Summary
يصف هذا البروتوكول كيف النشاف ومناعية جنبا إلى جنب مع تثبيط الإنزيمات الليزوزومية الغربية يمكن أن تستخدم للتدليل على downregulation من الهدبية التغذية العصبية عامل مستقبلات α (CNTFRα)، والتي يتم نقلها عن طريق التفاعل بين تشبه خلوى عامل-1 (CLF-1 ) ومستقبلات التقامي sorLA.
Abstract
خلوى heterodimeric Cardiotrophin مثل خلوى: خلوى مثل عامل-1 (CLC: CLF-1) يستهدف glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα لتشكيل مجمع مثلوثي أن في وقت لاحق المجندين بروتين سكري 130 / اللوكيميا المثبط عامل مستقبلات β (gp130 / LIFRβ) للإشارات. ضرورية للانزعاج ولكن حتى الآن CLF-1 فقط تم المعروفة باسم ميسر المفترض من إفراز مجالس الصحوة على حد سواء CLC وCNTFRα. ومع ذلك، تم مؤخرا تبين أن CLF-1 يحتوي على ثلاثة مواقع الربط: واحد للCLC. واحد لCNTFRα (التي قد تشجع جمعية المجمع مثلوثي)؛ واحد لمستقبلات التقامي sorLA. ويوفر الموقع الأخير قابلية عالية ملزما من CLF-1، CLC: CLF-1، فضلا عن مثلوثي (CLC: CLF-1: CNTFRα) مجمع لsorLA، وفي sorLA، معربا عن خلايا بروابط القابلة للذوبان CLF-1 و CLC : تؤخذ CLF-1 بسرعة كبيرة والمنضوية. في الخلايا التعاون، معربا عن CNTFRα وsorLA، CNTFRα أولا يربط CLC: CLF-1 لتشكيلمجمع مثلوثي غشاء المرتبطة، ولكنه يربط أيضا إلى sorLA عن طريق موقع مجاني ملزم sorLA في CLF-1. ونتيجة لذلك، CNTFRα، الذي ليس لديه القدرة على الإلتقام من تلقاء نفسها، ومجرور على طول وداخليا من قبل الإلتقام توسط sorLA من CLC: CLF-1.
يصف هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية المستخدمة لإثبات ط) بوساطة sorLA وCLC: downregulation CLF-1-تعتمد من غشاء سطح التعبير CNTFRα. ب) sorLA بوساطة الإلتقام والليزوزومية استهداف CNTFRα. وج) الاستجابة الخلوية خفضت إلى CLC: CLF-1-التحفيز على downregulation بوساطة sorLA من CNTFRα.
Introduction
وCLC وCLF-1 تشكل مفارز اثنين من CLC خلوى heterodimeric: CLF-1 1-3. لتحريض إشارة الخلوي، CLC: CLF-1 أول أهداف CNTFRα، مستقبلات الابتدائي وGPI الراسية لها، لتشكيل مجمع مثلوثي بغشاء. وCLC: CLF-1: CNTFRα مجمع المجندين في وقت لاحق gp130 / LIFRβ التي تتوسط الغشاء إشارات عبر يانوس كيناز / إشارة المحولات والمنشطات من النسخ 3 (JAK / STAT3) المسار 4. الفئران تعاني من نقص في أي من الوحدات الفرعية الثلاثة عرض واحد ونفس النمط الظاهري ويموت في غضون 24 ساعة بعد الولادة نتيجة لانخفاض عدد الخلايا العصبية في الوجه وعدم كفاية الرضاعة 5-8. النتائج لدى البشر كذلك تؤكد تماسك الوظيفي للمفارز الثلاثة. وهكذا، والطفرات البشرية (زيجوت متماثلة الألائل أو مركب) مما تسبب في خلل في CLC: CLF-1 أو CNTFRα، كل نتيجة في ما يسمى التعرق الباردة التي يسببها / متلازمة نقص Crisponi، وهي حالة تتميز أعراض مثل impaiالرضاعة الأحمر والبلع، العديد من الميزات تشوه، ارتفاع درجة الحرارة، والمفارقة ويروي التعرق في درجات حرارة منخفضة 9-11.
في المختبر، فإن الجمع بين المسؤولية المدنية وCNTFRα هو ضروري وكاف للتفاعل مع gp130 / LIFRβ وتحريض يشير في خلايا 12. دور CLF-1 من ناحية أخرى أقل وضوحا. لا تشارك بشكل مباشر في الإشارات، واعتبرت منذ فترة طويلة كملحق التي تخدم في المقام الأول إلى تسهيل إفراز الخلوي للCLC 1. ومع ذلك، تظهر النتائج الأخيرة التي CLF-1 وظائف إضافية وأكثر أهمية تورط كل من الإشارات ودوران CLC وCNTFRα. وهكذا، يبدو أن CLF-1 يحتوي على ثلاثة مواقع ملزمة مستقلة: واحد للهو معروف ملزم لCLC. واحد الذي يتوسط مباشرة ملزم لCNTFRα. والثالث (قابلية عالية) الموقع للتفاعل مع مستقبلات التقامي sorLA. على حد سواء CLC وCLF-1 يبدو & #160، لاستهداف CNTFRα مع تقارب كبير أقل من CLC: مجمع CLF-1، فمن المتصور أن CLF-1 (عن طريق الموقع ملزم CNTFRα به) يشجع على توحيد CLC وCNTFRα وبالتالي يسهل يشير 13.
التفاعل CLF-1 مع sorLA، القضية الأساسية لهذا العرض الحالي، يلعب دورا مختلفا تماما. SorLA هو واحد من خمسة نوع 1 المستقبلات التي تشكل عائلة مستقبلات Vps10p المجال 14. يتم التعبير عن ذلك في مجموعة متنوعة من الأنسجة ولكن بشكل خاص في المخ والأنسجة العصبية 15. على غرار غيرهم من أفراد الأسرة sorLA يحمل يجند-N محطة ملزمة Vps10p المجال، ولكن بالإضافة إلى ذلك، ويضم أيضا أنواع المجال أخرى بما في ذلك عناصر ملزم يجند وجدت في أعضاء البروتين الدهني منخفض الكثافة مستقبلات الأسرة 15. ذيله حشوية يتفاعل مع العديد من البروتينات محول، على سبيل المثال، محول البروتين 1 و -2، وsorLA ينقل endocytos فعالةهو كذلك الفرز داخل الخلايا ونقل البروتينات المربوطة 16-18. يضم Vps10p المجال كبيرة عشرة البيضاء β-المروحة 19،20، الذي يربط سلسلة من بروابط لا علاقة لها بما في ذلك CLF-1 (ولكن لا سيما، وليس CLC) 13. موقع ملزم في CLF-1 يمكن الوصول إليها حتى بعد تشكيل المعقد مع CLC وCNTFRα مما يعني أن sorLA يربط ليس فقط مجانا CLF-1، ولكن أيضا CLC: CLF-1 وCLC معقدة مثلوثي: CLF-1: CNTFRα 13. SorLA ينقل الإلتقام السريع لCLF-1 و CLC: CLF-1، ولكن هذه هي بروتينات قابلة للذوبان في حين أن الثابت CNTFRα إلى غشاء السطح من قبل مؤشر التكافؤ بين الجنسين مرساة. والسؤال هو ولذلك إذا كان ملزما من CLC: CLF-1: CNTFRα يسمح sorLA لاستيعاب المجمع بأكمله وبالتالي يغير من التعبير عن غشاء سطح CNTFRα (وقابلية الخلوية لاحقة لCLC: CLF-1 إشارة تحريض)، و / أو دوران CNTFRα.
وصف التجارب في الوقت الحاضرتم تصميم التقرير لتوضيح الأسئلة التالية:
لا توسط sorLA CLC: downregulation CLF-1-تعتمد من سطح غشاء CNTFRα؟ لتوضيح هذا، وقد حاولت ذلك في البداية لتحديد معدل دوران CNTFRα (في غياب وجود sorLA) عن طريق وضع العلامات ونبض مطاردة التجارب التمثيل الغذائي كما هو موضح في 21. ومع ذلك، فإن محاولات لتسمية CNTFRα باستخدام خليط من [S 35] السيستين وأظهر [S 35] الميثيونين دمج الفقراء من النشاط الإشعاعي. اقترح هذا على درجة منخفضة جدا من جديد والتآلف، في جميع الاحتمالات التي لن تكون قادرة على تعويض عن خسارة مفاجئة وكبيرة من المستقبلات. لتحديد ما إذا كان downregulated CNTFRα عندما مترابطة عبر CLC: CLF-1 إلى sorLA، ولذلك تقرر ببساطة إلى قياس (باستخدام النشاف الغربي) التجمع الخلوي الكلي للCNTFRα قبل وبعد التعرض لCLC: CLF-1 - ومقارنة النتائج في الخلايا transfected أو لا transfected معsorLA.
هل استهداف sorLA CNTFRα إلى الجسيمات الحالة؟ للإجابة على هذا السؤال، وتوطين CNTFRα - المنضوية عبر CLC لها: CLF-1 بوساطة ملزمة لsorLA - تم فحص باستخدام مناعية، ووضع العلامات مع الأجسام المضادة الموجهة نحو CNTFRα وفي وقت متأخر من الاندوسوم / يحلول علامة الليزوزومية غشاء المرتبطة البروتين 1 (LAMP-1). تم إجراء التجربة على الخلايا المعالجة وكذلك دون علاج مع مثبطات الانزيمات الليزوزومية. وكانت الفكرة بالطبع أنه إذا تدهورت CNTFRα في الجسيمات الحالة، الخلايا المعالجة مع انزيم مثبطات سيقدم CNTFRα تلطيخ تتراكم في الحويصلات الإيجابية 1 مصباح، في حين أن الخلايا غير المعالجة سوف تظهر القليل أو أي تلطيخ للCNTFRα.
لا تقلل CNTFRα downregulation الاستجابة الخلوية لCLC: CLF-1 التحفيز؟ مجمع مثلوثي تتكون من CLC، CLF-1، وإشارات CNTFRα عبر gp130 / مغاير LIFRβ باستخدام JAK / STAT3المسار. وتبعا لذلك، فإن قدرة الخلايا على الاستجابة للCLC: تم استكشافها CLF-1 الإشارات على downregulation من CNTFRα من خلال الكشف طخة غربية والكميات لل/ المستوى الإجمالي STAT3 الفوسفات-STAT3 (pSTAT3) في transfectants sorLA.
Protocol
1. الغربية التنشيف من CNTFRα لست]
- التعبير عن كامل طول sorLA والموسومة Myc على-CNTFRα يبني في الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) الخلايا باستخدام pcDNA3.1 / ZEO (-) وpcDNA3.1 / سائل النظافة (-)، على التوالي. Transfect الخلايا HEK293 مع بنيات باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لبروتوكول manufacturer's. حدد استنساخ مستقرة في المتوسط تحتوي على 150 ميكروغرام / مل Zeocin و / أو 500 ميكروغرام / مل هيغروميسين B الذهب 13.
- أرقام البذور متساوية من HEK293 transfectants يعبرون إما CNTFRα. Myc على أو زملاء، معربا عن CNTFRα. Myc على / sorLA في اثنين من لوحات 4-جيدا كما هو موضح في الشكل 1. ثقافة الخلايا في Dulbecco التعديل Eagle's المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ الجنين مصل بقري (FBS)، و 100 البنسلين U / مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (المتوسطة الكامل) في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ إلى 37 مئوية.
- انتظر حتى الخلايا هي 50-80٪ متموجة.
- إزالة المتوسطة منالآبار، ويغسل مرة واحدة مع Dulbecco الفوسفات مخزنة المالحة (DPBS)، وإضافة المتوسطة الكامل الطازج مع أو بدون (مراقبة) 10 نانومتر CLC: CLF-1 كما هو مبين في الشكل 1. احتضان الخلايا عند 37 مئوية.
- بعد 0 و 5 ساعة من الحضانة، واستعادة والمتوسطة وتخزينه في 4 ج في أنابيب 1.5 مل. ثم يضاف 1٪ عازلة تريتون X-100 تحلل (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 10 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) تستكمل مع كوكتيل بروتين مثبط على كل بئر (1 دقيقة، 4 ج). وفي وقت لاحق، ونقل لست] خلية إلى 1.5 مل أنابيب (4 ج).
- تدور الأنابيب التي تحتوي على المديين المتوسط والخلايا المحللة (3000 x ج، 3 دقائق، 4 ج) ونقل supernatants إلى 1.5 مل أنابيب (4 ج). تجاهل بيليه. نقل 5 ميكرولتر من كل طاف خلية المحللة إلى 1.5 أنابيب جديدة مل - استخدامها لقياس محتوى البروتين في وقت لاحق (الخطوة 1.7). على الفور، إضافة امختزل عينة العازلة LDS لجميع supernatants ودوامة العينات.
- استخدام 5 مكل لقياس بروتمحتوى عين في supernatants خلية المحللة باستخدام فحص البروتين التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تسخين العينات عند 95 مئوية لمدة 5 دقائق.
- إخضاع مبلغ مساو من البروتين من كل عينة للحد من SDS-PAGE 13 و الغربية النشاف 13 وتصور مضمون sorLA، β-الأكتين، وCNTFRα. Myc على المدى المتوسط وفي الخلية لست] باستخدام أرنب المضادة للsorLA 16 (5 ميكروغرام / مل)، والماوس مكافحة β-الأكتين (0.4 ميكروغرام / مل)، والفأر مكافحة Myc على (1 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية المرتبطة HRP المناسب (1: 2000).
- قياس كثافة النطاقات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
2. سيتولوجية مناعية في تركيبة مع مثبطات الليزوزومية
- البذور HEK293 الخلايا ستابلي مع CNTFRα. Myc على / sorLA على الشرائح غطاء في لوحة 4-جيدا كما هو موضح في الشكل (2). ثقافة الخلايا في المتوسط الكامل على النحو الوارد أعلاه.
- انتظر حتى التقاء خلية هو 20 - 40٪.
- إزالة المتوسطة من الآبار وإضافة المتوسطة الكامل مع أو بدون 50 ميكروغرام / مل من leupeptin وpepstatin ألف (ليو / الحماسي) (يمنع هيدروليز الليزوزومية) إلى الخلايا كما هو مبين في الشكل 2. احتضان الخلايا عند 37 مئوية. المتوسط يجب أن يتم استبداله كل 6 ساعات خلال ال 24 ساعة التالية من الحضانة.
- بعد 24 ساعة من الحضانة، مرة أخرى تحل محل المتوسطة (مع أو بدون ليو / الحماسي)، وهذه المرة إضافة 10 نانومتر CLC: CLF-1. احتضان الخلايا عند 37 مئوية لمدة 5 ساعات.
- غسل خلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني واصلاحها في 4٪ امتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7 لمدة 15 دقيقة في RT.
تحذير: لامتصاص العرق شديد السمية، وتجنب ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية. القفازات والنظارات الواقية يجب أن ترتديه والحلول جعلت داخل غطاء الدخان. - غسل خلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني وpermeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق على RT في سابونين مخففة في برنامج تلفزيوني (0.5٪ سابونين).
- تمييع الماعز المضادة للCNTFRα (1 ميكروغرام / مل) (لا سيمالا الماوس مكافحة Myc على استخدامها لالنشاف الغربية) والفأر الأجسام المضادة-LAMP-1 (15 ميكروغرام / مل) في٪ سابونين 0.5 واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل الخلايا 4X (5 دقائق) في٪ سابونين 0.5 واحتضان الخلايا مع حمار المضادة للماعز اليكسا 488- وحمار لمكافحة فأر اليكسا الأجسام المضادة الثانوية 568 مترافق (6 ميكروغرام / مل) لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل الخلايا 4X (5 دقائق) في 0.5٪ سابونين، مرتين في الماء منزوع الأيونات (1 دقيقة)، وجبل الشرائح غطاء على مجهر الشرائح باستخدام وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
- تحليل الأجسام المضادة تلطيخ من الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي مع الهدف الغمر بالماء 63X C-امزيغ، NA 1.2.
3. ويسترن وصمة عار للكشف عن مستوى pSTAT3
- البذور خلايا HEK293-sorLA (التي تعبر عن المستويات الخفية CNTFRα) في لوحة 4-جيدا كما هو موضح في الشكل (3). ثقافة الخلايا في المتوسط الكامل على النحو الوارد أعلاه.
- انتظر حتىالخلايا هي 50-80٪ متموجة.
- إزالة المتوسطة من الآبار، ويغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، وإضافة المتوسطة الكامل الطازج مع أو بدون 10 نانومتر CLC: CLF-1 إلى الخلايا كما هو مبين في الشكل (3). احتضان الخلايا عند 37 مئوية لمدة 5 ساعات.
- إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مرتين في unsupplemented DMEM (متوسطة فارغة، وبدون FBS والمضادات الحيوية)، ثم reincubate الخلايا لمدة 90 دقيقة (37 ج) في المتوسط فارغة.
- مرة أخرى، وإزالة المتوسطة وإضافة المتوسطة فارغة جديدة مع أو بدون 5 نانومتر CLC: CLF-1 (لبدء STAT3 الفسفرة) كما هو مبين في الشكل (3). احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 مئوية.
- بسرعة إزالة المتوسطة وليز الخلايا (1 دقيقة، 4 ج) وذلك بإضافة 1٪ العازلة تحلل تريتون X-100 (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 10 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) تستكمل مع كوكتيل بروتين المانع والمانع الفوسفاتيز كوكتيل على كل جانب. وفي وقت لاحق، ونقل لست] خلية إلى 1.5 مل أنابيب (4 ج).
- نقل 5 ميكرولتر سو كل طاف إلى 1.5 أنابيب جديدة مل - استخدامها لقياس محتوى البروتين في وقت لاحق (الخطوة 3.8). على الفور، إضافة امختزل عينة العازلة LDS لجميع supernatants ودوامة العينات.
- قياس محتوى البروتين من 5 مكل باستخدام فحص البروتين التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- يصوتن كل عينة في RT حتى أنها لم تعد لزجة (حوالي 1 دقيقة)، وبعد ذلك تسخينها في 95 مئوية لمدة 5 دقائق.
- إخضاع مبلغ مساو من البروتين من كل عينة إلى SDS-PAGE 13 و الغربية النشاف 13 وتصور مضمون pSTAT3 وSTAT3 الكلي في الخلية لست] باستخدام أرنب المضادة للpSTAT3 (1: 2000) والفأر مكافحة STAT3 (1: 1000 ) الأضداد، والماوس المرتبطة HRP والأرنب الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (1: 2000).
- قياس كثافة النطاقات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
Representative Results
ويبين الشكل 1 التمثيل التخطيطي للخلية البذر وCLC: CLF-1 حضانة في بروتوكول 1. يبين الشكل 2 تمثيل تخطيطي لخلية البذر وليو / الحماسي وCLC: CLF-1 حضانة في بروتوكول 2. الشكل 3 يظهر التمثيل التخطيطي للخلية البذر وCLC: CLF-1 حضانة والتحفيز في بروتوكول 3. الشكل 4 يبين CLC بوساطة sorLA: downregulation CLF-1-تعتمد من CNTFRα. ويبين الشكل 5 بوساطة sorLA-الإلتقام والليزوزومية استهداف CNTFRα. ويبين الشكل 6 استجابة أقل لCLC: CLF-1 التحفيز بعد CNTFRα downregulation.
لاحظ أن العصابات يدل CNTFRα. Myc على ديها كثافة مماثلة في وقت الصفر، في حين أظهرت downregulation من CNTFRα. Myc على من قبل الفرقة الأضعف في transfectants sorLA بعد عملية الشراءص 5 ح (الشكل 4). ويبين الشكل (5) التي CNTFRα. Myc على تراكمت في LAMP-1 الحويصلات الإيجابية لبيب تعامل خلية / ليو. في المقابل، يرى أي تراكم CNTFRα. Myc على خلايا لم تخضع للعلاج ليو / الحماسي. هذا يدل على أن يتم فرز CNTFRα. Myc على أن الجسيمات الحالة والمتدهورة. كما يمكن أن يرى في الشكل (6)، وتخفيض مستوى pSTAT3 بشكل كبير في الخلايا تحفز قبل بالمقارنة مع مستواها في الخلايا التي لم تتعرض لCLC: CLF-1. هذا هو وفقا لوحظ downregulation بوساطة sorLA من CNTFRα في الخلايا تحفز مسبقا (الشكل 4).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لخلية البذر وCLC: CLF-1 حضانة في بروتوكول 1. بذور HEK293-CNTFRα. Myc على وHEK293-CNTFRα. Myc على / sorLA الخلايا في اثنين 4-جيدا لوحات (0 و 5 ساعات) واحتضان الخلايا مع CLC: CLF-1 كما هو محدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لخلية البذر وليو / الحماسي وCLC: CLF-1 حضانة في بروتوكول 2. البذور خلايا HEK293-CNTFRα. Myc على / sorLA على الشرائح غطاء في لوحة 4-جيدا واحتضان الخلايا مع أو بدون ليو / الحماسي وCLC: CLF-1 كما هو محدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تمثيل تخطيطي لخلية البذر وCLC: CLF حضانة والتحفيز في بروتوكول 3. البذور خلايا HEK293-sorLA في واحد لوحة 4-جيدا واحتضان الخلايا مع أو بدون CLC: (ما قبل إكسب) CLF-1 إلى downregulate لل يتبع CNTFRα بواسطة CLC: CLF-1 التحفيز (. STIM) لبدء STAT3 الفسفرة كما هو محدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج تظهر أن SorLA يتوسط CLC: downregulation CLF-1-تعتمد من CNTFRα. (A) وحضنت HEK293-CNTFRα. Myc على وخلايا (ب) HEK293-CNTFRα. Myc على / sorLA في غياب (الأعمدة البيضاء) أو وجود (أعمدة رمادية) المؤرخ 10 نانومتر CLC: CLF-1. بعد 0 و5 ساعات، تم إيقاف الحضانة ومضمون CNTFRα. Myc على المدى المتوسط (م) و في الخلية لست] (ل) تم الكشف عنها من قبل الغرب النشاف وكميا عن طريق قياس كثافة. وتظهر لوحات العليا النتائج طخة غربية من التجارب التمثيلية وألواح أقل تظهر المستويات المكتشفة من CNTFRα. Myc على العثور عليها في الخلية لست]. وأظهرت مستويات النسبي إلى مستوى CNTFRα. Myc على وtransfectants مفردة ومزدوجة في 0 ساعة. يمثل كل عمود يعني ± SEM (ن = 3). ف القيم تحسب باستخدام اختبار (ت). مستنسخة بعد الرقم الأصلي 13. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (5):النتائج تبين أن SorLA تتوسط الإلتقام والليزوزومية استهداف CNTFRα. تم علاج خلايا HEK293-CNTFRα. Myc على / sorLA مع أو بدون ليو / الحماسي، حضنت مع 10 نانومتر CLC: CLF-1 لمدة 5 ساعات، ثابت، والملون أخيرا باستخدام مكافحة CNTFRα ومكافحة LAMP-1-الأجسام المضادة كما هو موضح في البروتوكول 2. الحانات الحجم: 5 ميكرون. مستنسخة بعد الرقم الأصلي 13. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (6): ويرافق downregulation بوساطة SorLA من CNTFRα من الاستجابة الخلوية خفضت إلى CLC: CLF-1 التحفيز.
وخلايا HEK293-sorLA قبل المحتضنة في غياب أو وجود 10 نانومتر CLC: (ما قبل إكسب) CLF-1 لمدة 5 ساعات والتجويع في بلانمتوسطة ك لمدة 90 دقيقة، وحفز مع 5 نانومتر CLC: (STIM) CLF-1 لمدة 15 دقيقة. (يسار) والأعمدة تظهر المستويات النسبية للpSTAT3 في الخلايا. يمثل كل عمود يعني ± SEM (ن = 3) بالنسبة لمستوى pSTAT3 في الخلايا preincubated في غياب CLC: CLF-1 لكن حفز مع CLC: CLF-1. ف القيمة المحسوبة باستخدام اختبار (ت). (يمين) وصمة عار الغربية تظهر استجابة pSTAT3 وSTAT3 التي تم الحصول عليها في تجربة تمثيلية. مستنسخة بعد الرقم الأصلي 13. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم خصيصا لإظهار CLC بوساطة sorLA: downregulation CLF-1-تعتمد والليزوزومية استهداف CNTFRα، فضلا عن المرافق ضعف استجابة إلى CLC: CLF-1 التحفيز.
خط الخلية HEK293 غير مناسبة تماما لهذا البروتوكول، لأنها لا تملك إلا تعبير الذاتية طفيفة من CNTFRα وsorLA، من السهل ل transfect، صريحة gp130 / LIFRβ، ويكون لها جسم الخلية واسع، والتي هي مناسبة للمناعية. ومع ذلك، من الناحية النظرية أي خط الخلية مع خصائص مماثلة يجب أن تعمل كذلك.
بروتوكول اثنين من الخطوات الحاسمة. اولى اهتمامات خطوة 2.3، الذي ليو / الحماسي المتوسطة يجب أن يتم استبدال تقريبا كل ساعة 6 لمدة 24 ساعة. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في الانزيمات الليزوزومية نشطة وأقل أو لا تراكم اكتشاف البروتين في الجسيمات الحالة. الخطوة الثانية الحاسمة (3.4) المخاوف غسل عليها مرحلة ما قبل الحضانة مع CLC: CLF-1. ومن ايمportant لإزالة أي يجند غير منضم، والسماح للوقت خلايا لاسترداد (تجنب استمرار التحفيز) في DMEM unsupplemented (متوسطة فارغة). وهذا يضمن مستوى خلفية انخفاض pSTAT3 خلال لاحقا إعادة التحفيز مع CLC: CLF-1 (الخطوة 3.5).
والجدير بالذكر أن الشكل (6) يدل على أن الاستجابة الخلوية (pSTAT3) يقلل بالتوازي مع downregulation بوساطة sorLA من CNTFRα. وينبغي التأكيد على ذلك، أنه على الرغم من انخفاض الاستجابة وفقا لل(والتي يمكن توقعها على) انخفاضا من تجمع CNTFRα، فإنه لا يثبت أن التعبير CNTFRα منخفض وحده مسؤولا عن الاستجابة الخلوية مخفضة. وهكذا، التغييرات - الناتجة عن مرحلة ما قبل التحفيز أو ترنسفكأيشن - في أي من العناصر الفنية من مسار الإشارات المنبع إلى pSTAT3 قد ساهمت في استجابة المتغيرة.
المفهوم الأساسي للبروتوكول لا يقتصر على هذا particuنظام مستقبلات لار. (. أي خط آخر الخلية، والأجسام المضادة الأخرى، بروابط أخرى، الخ) عن طريق تعديل بروتوكول يمكن استخدامه لتحديد downregulation التي يسببها يجند مستقبلات أخرى كذلك - بغض النظر عن مشاركته sorLA's. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تحليل مستقبلات downregulation قبل الغرب النشاف هي مناسبة أساسا لمستقبلات، على سبيل المثال، مستقبلات الراسية مؤشر التكافؤ بين الجنسين، والتي تظهر دوران بطيء ودرجة منخفضة من توليفة جديدة في الخلايا unstimulated. وهكذا، في مستقبلات تظهر على مستوى عال من جديد والتآلف، قد يتم تعويضهم downregulation التي يسببها يجند لعن طريق التخليق مستقبلات جديدة. في ظل هذه الظروف، فإن downregulation تجمع مستقبلات يمكن بدلا من ذلك أن تحدد عن طريق وضع العلامات ونبض مطاردة التجارب التمثيل الغذائي كما هو موضح في 21. بدلا من ذلك، والأجسام المضادة معالجتها باليود (ويفضل FC-شظايا) التي لا تتداخل مع مستقبلات ملزمة يمكن استخدامها ل"سمة" وectodomain من باستقبالأو، وdownregulation المتوقع عندئذ يمكن تحديدها من قبل العد الإشعاعي للخلية بيليه والمتوسطة.
لأسباب لوجيستية نحن transfected خلايانا مع CNTFRα بناء من يحمل Myc على العلامة، وفي هذا البروتوكول تم استخدام الماوس لمكافحة Myc على الأجسام المضادة للالغربي لطخة الكشف عن مستقبلات. في المقابل، تم استخدام الماعز المضادة للCNTFRα الأجسام المضادة للمناعية ووضع العلامات مزدوج كما تم الكشف عن LAMP-1 عن طريق الأجسام المضادة الماوس - وبالطبع استخدام اثنين من الأجسام المضادة الماوس الأولية من شأنه أن يؤدي في غير محددة (تداخل) تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية. نلاحظ أنه منذ الماعز المضادة للCNTFRα يعمل أيضا في النشاف (لا يظهر) الغربية، وبروتوكول يمكن بسهولة تعديل وتطبيقها على خلايا transfected مع بلا علامات CNTFRα.
وأخيرا، تم مؤخرا تبين أن أيضا مستقبلات sortilin التقامي يربط CLC: CLF-1 مع قابلية عالية 22. وبالتالي، فإنه من المتصور أن sortilin، مثلsorLA، يربط إلى CLC: CNTFRα عبر CLF-1 وقادرة على التوسط الإلتقام والليزوزومية استهداف CNTFRα كذلك. باستخدام sortilin بدلا من sorLA، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوضيح هذه المسألة.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
