Summary
Den foreliggende protokollen beskriver hvordan Western blotting og immunocytokjemi kombinert med hemming av lysosomale enzymer kan anvendes for å demonstrere den nedregulering av ciliær neurotrofisk faktor-reseptor-α (CNTFRα), som føres ved interaksjonen mellom cytokin-lignende faktor-1 (CLF-1 ) og endocytic reseptoren sorLA.
Abstract
Den heterodimere cytokin Cardiotrophin lignende cytokin: cytokin-lignende Factor-1 (CLC: CLF-1) er rettet mot glykosylfosfatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα å danne en trimere kompleks som senere rekrutterer glykoprotein 130 / leukemi hemmende faktor reseptor-β (gp130 / LIFRβ) for signalering. Både CLC og CNTFRα er nødvendige for signalering, men hittil CLF-1 har bare vært kjent som en antatt tilrettelegger for CLC sekresjon. Imidlertid har det nylig blitt vist at CLF-en inneholder tre bindingssteder: en for CLC; en for CNTFRα (som kan fremme sammenstillingen av trimere kompleks); og en for endocytic reseptoren sorLA. Det sistnevnte område gir høy affinitetsbinding av CLF-1, CLC: CLF-1, så vel som den trimere (CLC: CLF-1: CNTFRα) -kompleks for å sorLA, og i sorLA-uttrykkende celler de løselige ligander CLF-1 og CLC : CLF-en blir raskt tatt opp og internalisert. I celler co-uttrykker CNTFRα og sorLA, CNTFRα binder første CLC: CLF-en for å danneen membran-assosiert trimere kompleks, men det kan også kobles til sorLA via gratis sorLA-bindingssetet i CLF-en. Som et resultat, CNTFRα, som ikke har kapasitet til endocytose av seg selv, er rykket sammen og internaliseres av sorLA endocytose av CLC: CLF-1.
Den nåværende protokollen beskriver de eksperimentelle prosedyrer som brukes til å demonstrere i) sorLA-mediert og CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av overflatemembran CNTFRα uttrykk; ii) sorLA endocytose og lysosomal målretting av CNTFRα; og iii) den senkede cellulær respons overfor CLC: CLF-1-stimulering ved sorLA-mediert nedregulering av CNTFRα.
Introduction
CLC og CLF-en utgjør de to subenheter av heterodimere cytokin CLC: CFL-en 1-3. For signal induksjon, CLC: CLF-1 første målene den CNTFRα, dens primære og GPI-forankret reseptoren, for å danne en membran-bundet trimere kompleks. CLC: CLF-1: CNTFRα kompleks senere rekrutterer gp130 / LIFRβ som formidler transsignalering via Janus Kinase / Signal Givere og aktivatorer av transkripsjon 3 (JAK / STAT3) pathway 4. Mus mangelfull i en hvilken som helst av de tre subenheter viser en og samme fenotype og dør innen 24 timer etter fødselen på grunn av et redusert antall ansiktsnerveceller og utilstrekkelig diende 5-8. Funn i mennesker også understreke den funksjonelle sammenhengen i de tre subenheter. Dermed menneskelige mutasjoner (homozygote eller sammensatte) forårsaker dysfunksjon av CLC: CLF-en eller CNTFRα, alle resultat i den såkalte kuldeindusert svetting / Crisponi syndrom, en tilstand karakterisert ved symptomer som impairød dier og svelge, ulike dysmorphic funksjoner, temperatur pigger, og paradoksalt og perfuse svett ved lave temperaturer 9-11.
In vitro, er både nødvendig og tilstrekkelig for interaksjon med gp130 / LIFRβ og induksjon av signalering i celler 12 kombinasjonen av CLC og CNTFRα. Rollen til CLF-1 på den annen side er mindre klar. Det er ikke direkte involvert i signalering, og har lenge vært ansett som et vedlegg som hovedsakelig tjener til å lette celle utskillelsen av CLC en. Men nyere funn viser at CLF-en har flere og flere viktige funksjoner implicating både signal og omsetning av CLC og CNTFRα. Dermed ser det ut til at CLF-en inneholder tre uavhengige bindingssteder: en for sin velkjente binding til CLC; en som formidler direkte binding til CNTFRα; og en tredje (høy affinitet) nettsted for interaksjon med endocytic reseptoren sorLA. Som både CLC og CLF-en virke & #160, for å målrette CNTFRα med en betydelig lavere affinitet enn CLC: CLF-1-komplekset, er det tenkelig at CLF-1 (via dens CNTFRα-bindingssetet) fremmer samlingen av CLC og CNTFRα og derved letter signale 13.
CLF-en interaksjon med sorLA, den viktigste saken for den foreliggende presentasjon, spiller en helt annen rolle. SorLA er en av de fem type 1-reseptorer som utgjør Vps10p-domenet reseptor familien 14. Den uttrykkes i en rekke forskjellige vev, men spesielt i hjernen og neuronale vev 15. I likhet med de andre familiemedlemmer sorLA bærer en N-terminale ligandbindende Vps10p-domene, men i tillegg omfatter den også andre domenetyper, inkludert ligand-bindende elementer som finnes i medlemmer av low-density lipoprotein receptor familie 15. Dens cytoplasmatiske hale samhandler med flere adapter proteiner, f.eks adapter protein-1 og -2, og sorLA formidler effektive endocytoser i tillegg til intracellulær sortering og transport av bundne proteiner 16-18. Den Vps10p-domene består av en stor ti blader β-propell 19,20, som binder en rekke urelaterte ligander inkludert CLF-en (men spesielt, ikke CLC) 13. Bindingssetet i CLF-en er tilgjengelig selv etter dannelsen med CLC og CNTFRα kompleks som betyr at sorLA binder ikke bare gratis CLF-en, men også CLC: CLF-en og trimere komplekse CLC: CLF-1: CNTFRα 13. SorLA formidler hurtig endocytose av CLF-1 og CLC: CLF-en, men disse er oppløselige proteiner, mens CNTFRα er festet til overflatemembranen ved et GPI-ankeret. Spørsmålet er derfor om bindingen av CLC: CLF-1: CNTFRα tillater sorLA å internal hele komplekset og derved å endre overflatemembranen ekspresjon av CNTFRα (og den påfølgende celle mottakelighet for CLC: CLF-1 signal induksjon), og / eller omsetningen av CNTFRα.
Forsøkene som beskrives i den foreliggendeRapporten ble laget for å avklare disse spørsmålene:
Har sorLA megle CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av overflatemembran CNTFRα? For å klargjøre dette, ble det først prøvde å bestemme omsetningen av CNTFRα (i fravær og nærvær av sorLA) ved hjelp av metabolske merking og puls-chase eksperimenter som er beskrevet i 21. Imidlertid har forsøk på å merke CNTFRα ved anvendelse av en blanding av [S 35] cystein og [S 35] metionin viste dårlig inkorporering av radioaktivitet. Dette antydet en meget lav grad av ny-syntese, som etter all sannsynlighet vil være ute av stand til å kompensere for en plutselig og betydelig tap av reseptorer. For å avgjøre om CNTFRα ble nedregulert når sammen via CLC: CLF-en til sorLA, ble det derfor besluttet bare å måle (ved hjelp av Western blotting) den totale mobilnettet pool av CNTFRα før og etter eksponering for CLC: CLF-en - og å sammenligne resultater i celler transfektert eller ikke transfektert medsorLA.
Har sorLA målrette CNTFRα til lysosomer? For å besvare dette spørsmålet, lokalisering av CNTFRα - internalisert via sin CLC: CLF-1-mediert binding til sorLA - ble undersøkt ved hjelp av immunocytokjemi og merking med antistoffer rettet mot CNTFRα og sen-endosomet / lysosome markør lysosomal-forbundet Membrane Protein 1 (LAMP-1). Eksperimentet ble utført på celler som behandles, så vel som ubehandlet med inhibitorer av lysosomale enzymer. Tanken var selvsagt at hvis CNTFRα ble nedbrutt i lysosomer, ville celler behandlet med enzym-inhibitorer frem CNTFRα-farging akkumuleres i lampe-1-positive vesikler, mens ubehandlede celler ville vise liten eller ingen farging for CNTFRα.
Har CNTFRα downregulation senke cellulær respons til CLC: CLF-en stimulering? Den trimere kompleks bestående av CLC, CLF-en, og CNTFRα signaler via gp130 / LIFRβ heterodimer med JAK / STAT3sti. Følgelig til kapasiteten på cellene svare på CLC: CLF-en signale på nedregulering av CNTFRα ble utforsket av Western blot påvisning og kvantifisering av fosfor-STAT3 (pSTAT3) / total STAT3 nivå i sorLA transfektanter.
Protocol
1. Western blotting av CNTFRα Lysates
- Uttrykker full-lengde sorLA og Myc-tagged CNTFRα-konstruksjoner i humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler ved anvendelse av pcDNA3.1 / Zeo (-) og pcDNA3.1 / HYG (-), respektivt. Transfektere de HEK293-celler med konstruksjonene ved hjelp av en kommersiell transfeksjon reagens i henhold til produsentens protokoll. Velge stabile kloner i medium inneholdende 150 ug / ml Zeocin og / eller 500 ug / ml Hygromycin B Gold 13.
- Seed like mange HEK293-transfektanter som uttrykker enten CNTFRα-Myc eller ko-uttrykker CNTFRα-Myc / sorLA i to 4-brønners plater som vist i figur 1. Kultur cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle's Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (fullstendig medium) i en 5% karbondioksyd-inkubator ved 37 ° C.
- Vent inntil cellene er 50 - 80% sammenflytende.
- Fjern mediet frabrønnene vaskes en gang med Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS), og tilsett friskt komplett medium med eller uten (kontroll) 10 nM CLC: CLF-1 som vist i figur 1. Inkuber cellene ved 37 ° C.
- Etter 0 og 5 h inkubasjon gjenopprette medium og oppbevar den på 4 ˚C i 1,5 ml rør. Deretter tilsett 1% Triton X-100 lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0) supplert med en proteinase-inhibitor cocktail til hver brønn (1 min, 4 ° C). Deretter overfører cellelysatene til 1,5 ml rør (4 C).
- Spinne rør som inneholder mediet og cellelysat (3000 xg, 3 min, 4 ° C) og overføre supernatantene til 1,5 ml rør (4 C). Kast pelleten. Overføring 5 ul av hvert cellelysat supernatant til nye 1,5 ml rør - bruke dem til å måle proteininnholdet senere (trinn 1.7). Umiddelbart, legge reduserende LDS sample buffer til alle supernatants og virvle prøvene.
- Bruk 5 pl alikvoter for å måle protEin innhold i cellelysatet supernatantene ved bruk av en kommersiell proteinanalyse i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
- Varme opp prøvene ved 95 ° C i 5 minutter.
- Underkaste en lik mengde protein fra hver prøve til reduserende SDS-PAGE 13 og Western blotting 13 og visualisere innholdet av sorLA, β-aktin, og CNTFRα-Myc i mediet og i cellelysatene ved å bruke kanin anti-sorLA 16 (5 ug / ml), muse-anti-β-aktin (0,4 ug / ml), og mus anti-Myc (1 ug / ml) antistoffer og de aktuelle HRP-bundne sekundære antistoff (1: 2000).
- Kvantifisere band ved densitometri henhold til produsentens protokoll.
2. Immunocytochemistry i kombinasjon med lysosomale hemmere
- Seed HEK293 celler stabilt transfektert med CNTFRα-Myc / sorLA på dekkglass i en fire-brønns plate som vist i figur 2. Kultur cellene i fullt medium som ovenfor.
- Vent til celle samløpet er 20 - 40%.
- Fjern mediet fra brønnene og legge til fullstendig medium med eller uten 50 ug / ml leupeptin og pepstatin A (leu / pep) (hemmer lysosomale hydrolaser) til cellene som vist i figur 2. Inkuber cellene ved 37 ° C. Mediet må skiftes ut hver 6. time i løpet av de følgende 24 timer inkubering.
- Etter 24 timers inkubering, igjen erstatte medium (med eller uten leu / pep) og denne gang tilsettes 10 nM CLC: CLF-1. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5 timer.
- Vask cellene en gang i PBS og feste dem i 4% paraformaldehyd, pH 7 i 15 minutter ved RT.
Forsiktig: Paraformaldehyde er svært giftig, unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. Hansker og vernebriller bør brukes og løsninger laget inne i en avtrekkshette. - Vask cellene en gang i PBS og permeabilisere cellene i 5 min ved RT i saponin fortynnet i PBS (0,5% saponin).
- Fortynn geit anti-CNTFRα (1 pg / ml) (særligikke til mus anti-Myc anvendt for Western blotting) og mus anti-LAMPE-1 (15 ug / ml) antistoff i 0,5% saponin og inkuberes cellene med antistoffene i 2 timer ved RT.
- Vask cellene 4x (5 min) i 0,5% saponin og inkuberes cellene med esel anti-geit Alexa 488 og esel anti-mus Alexa 568-konjugerte sekundære antistoffer (6 ug / ml) i 2 timer ved RT.
- Vask cellene 4x (5 min) i 0,5% saponin, to ganger i avionisert vann (1 min), og monter dekselet glir på objektglass ved hjelp av monterings medier.
- Analyser antistoff-farging av cellene ved konfokalmikroskopi ved hjelp av en laser-scanning confocal mikroskop med en 63X C-apochromat vann nedsenking objektiv, NA 1.2.
3. Western Blot-påvisning av pSTAT3 nivå
- Seed HEK293-sorLA celler (som uttrykker endogene nivåer av CNTFRα) i et 4-brønns plate som vist på figur 3. Kultur cellene i fullt medium som ovenfor.
- Vent tilcellene er 50 - 80% sammenflytende.
- Fjern mediet fra brønnene vaskes en gang i PBS, og tilsett friskt komplett medium med eller uten 10 nM CLC: CLF-1 til celler som vist i Figur 3. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5 timer.
- Fjern medium, vaskes cellene to ganger i usupplert DMEM (blank medium, uten FBS og antibiotika), og deretter reincubate cellene i 90 minutter (37 ° C) i blank medium.
- Nok en gang, fjerner medium og tilsett frisk blank medium, med eller uten 5 nM CLC: CLF-en (for å sette i gang STAT3 fosforylering) som vist i Figur 3. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C.
- Raskt fjerne mediet og lysere cellene (1 min, 4 ° C) ved tilsetning av 1% Triton X-100 lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0) supplert med en proteinase-inhibitor cocktail og en fosfatase-inhibitor cocktail til hver brønn. Deretter overfører cellelysatene til 1,5 ml rør (4 C).
- Overføring 5 mL of hver supernatant til nye 1,5 ml rør - bruke dem til å måle proteininnholdet senere (trinn 3.8). Umiddelbart, legge reduserende LDS sample buffer til alle supernatants og virvle prøvene.
- Måle proteininnholdet i de 5 pl aliquoter ved bruk av en kommersiell proteinanalyse i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
- Sonikere hver prøve ved RT inntil de ikke lenger er tyktflytende (ca. 1 minutt) og deretter oppvarme dem ved 95 C i 5 min.
- Underkaste en lik mengde protein fra hver prøve for SDS-PAGE 13 og Western blotting 13 og visualisere innholdet av pSTAT3 og total STAT3 i cellelysatene ved å bruke kanin anti-pSTAT3 (1: 2000) og muse anti-STAT3 (1: 1000 ) antistoffer og de aktuelle HRP-linked mus og kanin sekundære antistoffer (1: 2000).
- Kvantifisere band ved densitometri henhold til produsentens protokoll.
Representative Results
Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av celle-såing og CLC: CLF-en inkubering i protokoll 1. Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av celle-såing og leu / pep og CLC: CLF-en inkubering i protokoll 2. Figur 3 viser en skjematisk fremstilling av cellen-seeding og CLC: CLF-en inkubasjon og stimulering i protokoll 3. Figur 4 viser sorLA-mediert CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av CNTFRα. Figur 5 viser den sorLA endocytose og lysosomal målretting av CNTFRα. Figur 6 viser den nedre respons på CLC: CLF-1 stimulering etter CNTFRα nedregulering.
Legg merke til at band som betegner CNTFRα-Myc har tilsvarende tetthet ved null, mens nedregulering av CNTFRα-Myc er demonstrert av den svakere bandet i sorLA transfektanter after 5 timer (figur 4). Figur 5 viser at CNTFRα-Myc har akkumulert i LAMP-1 positive vesikler av leu / pep behandlede celler. I motsetning til dette er ingen akkumulering av CNTFRα-Myc sett i celler ikke utsettes for leu / pep behandling. Dette viser at CNTFRα-Myc er sortert til lysosomer og degradert. Som det kan ses i figur 6, er nivået av pSTAT3 betydelig redusert i pre-stimulerte celler sammenlignet med nivået i celler som ikke har vært utsatt for CLC: CLF-1. Dette er i overensstemmelse med den observerte sorLA-mediert nedregulering av CNTFRα i de pre-stimulerte celler (figur 4).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av celle-seeding og CLC: CLF-en ruge i protokollen 1. Seed HEK293-CNTFRα-MYC og HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA celler i to 4-brønners plater (0 og 5 h) og inkuber celler med CLC: CLF-1 som angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av celle-såing og leu / pep og CLC: CLF-en inkubasjon i protokoll 2. Seed HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA cellene på dekkglass i et 4-brønns plate og inkuberes cellene med eller uten leu / pep og CLC: CLF-en som vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av celle-seeding og CLC: CLF inkubasjon og stimulering i protokoll 3. Seed HEK293-sorLA celler i en fire-brønns plate og inkuber celler med eller uten CLC: (. pre-exp) CLF-en for å nedregulere CNTFRα fulgt av CLC: CLF-1 stimulering (. Stim) for å initiere fosforylering STAT3 som angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Resultater viser at SorLA formidler CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av CNTFRα. (A) HEK293-CNTFRα-Myc og (B) HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA cellene ble inkubert i fravær (hvite kolonner) eller nærvær (grå kolonner) av 10 nM CLC: CLF-1. Etter 0 og5 h, inkubasjonen ble stoppet og innholdet av CNTFRα-Myc i mediet (m) og i cellelysatene (l) ble påvist ved Western blotting og kvantifisert ved densitometri. De øvre panelene viser Western blot resultater fra representative forsøk og de nedre felter viser de detekterte nivåer av CNTFRα-Myc funnet i cellelysatene. Nivåene er vist i forhold til den CNTFRα-Myc nivå i enkle og doble transfektanter ved 0 h. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM (n = 3). p-verdier beregnet under anvendelse av t-test. Gjengitt etter opprinnelige figur 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:Resultatene viser at SorLA formidler endocytose og lysosomal målretting av CNTFRα. HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA-celler ble behandlet med eller uten leu / pep, inkubert med 10 nM CLC: CLF-en i 5 timer, fiksert, og til slutt farget ved anvendelse av anti-CNTFRα og anti-LAMPE-1-antistoffer som beskrevet i protokollen 2. Scale barer: 5 mikrometer. Gjengitt etter opprinnelige figur 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: SorLA-mediert nedregulering av CNTFRα er ledsaget av en redusert cellulær respons overfor CLC: CLF-1 stimulering.
HEK293-sorLA cellene ble pre-inkubert i fravær eller nærvær av 10 nM CLC: (. Pre-exp) CLF-en i 5 timer, sultet i blank medium i 90 min, og stimulert med 5 nM CLC: (. Stim) CLF-en i 15 min. (Venstre) Søylene viser de relative nivåer av pSTAT3 i cellene. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3) i forhold til pSTAT3 nivå i celler preinkubert i fravær av CLC: CLF-1, men stimulert med CLC: CLF-1. p-verdien beregnes under anvendelse av t-test. (Høyre) Western blot viser responsen av pSTAT3 og STAT3 oppnådd i et representativt eksperiment. Gjengitt etter opprinnelige figur 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen er beskrevet her kan brukes for spesifikt å påvise den sorLA-mediert CLC: CLF-1-avhengige nedregulering og lysosomal målretting av CNTFRα, så vel som den tilhørende svekket respons på CLC: CLF-1 stimulering.
Den HEK293 cellelinje er godt egnet for denne protokollen, som de har bare en mindre endogen uttrykk for CNTFRα og sorLA, er lett å transfektere, hurtig gp130 / LIFRβ, og har en stor celle kroppen, som er egnet for immunocytochemistry. Men i teorien alle cellelinje med tilsvarende egenskaper skal fungere også.
Protokollen har to kritiske trinn. Det første gjelder trinn 2.3, i hvilken leu / pep medium må byttes ut omtrent hver 6 time i 24 timer. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i aktive lysosomale enzymer og mindre eller ingen påviselig opphopning av protein i lysosomene. Den andre kritiske trinn (3.4) gjelder vasking på pre-inkubasjon med CLC: CLF-en. Det er imtig for å fjerne eventuelt ubundet ligand, og å tillate cellene tid å gjenopprette (forts unngå stimulering) i usupplert DMEM (blank medium). Dette vil sikre en lav bakgrunnsnivået av pSTAT3 under den etterfølgende re-stimulering med CLC: CLF-1 (trinn 3.5).
Spesielt, figur 6 viser at den cellulære respons (pSTAT3) avtar i parallell med sorLA-mediert nedregulering av CNTFRα. Det skal understrekes imidlertid at selv om en redusert respons er i overensstemmelse med (og som kan forventes ved) en reduksjon av CNTFRα bassenget, er det ikke påvise at den lave CNTFRα uttrykket alene står for den reduserte cellulære respons. Således endringer - som følge av pre-stimulering eller transfeksjon - i en hvilken som helst av de funksjonelle elementene i signalveien oppstrøms til pSTAT3 kan ha bidratt til den endrede respons.
Det grunnleggende konsept av protokollen er ikke begrenset til denne spesiLar receptor systemet. (. Dvs. en annen cellelinje, andre antistoffer, andre ligander, etc) ved modifisering av protokollen kan den brukes til å bestemme den ligand-induserte nedregulering av andre reseptorer i tillegg - uavhengig av sorLA's engasjement. Imidlertid bør det bemerkes at analysen av reseptor-nedregulering ved Western-blotting er hovedsakelig egnet for reseptorer, f.eks GPI-forankrede reseptorer, som utviser en langsom omsetning og en lav grad av ny syntese i ikke-stimulerte celler. Således, i-reseptorer som viser et høyt nivå av ny-syntese, ligand-induserte nedregulering kan kompenseres for ved syntese av nye reseptorer. Under disse omstendigheter kan nedregulering av reseptoren bassenget i stedet bli bestemt ved hjelp av metabolske merking og puls-chase eksperimenter som er beskrevet i 21. Alternativt joderte antistoffer (fortrinnsvis Fc-fragmentene) som ikke interfererer med reseptorbinding kan brukes til å "tag" den ectodomain av recepteller, og det forventede nedregulering kan deretter bestemmes ved radioaktiv telling av cellepellet og medium.
For logistikk grunnene til at vi tilført våre celler med en CNTFRα konstruere bærer en Myc-tag, og i denne protokoll en mus anti-myc antistoffet ble benyttet for Western blot-påvisning av reseptoren. I motsetning til dette ble en geit anti-CNTFRα antistoff som brukes for immunocytokjemi og dobbeltmerking som LAMPE-1 ble detektert med et museantistoff - og selvsagt bruk av to primære museantistoffer vil resultere i uspesifikk (overlappende) farging med sekundære antistoffer. Legg merke til at siden geite-anti-CNTFRα fungerer også i Western blotting (ikke vist), protokollen kan lett modifiseres og anvendes på celler transfektert med umerket CNTFRα.
Endelig har det nylig vist at også endocytic reseptoren sortilin binder CLC: CLF-en med høy affinitet 22. Således er det tenkelig at sortilin, i likhetsorLA, sammenkoblinger til CLC: CNTFRα via CLF-1 og er i stand til å formidle endocytose og lysosomal målretting av CNTFRα også. Bruke sortilin istedenfor sorLA, kan den nåværende protokollen brukes til å avklare dette spørsmålet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
