CLF-1의 역할은 덜 명확하다. 직접적 시그널링에 관련되지 않고, 긴 주로 CLC 1의 세포 분비를 촉진하는 역할을 부록으로 간주되어왔다. 그러나, 최근의 연구 결과는 CLF-1 시그널링 및 CLC와 CNTFRα 회전율 모두 연루 추가 등 중요한 기능을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, CLF-1은 3 개의 독립적 인 결합 부위가 포함되어 있다고 표시 : 하나씩의 CLC 결합 공지; CNTFRα에 바인딩 직접 중재 한; 및 세포 내 이입 수용체 sorLA과의 상호 작용에 대한 세 번째 (높은 친 화성) 사이트. CLC 및 CLF-1 둘 것 & #로(160), 상기 CLC보다 상당히 낮은 친화력과 CNTFRα를 대상으로 : CLF-1 복잡한, (그 CNTFRα 결합 사이트를 통해) CLF-1 CLC와 CNTFRα의 통일을 촉진하여 13 신호를 용이하게 생각할 수있다.
sorLA CLF-1과의 상호 작용이 본 발표의 주요 문제는 완전히 다른 역할을한다. SorLA는 Vps10p 도메인 수용체 가족 (14)를 구성하는 다섯 가지 유형 (1) 수용체의 하나입니다. 이것은 다양한 조직이 아니라 뇌 신경 조직 (15) 내의 특정 표현된다. 다른 가족 구성원과 마찬가지로 sorLA는 Vps10p - 결합 도메인 N- 말단 리간드를 수행하지만, 또한,도 저밀도 지단백질 수용체 패밀리 (15)의 부재에 위치한 리간드 - 결합 요소를 포함하는 다른 도메인 유형을 포함한다. 그것의 세포질 꼬리 여러 어댑터 단백질, 예를 들어, 어댑터 단백질-1, -2, 그리고 sorLA와 상호 작용이 효율적으로 endocytos를 전달입니다뿐만 아니라 결합 단백질 16 ~ 18의 세포 내 정렬 및 전송. Vps10p 도메인은 CLF-1 (단, 특히, CLC 생략) (13)를 포함하여 리간드 무관하는 일련의 바인딩 큰 텐 β 블레이드 프로펠러 (19, 20)를 포함한다. CLF-1의 결합 부위가 액세스 후에도 sorLA뿐만 아니라 결합을 의미 CLC 및 CNTFRα 복잡한 형성 무료 CLF-1뿐만 아니라, CLC : CLF-1과 삼량 체 복잡한 CLC : CLF-1 : CNTFRα 13. SorLA은 CLF-1 및 CLC의 신속한 세포 내 이입 전달 : CLF-1이지만 CNTFRα는 GPI 앵커에 의해 막 표면에 고정되는 반면, 이러한 수용성 단백질이다. / 및 CLF-1 : : : CNTFRα이 sorLA 전체 단지를 내면화 할 수 있도록함으로써 CNTFRα의 표면 막 식 (CLF-1 신호 유도 및 CLC에 후속 세포 감수성)을 변경하는 문제는 CLC의 따라서 경우에 구속력을 또는 CNTFRα의 회전율.
본 실험에 기재된보고서는 다음과 같은 질문을 명확히하기 위해 설계되었습니다 :
sorLA은 CLC를 매개 하는가 : 표면 막 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절? 이를 명확히하기 위해, 초기에 21에서 설명한 바와 같이 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 (부재와 sorLA의 존재하에) CNTFRα의 회전율을 결정하려고 시도 하였다. 그러나 CNTFRα는 [S (35)] 시스테인의 혼합물을 사용하여 [S (35)] 메티오닌은 방사능의 가난한 통합을 보였다 레이블을 시도합니다. 이것은 모든 확률 수용체의 급격한 상당한 손실을 보상 할 수 없을 것이다 새로운 합성은 매우 낮은 수준을 제안했다. CLC를 통해 상호 때 CNTFRα이 하향 조절되었는지 확인하려면 : CLF-1 sorLA, 그것은 따라서 단순히 이전과 CLC에 노출 된 후 (웨스턴 블로 팅 사용) CNTFRα의 총 세포 풀을 측정하기로 결정했다 : CLF-1 -과 결과를 비교 세포를 형질 전환 또는 형질하지에sorLA.
sorLA은 리소좀에 CNTFRα을 대상으로합니까? 이 질문에, CNTFRα의 현지화에 대답하기 위해 - 그 CLC를 통해 내면화 : sorLA 결합 CLF-1 매개 - 면역 세포를 이용하여 조사하고, CNTFRα 향하는 항체 및 후기 엔도 좀 / 리소좀 마커 리소좀 관련 막 단백질 1 표시 (LAMP-1). 실험은 리소좀 효소의 억제제로 치료뿐만 아니라 처리 된 세포에서 수행 하였다. 아이디어는 CNTFRα이 리소좀에서 분해 된 경우 처리되지 않은 세포가 CNTFRα에 대해 거의 또는 전혀 염색을 보여줄 것입니다 반면, 효소 억제제로 치료 세포, LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 CNTFRα-염색을 제시 것을 물론이다.
CLF-1 자극 : CNTFRα의 하향 조절은 CLC에 대한 세포 반응을 낮출 수 있나요? JAK / STAT3을 사용하여 gp130을 / LIFRβ 이질 통해 CLC, CLF-1을 CNTFRα 신호 이루어지는 삼량 체 복합체좁은 길. 따라서, 전지의 용량은 CLC에 응답하기 : CNTFRα의 하향 조절시 CLF-1 신호는 웨스턴 블롯 검출 및 sorLA의 형질 전환 체의 인산화 STAT3 (pSTAT3) / 총 STAT3 수준의 정량에 의해 탐험했다.
Protocol
CNTFRα 해물 1. 웨스턴 블로 팅
- 전체 길이 sorLA 및 Myc와-태그 CNTFRα 인간 배아 신장에 구축 표현 된 pcDNA3.1 / ZEO 사용하여 293 (HEK293) 세포 (-) 및 한 pcDNA3.1 / HYG을 (-), 각각. 작 제물은 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 형질 감염 시약을 이용하여 HEK293 세포를 형질 감염. 150 μg의 / mL로 오신 및 / 또는 500 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B 골드 (13)를 포함하는 배지에서 안정적인 클론을 선택합니다.
- HEK293의 씨앗 동일한 번호는 표현 중 하나 CNTFRα-Myc와 또는 형질의 공동 발현 Eagle's 중간 (DMEM) 수정 된 둘 베코의 세포가 10 %의 태아 보충 그림 1. 문화에서와 같이 두 개의 4 웰 플레이트에 CNTFRα-Myc와 / sorLA을 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 37 ℃에서 5 % 이산화탄소 배양기에서 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (완전 배지).
- 80 % 합류 - 세포가 50 때까지 기다립니다.
- 로부터 매체를 제거우물, 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)로 한번 세척하고, 또는 (제어) 10 나노 CLC없이 신선한 전체 매체를 추가 : CLF-1도 1에 나타낸 바와 같이. 37 ℃에서 세포를 품어.
- 배양의 0 ~ 5 시간 후, 매체를 복구하고 1.5 mL의 튜브를 4 ℃에서 보관합니다. 이어서 각 웰에 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (1 분, 4 ℃)으로 보충 된 1 % 트리톤 X-100 용해 완충액 (20 mM의 트리스 -HCl, 10 mM의 EDTA, pH를 8.0)을 추가한다. 그 후, 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)에 세포 용 해물을 전송합니다.
- 배지 및 세포 용해질 (3000 XG, 3 분, 4 ℃)를 포함하는 튜브를 회전 및 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)하여 상청액을 전송. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각 파쇄 상등액 5 μL 이전 - 이후 단백질 함량을 측정하기 위해 그들을 사용 (170 단계). 즉시 모든 상청액을 비 환원 LDS 샘플 완충액을 추가 샘플을 소용돌이.
- PROT를 측정하는 5 μL 분취 액을 사용하여제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석법을 사용하여 세포 용 해물의 상청액 EIN 콘텐츠.
- 5 분 동안 95 ℃에서 시료를 가열한다.
- (5 13 블 롯팅 SDS-PAGE (13)을 감소시키고 웨스턴 각 시료에서 단백질의 동량을 대상 방지 sorLA 16의 토끼를 사용하여 배지에 상기 세포 용 해물에 sorLA, β 액틴 및 CNTFRα-Myc와의 내용을 시각화 μg의 / ㎖), 마우스 항 β 액틴 (0.4 μg의 / ㎖) 및 항 - 마우스 나 Myc (1 μg의 / ㎖) 항체 및 적절한 HRP 결합 된 이차 항체 (1 : 2000).
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 농도계에 의해 밴드를 정량화.
리소좀 억제제와 병용 2. 면역 세포 화학
- 그림 2와 같이 종자 HEK293 세포를 안정적으로 4 웰 플레이트에서 커버 슬라이드에 CNTFRα-Myc와 / sorLA로 형질. 문화 상기 완전 배지에서 세포.
- 40 % - 셀 합류 20 때까지 기다립니다.
- 우물에서 매체를 제거하고 그림 2에 나타낸 바와 같이, 또는 류 펩틴의 50 μg의 / mL를하지 않고 세포에 펩 스타틴 A (레우 / PEP) (억제 리소좀 가수 분해 효소)의 전체 매체를 추가합니다. 37 ℃에서 세포를 품어. 매체는 배양 다음 24 시간 동안 매 6 시간을 교체해야합니다.
- 24 시간 배양 한 후, 다시 한 번 (레우 / 격려와 함께 또는없이) 매체를 교체하고이 시간은 10 나노 CLC 추가 : CLF-1. 5 시간 동안 37 ℃에서 세포를 품어.
- PBS에 한 번 세포를 세척하고 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7을 수정합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 피부, 눈 및 점막에 닿지 않도록, 매우 독성이다. 장갑, 보호 안경 착용과 솔루션은 흄 후드 내에서해야한다. - PBS에 한 번 세포를 씻고 PBS에 희석 사포닌에서 RT에서 5 분 (0.5 % 사포닌)의 세포를 Permeabilize 하시려면.
- 염소 항 CNTFRα 희석 (1 μg의 / ㎖) (특히아니라 마우스 항 Myc와 0.5 % 사포닌의 웨스턴 블롯), 마우스 안티 LAMP-1 (15 μg의 / ㎖) 항체를 사용하고 RT에서 2 시간 동안 항체와 세포를 배양한다.
- 0.5 % 사포닌의 셀 4 배 (5 분) 세척 및 당나귀 방지 염소 알렉사 488-와 당나귀 항 - 마우스 알렉사 568 - 복합 이차 항체 (6 μg의 / mL)을 실온에서 2 시간 동안 함께 세포를 배양.
- 두 번 탈 이온수 (1 분)에, 0.5 % 사포닌의 셀 4 배 (5 분) 세척 및 설치 미디어를 사용하여 슬라이드 현미경 커버 슬라이드를 탑재합니다.
- 63X C-고차 색지움 물 침지 목표, NA 1.2 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 공 초점 현미경으로 세포의 항체 염색을 분석합니다.
pSTAT3 수준 3. 서양 얼룩 검출
- 도 3에 도시 된 바와 같이, 4- 웰 플레이트 (CNTFRα의 내인성 수준을 발현) 시드 - HEK293 세포 sorLA. 문화 상기 완전 배지에서 세포.
- 때까지 기다립니다80 % 합류 - 셀 (50)이다.
- , 우물에서 매체를 제거 PBS에 한 번 세척하고, 나노 CLC 또는 10 않고 신선한 전체 매체를 추가 : CLF-1 세포에 그림 3에 나타낸 바와 같이. 5 시간 동안 37 ℃에서 세포를 품어.
- , 매체를 제거 비추 DMEM에서 두 번 세포를 씻어 (빈 매체, FBS와 항생제없이), 다음 빈 배지에서 90 분 (37 ℃)에 대한 세포를 reincubate.
- 그림 3에 나타낸 바와 같이 (STAT3 인산화를 시작합니다) CLF-1 : 다시 한번, 매체를 제거하고 또는 5 나노 CLC없이 비어있는 새 매체를 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 품어.
- 빠르게 (1 분, 4 ℃)는 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제가 보충 1 % 트리톤 X-100 용해 완충액 (20 mM의 트리스 -HCl, 10 mM의 EDTA, pH를 8.0)을 첨가하여 세포를 배지를 제거하고 용균 각 웰에 칵테일입니다. 그 후, 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)에 세포 용 해물을 전송합니다.
- 이전 5 μL 오F 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각 상등액 - (380 단계) 이후, 단백질 함량을 측정하도록 사용한다. 즉시 모든 상청액을 비 환원 LDS 샘플 완충액을 추가 샘플을 소용돌이.
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석을 이용하여 5 μL 분취 액의 단백질 함량을 측정한다.
- 더 이상 점착성 (약 1 분) 다음에있는 5 분 동안 95 ℃에서 가열을 RT까지 각 샘플을 초음파 처리 없음.
- SDS-PAGE (13) 및 웨스턴 13 블 각 샘플로부터 단백질의 동량을 대상 토끼에게 항 pSTAT3 (1 : 2000)를 사용하여 세포 용 해물에서 pSTAT3의 내용 및 전체 STAT3 시각화 항 STAT3 및 마우스 (1 : 1000 ) 항체 및 해당 HRP-연결된 마우스와 토끼 보조 항체 (1 : 2000).
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 농도계에 의해 밴드를 정량화.
Representative Results
도 1은 셀 시드 및 CLC의 개략도 보여준다 프로토콜 2.도 3 CLF-1 배양 : 프로토콜 CLF-1 배양을 1도 2는 셀 시드 및 레우 / PEP와 CLC의 개략도를 도시 sorLA 매개 CLC 프로토콜 3. 그림 4 CLF-1 배양과 자극을 보여줍니다 : 셀 - 파종 및 CLC의 개략도를 보여줍니다 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절. 그림 5는 CNTFRα의 타겟팅 sorLA 매개 엔도 시토 시스와 리소좀을 보여줍니다. CNTFRα의 하향 조절 한 후 CLF-1 자극 : 그림 6은 CLC에 낮은 응답을 보여줍니다.
CNTFRα-Myc와의 하향 조절이 sorLA의 형질 전환에 약한 밴드 afte에 의해 입증되는 반면 CNTFRα-Myc와을 상징하는 밴드, 시간 제로에서 비슷한 밀도를 가지고 있습니다R 5 시간 (그림 4). 그림 5는 CNTFRα-Myc와는 레우 / 응원 처리 된 세포의 LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 된 것을 알 수있다. 반대로 CNTFRα-Myc와 어떠한 축적 레우 / PEP 처리를 실시하지 세포에서 보이지 않는다. 이 CNTFRα-Myc와는 리소좀에 정렬되고 분해되는 것을 보여줍니다. CLF-1 :도 6에서 알 수있는 바와 같이 CLC에 노출되지 않은 세포에서의 수준과 비교해서 pSTAT3 수준은 상당히 예비 자극 된 세포에서 감소된다. 이것은 예비 자극 된 세포에서 관찰 된 CNTFRα sorLA 매개 된 하향 조절 (도 4)에 따른다.
그림 1 : 두 4-에서 프로토콜 CLF-1 배양 1. 씨 HEK293-CNTFRα-Myc와 및 HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포 : 세포 파종 및 CLC의 도식 표현웰 플레이트 (0 ~ 5 시간) 및 CLC와 세포를 품어 : CLF-1 바와 같이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 세포 파종 및 레우 / 단합과의 도식 표현 CLC : CLF-1 4 웰 플레이트에서 커버 슬라이드 프로토콜 2. 종자 HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포의 배양 및 또는 레우없이 세포를 배양 / 격려와 CLC : CLF-1 바와 같이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 세포 파종 및 CLC의 도식 표현 : 한 4 웰 플레이트에서 프로토콜 3. 씨 HEK293-sorLA 세포에서 CLF 배양과 자극 또는 CLC없이 세포 배양 : (. 사전 특급) CLF-1을 하향 조절하기 나타낸 바와 같이, STAT3 인산화을 시작 CLF-1 자극 (STIM.) : CNTFRα는 CLC 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : SorLA가 중재 것을 보여주는 결과 CLC : CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절. (A) HEK293-CNTFRα-Myc와 및 (B) HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 셀 부재 (10)의 나노 CLC (흰색 칼럼) 또는 존재 (회색 칼럼)에서 배양 하였다 : CLF-1. 0 후와5 시간은, 배양이 중지되고 상기 매체 (m)의 CNTFRα-Myc와의 함량 및 세포 용 해물을 (l) 웨스턴 블 롯팅에 의해 검출하고, 밀도 측정에 의해 정량 하였다. 상단 패널은 대표적인 실험 웨스턴 블롯 결과를 표시하고, 하부 패널은 세포 용 해물에서 발견 CNTFRα-Myc와의 검출 레벨을 나타낸다. 레벨은 0 시간에서 단일 및 이중 형질의 CNTFRα-Myc와 수준을 기준으로 표시됩니다. 각 컬럼은 평균 ± SEM를 나타낸다 (n = 3)를 나타낸다. P-값은 t-test를 이용하여 계산 하였다. 원래 그림 13 후 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :SorLA는 엔도 시토 시스와 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 매개 것을 보여주는 결과. HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포는 10 나노 CLC 배양, 또는 레우 / PEP없이 처리 하였다 : 프로토콜에 기재된 CLF-1, 5 시간 반 CNTFRα 안티 LAMP-1 항체를 이용하여 고정하고, 마지막으로 염색 2. 스케일 바 : 5 μm의. 원래 그림 13 후 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : CLF-1 자극 : CNTFRα의 SorLA 매개 하향 조절이 CLC에 내려 세포 반응을 동반한다.
HEK293-sorLA 셀 부재 (10) 또는 나노 CLC의 존재하에 예비 인큐베이션 하였다 (. 프리 EXP)을 5 시간 동안 CLF-1의 결핍 blan케이 90 분 동안 매체, 5 nM의 CLC로 자극 : (. STIM) CLF-1 15 분. (왼쪽) 열은 세포에서 pSTAT3의 상대적 수준을 보여줍니다. CLF-1이지만 CLC 자극 : CLF-1의 각 열은 CLC의 부재에서 전 배양 세포에서 pSTAT3 레벨 (N = 3)의 상대 ± SEM을 의미 나타낸다. t-test를 이용하여 계산 된 p- 값. (오른쪽) 웨스턴 블롯은 대표적인 실험에서 얻어진 pSTAT3와 STAT3의 응답을 보여줍니다. 원래 그림 13 후 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 sorLA 매개 CLC을 설명하기 위해 특별히 사용되는 수 CLF-1 의존성 하향 조절 및 CNTFRα 타겟팅 리소좀뿐만 아니라 CLC에 수반 약화 응답 : CLF-1 자극.
그들은 CNTFRα 및 sorLA 단지 사소한 내인성 발현을 명시 gp130을 / LIFRβ, 형질 쉬우 며 면역 세포 적합 대형 전지 본체를 갖고, 상기 HEK293 세포주는이 프로토콜에 적합하다. 그러나 이론적으로 유사한 특성을 가진 셀 라인은 잘 작동합니다.
이 프로토콜은 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫번째 관심사는 레우 / PEP 매체는 24 시간 동안 약 6 시간마다 교체해야하는 230 단계. 그렇게하지 않으면 활성 리소좀 효소 이하 또는 리소좀 단백질의 탐지되지 축적의 원인이 될 수 있습니다. 두번째 중요한 단계 (3.4) CLC 사전 인큐베이션에 세척 우려 : CLF-1. 그것은 메신저입니다으로 중요 어떤 언 바운드 리간드를 제거하고 세포의 시간이 비추 DMEM (빈 매체)에 (계속 자극을 피할 수) 복구 할 수 있도록. CLF-1 (단계 3.5) :이 CLC와 후속 다시 자극하는 동안 pSTAT3의 낮은 배경 수준을 보장합니다.
특히,도 6은 세포 반응 (pSTAT3)이 CNTFRα의 sorLA 매개 된 하향 조절과 평행하게 감소한다는 것을 보여준다. 이는 감소 된 응답이 CNTFRα 풀의 감소 (그리고 따라 예상 할 수있는)에 따른이지만,이 저 CNTFRα 식 단독 감소 세포 반응을 차지하는 것을 증명하지 않는다는 점을 강조해야한다. 따라서, 변경 - 프리 자극 또는 형질의 결과 - 상류 pSTAT3에 신호 전달 경로의 기능 요소 중 어느 하나가 변경된 응답에 기여 할 수 있습니다.
프로토콜의 기본 개념이이 특별히 한정되지 않는다LAR 수용체 시스템. (. 즉, 다른 세포주, 기타 항체, 기타 리간드 등) - 무관 sorLA's 개입 프로토콜을 수정하여 그것뿐만 아니라 다른 수용체의 리간드 - 유도 하향 조절을 결정하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 웨스턴 블 롯팅에 의해 수용체 하향 조절의 분석은 주로 예 수용체 느린 회전율 및 자극되지 않은 세포에서의 새로운 합성의 낮은 정도를 나타내고, GPI 고정 - 수용체에 적합한 것을 주목해야한다. 따라서, 새로운 합성의 하이 레벨을 나타내는 수용체의 리간드 - 유도 수용체 하향 조절이 새로운 합성에 의해 보상 될 수있다. 21에 기술 된 바와 같이 이러한 상황에서 풀 수용체의 하향 조절 대신 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 결정될 수있다. 선택적으로, 수용체를 방해하지 요오드화 항체 (바람직 된 Fc 단편)의 "태그"를 RECEPT의 ectodomain하는데 사용될 수 바인딩또는, 상기 예상 하향 조절은 세포 펠릿과 배지 방사성 계수에 의해 결정될 수있다.
물류 이유로 우리는 CNTFRα 우리의 세포는 Myc와 태그를 들고 구성 형질, 본 프로토콜에서 마우스 항 - Myc와 항체 수용체의 웨스턴 블롯 검출에 사용되었다. 대조적으로, 염소 항 - CNTFRα 항체 LAMP-1 마우스 항체에 의해 검출되었을 때 면역 세포 및 이중 표지에 사용 된 - 분명 이차 항체 불특정 (중첩) 염색 초래 개의 기본 마우스 항체를 사용한다. 염소 항 - CNTFRα도 (도시 생략) 웨스턴 블 롯팅에서 작동하기 때문에, 프로토콜은 쉽게 수정 및 태그가없는 CNTFRα 형질 세포에 적용 할 수 있습니다.
고친 화도 22 CLF-1 : 마지막으로, 최근에는 세포 내 이입이 수용체 sortilin CLC 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 생각할 수있는 그 sortilin처럼이며sorLA는 CLC에 상호 : CLF-1을 통해 CNTFRα 및 세포 내 이입뿐만 아니라 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 중재 할 수 있습니다. 대신 sorLA의 sortilin을 사용하여, 본 프로토콜은이 문제를 명확히하기 위해 사용될 수있다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
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