Summary
Bu protokol, sitokin-benzeri faktör-1 (CLF-1 arasındaki etkileşimi ile nakledildiği Silier Nörotrofik Faktör Reseptör-a (CNTFRα), infekte göstermek için nasıl kullanılabileceğini Western lekeleme ve lizozomal enzim inhibisyonu ile birlikte immünositokimya tarif ) ve endositik reseptör sorLA.
Abstract
heterodimerik sitokin Kardiyotropin gibi sitokin: Sitokin benzeri Faktör-1 (CLC: CLF-1) (glikozil (GPI) daha sonra 130 / Lösemi İnhibitör Faktörü Reseptör-p glikoprotein erler bir trimerik kompleksi oluşturmak üzere CNTFRα -anchored hedef gp130 / sinyali için LIFRβ). CLC ve CNTFRα iki sinyal ancak bugüne kadar CLF-1'in sadece CLC salgılanması farazi bir kolaylaştırıcı olarak bilinmektedir için gereklidir. Bununla birlikte, son zamanlarda CLF 1, üç bağlama bölgesine içerdiği gösterilmiştir: CLC için on; CNTFRα için bir (bu trimerik kompleksinin montaj teşvik edebilir); ve endositik reseptörü sorLA için. CLF-1, hem de trimerik (CLC: CLF 1: CNTFRα) ikinci Alanı CLF-1, CLC yüksek bağlanma eğilimi sağlayan sorLA kompleksin, ve hücreler çözülebilir ligandlan CLF-1 ve CLC sorLA salgılayan : CLF-1 hızla alınır ve içselleştirilmiş olan. CNTFRα ve sorLA birlikte ifade eden hücrelerde, CNTFRα ilk CLC bağlanır: CLF 1 oluşturulması içinmembrana bağlı trimerik kompleksi, ama aynı zamanda CLF-1 serbest sorLA bağlanma sitesi aracılığı ile sorLA bağlanır. Bunun bir sonucu olarak, kendi başına endositoz için yer bulunmamaktadır CNTFRα, birlikte asıldı ve CLC sorLA dolayımlı endositoz tarafından içselleştirilir: CLF-1.
Mevcut protokol) sorLA aracılı ve CLC i göstermek için kullanılan deneysel prosedürleri açıklar: Yüzey membran CNTFRα ifade CLF-1-bağımlı infekte; ii) endositoz ve CNTFRα hedefleme lızozomal sorLA aracılı; ve iii) CLC indirdi hücresel yanıt: CNTFRα of sorLA aracılı baskılanması üzerine CLF-1-stimülasyon.
Introduction
CLF-1: 1-3 CLC ve CLF-1 heterodimerik sitokin CLC iki alt oluşturmaktadır. hücresel sinyal indüksiyonu için CLC: CLF-1 ilk defa hedef CNTFRα, birincil ve GPI bağlantılı alıcı, bir zara-bağlı trimerik kompleksi oluşturmak üzere. CLC: CLF 1: CNTFRα kompleksi, daha sonra acemi transmembran Janus Kinaz / Sinyal transformatörleri ve transkripsiyon 3 (JAK / STAT3) yolunun 4 aktifleştiriciler ile sinyal aracılık gp130 / LIFRβ. Üç alt birimlerin herhangi bir eksik farelerde bir ekran ve aynı fenotipe nedeniyle yüz nöronlar ve yetersiz emme 5-8 sayısı azaltılmış doğumdan sonraki 24 saat içinde ölür. İnsanlarda bulgular aynı şekilde üç alt birimden işlevsel tutarlılığını vurgulamaktadır. Bu nedenle, insan mutasyon (homozigot ya da bileşik) CLC neden bozukluğu: CLF-1 ya da CNTFRα adlandırılan soğuk bağlı terleme / Crisponi sendromu tüm sonuç, örneğin impai gibi semptomlarla karakterize bir durumunKırmızı emme ve yutma, çeşitli dismorfik özellikleri, sıcaklık yükselmeleri ve paradoksal ve düşük sıcaklıklarda 9-11 terleme serpmek.
İn vitro olarak, CLC ve CNTFRα kombinasyonu gerekli ve gp130 / LIFRβ ile etkileşim ve hücreler 12 sinyal uyarılması için yeterli hem de. Öte yandan CLF-1 rolü daha az açıktır. Doğrudan sinyal dahil değildir ve özellikle uzun CLC 1'in selüler salgılanmasını kolaylaştırmak için hizmet eden bir ek olarak kabul edilmiştir. Ancak, yeni bulgular CLF-1 sinyalizasyon ve CLC ve CNTFRα ciro hem karıştığı ek ve daha önemli fonksiyonları olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CLF 1 üç bağımsız bağlayıcı bölge içeren görünür: bir tane onun CLC bağlanabilen bilinen; CNTFRα doğrudan bağlanma aracılık on; ve endositik reseptörü sorLA ile etkileşim için üçüncü (yüksek afinite) alan. CLC ve CLF-1 hem de görünüyor & # olarak160; CLC daha çok daha düşük bir afinite ile CNTFRα hedef: CLF-1 kompleksi (ve buna CNTFRα bağlanma bölgesi ile) CLF 1 CLC ve CNTFRα birleşmesini teşvik eder ve bu şekilde 13 sinyal kolaylaştırdığı düşünülebilir.
sorLA ile CLF-1'in etkileşim, mevcut sunumun ana sorunu, tamamen farklı bir rol oynar. SorLA Vps10p alan reseptör ailesine 14 oluşturan beş tip 1 reseptör biridir. Bu çeşitli dokularda değil, beyin ve sinir doku 15, özellikle de ifade edilir. Diğer aile üyeleri benzer sorLA Vps10p-bağlama alanı, bir N-terminal ligand taşıyan, fakat ek olarak, aynı zamanda, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ailesinin 15 üyelerinde bulunan ligand bağlama elemanları da dahil olmak üzere diğer alan türleri içerir. Sitoplazmik kuyruk çok bağdaştırıcı proteinleri, örneğin, adaptör protein-1 ve -2 ve sorLA etkileşim etkin endocytos taşırolduğu gibi bağlı proteinlerin 16-18 hücre içi sıralama ve ulaşım. Vps10p-etki CLF-1 (ama özellikle, CLC değil) 13 dahil ilgisiz ligandlar bir dizi bağlayan büyük bir on-bıçaklı β-pervane 19,20 içerir. CLF-1 bağlama sahası erişilebilir sonra bile sorLA sadece bağlanan demektir CLC ve CNTFRα ile kompleks oluşumu serbest CLF-1, aynı zamanda CLC: CLF-1 ve trimerik kompleks CLC: CLF 1: CNTFRα 13. SorLA CLF-1 ve CLC hızlı endositoz taşır: CLF-1, ama CNTFRα bir GPI-eki yüzey membrana sabit ise, bu çözünür proteinler bulunmaktadır. / Ve CLF-1:: CNTFRα sorLA tüm karmaşık içselleştirmesi için izin verir ve böylece CNTFRα yüzey membran ifade (CLF-1 sinyal indüksiyon ve CLC sonra hücresel duyarlılık) değiştirmek için soru CLC nedenle eğer bağlayıcıdır veya CNTFRα cirosu.
Bu tarif edilen deneylerRaporda aşağıdaki soruları açıklığa kavuşturmak için dizayn edilmiştir:
sorLA CLC arabuluculuk mu: Yüzey-membran CNTFRα CLF-1-bağımlı downregülasyonun? Bu açıklığa kavuşturmak için, ilk olarak, 21 de tarif edildiği gibi metabolik etiketleme ve darbe kovalayıcı deneyler vasıtasıyla (ve yokluğunda sorLA varlığında) CNTFRα ciro belirlenmeye çalışılmıştır. Bununla birlikte, CNTFRα [S 35] sistein bir karışımının ve [S 35] metionin radyoaktivite zayıf birleşme gösterdi etiket çalışır. Bu büyük olasılıkla reseptörlerinin ani ve önemli kaybını telafi etmek mümkün olacağını yeni sentez çok düşük derecede önerdi. CLC aracılığıyla birbirine zaman CNTFRα downregüle olup olmadığını belirlemek için: CLF-1 sorLA nedeniyle, bu nedenle sadece öncesi ve CLC maruz kaldıktan sonra (Batı blot kullanarak) CNTFRα toplam hücresel havuzu ölçmek için karar verildi: CLF-1 - ve sonuçları karşılaştırmak için hücreler transfekte edilmiş veya transfekte edilmiş değilsorLA.
sorLA lızozomlara CNTFRα hedef mu? Bu soruyu, CNTFRα lokalizasyonu cevaplamak için - kendi CLC yoluyla içselleştirilmiş: sorLA bağlanmasını CLF-1 aracılı - immünsitokimya kullanılarak incelenmiştir ve CNTFRα yönelik antikorlar ve geç endosome / lizozom işaretleyici Lizozomal ilişkili Membran Protein 1 ile etiketleme (LAMP-1). Deney lizozomal enzimlerin inhibitörleri ile tedavi edilmemiş hem de tedavi edilen hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. fikri CNTFRα lizozomlarda bozulmuş olup olmadığını muamele edilmemiş hücreler CNTFRα için çok az veya hiç leke bırakmazlar olur ise, enzim inhibitörleri ile tedavi edilen hücreler, lamba-1 pozitif veziküllerinde biriken CNTFRα lekelenmeyi mevcut olacağını tabii ki.
CLF-1 stimülasyonu: CNTFRα downregülasyonun CLC hücresel cevabı düşürmek mu? JAK / STAT3 kullanılarak gp130 / LIFRβ heterodimeri ile CLC, CLF-1 ve CNTFRα sinyallerinin oluşan trimerik kompleksipatika. Buna göre, hücrelerin kapasitesi CLC cevap: CNTFRα baskılanması üzerine CLF-1 sinyal Western Blot algılama ve sorLA transfektanlarında fosfo-STAT3 (pSTAT3) / toplam STAT3 seviyesinin ölçülmesi tarafından araştırılmıştır.
Protocol
CNTFRα Lisatlar 1. Western Blot
- Tam uzunlukta sorLA ve myc-etiketli CNTFRα insan embriyonik böbrek yapıları ifade pcDNA3.1 / Zeo kullanılarak 293 (HEK293) hücreleri (-) ve pcDNA3.1 / hyg (-), sırasıyla. konstruktları imalatçının protokolüne göre, ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu. 150 ug / ml Zeosin ve / ya da 500 ug / ml Higromisin B Gold 13 ihtiva eden ortam içinde kararlı klonlar seçilebilir.
- HEK293 Tohum eşit sayıda eksprese eden CNTFRα-myc ve transfektanları birlikte ifade Eagle's Ortamı (DMEM) Modifiye Dulbecco hücreleri,% 10 fetal ile takviye Şekil 1. Kültür gösterildiği gibi, iki 4-yuvalı plakalar içinde CNTFRα-myc / sorLA sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 37 ° C'de bir% 5 karbon dioksit kuluçka makinesi içinde 100 ug / ml streptomisin (tam ortam).
- % 80 birleşen - hücreleri 50 kadar bekleyin.
- orta çıkarınWells, Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile bir kez yıkanır ve ya da (kontrol), 10 nM CLC olmayan, taze tam ortam ekleyin: CLF-1, Şekil 1 'de gösterildiği gibi. 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- inkübasyondan 0 ve 5 saat sonra ortam yeniden elde etmek ve 1.5 ml tüpler içinde 4 ° C'de saklayın. Daha sonra her bir oyuğa proteinaz inhibitör kokteyli (1 dakika, 4 ° C) ile takviye edilmiş,% 1 Triton X-100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) ilave edilir. Daha sonra, 1.5 ml tüpler (4 ° C) hücre lizatları aktarın.
- orta ve hücre lizatı (3000 xg, 3 dakika, 4 ˚C) içeren tüpler Spin ve 1.5 mL tüpler (4 ˚C) süpernatantlar aktarın. pelet atın. Yeni 1.5 mL tüpler her hücre lisatı süpernatant transferi 5 uL - daha sonra protein içeriğini ölçmek için bunları kullanmak (1.7 adım). Hemen tüm süpernatanlanna indirgeyici olmayan LDS numune tampon ekleyin ve örnekleri girdap.
- Prot ölçmek için 5 uL'lik kullanınimalatçının protokolüne göre, ticari bir protein deneyini kullanarak hücre lisatı süpernatanlarında ein içeriği.
- 5 dakika boyunca 95 ° C'de numune ısıtın.
- (5 13 lekeleme SDS-PAGE 13 azaltma ve Western her numune proteinin eşit tutar, ve anti-sorLA 16 tavşan kullanılarak ortam içinde ve hücre lizatları içinde sorLA, β-aktin ve CNTFRα-Myc içeriğini görselleştirmek ug / ml), fare anti-β-aktin (0.4 ug / mL) ve fare anti-myc (1 ug / ml) antikorlar ve uygun HRP-bağlı sekonder antikor (1: 2000).
- üreticinin protokolüne uygun olarak yoğunluk ile bantlar sayısal olarak.
Lizozomal inhibitörleri ile kombinasyon halinde 2. İmmünositokimya
- Şekil 2'de gösterildiği gibi tohum HEK293 hücreleri, bir 4-plaka kapaklı lam üzerinde CNTFRα-myc / sorLA ile transfekte edildi. Kültür, yukarıda tam ortam içinde hücreler.
- % 40 - hücre izdiham 20 kadar bekleyin.
- Kuyulardan Ortamı çıkarın ve Şekil 2'de gösterildiği gibi olan veya leupeptin, 50 ug / mL olmayan ve hücrelere pepstatin A (Leu / PEP) (inhibe lizozomal hidrolazlar) tam orta ekleyin. 37 ° C'de inkübe hücreleri. Orta inkübasyon takip eden 24 saat boyunca her 6 saatte bir değiştirilmelidir.
- inkübasyon 24 saat sonra, bir kez daha (ley / moral ile veya olmadan) orta yerine ve bu kez 10 nM CLC ekleyin: CLF-1. 5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- PBS içinde bir kez hücreler yıkanır ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid, pH 7 içinde tespit edin.
Dikkat: Paraformaldehyde Deri, göz ve mukoza ile temasından kaçının, son derece toksiktir. Eldiven ve koruyucu gözlük yıpranmış ve çözüm davlumbaz içine yapılmalıdır. - PBS içinde bir kez hücreler yıkanır ve PBS içinde seyreltilmiş saponin içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (% 0,5 saponin) hücreleri geçirgenliği.
- keçi anti-CNTFRα seyreltilir (1 ug / mL) (özellikleolmayan fare anti-myc,% 0.5 saponin içinde Western blotting) ve fare anti-LAMP-1 (15 ug / ml) antikorlar kullanılabilir ve oda sıcaklığında 2 saat için antikorların hücreler inkübe edin.
- % 0.5 saponin hücreler 4X (5 dakika) yıkanır ve eşek anti-keçi Alexa 488- ve eşek anti-fare Alexa 568-konjuge sekonder antikor (6 ug / ml), oda sıcaklığında 2 saat boyunca kuluçkaya bırakılır.
- iki kez iyonu giderilmiş su (1 dakika),% 0.5 saponin hücreler 4X (5 dakika) yıkanır, montaj ortamı kullanılarak mikroskop lamları üzerinde kapağı montaj slaydları.
- 63X Cı-Apochromat suya daldırma objektif, NA 1.2 olan bir lazer konfokal tarama mikroskobu kullanılarak konfokal mikroskobu ile hücrelerin antikor lekelemesi analiz edin.
pSTAT3 Seviye 3. Western Blot algılama
- Şekil 3'te gösterildiği gibi, 4-plaka (CNTFRα endojen seviyelerini ifade) Tohum HEK293-sorLA hücreleri. Kültür, yukarıda tam ortam içinde hücreler.
- kadar bekleyin% 80 birleşen - hücreleri 50 vardır.
- Kuyulardan orta çıkarın PBS içinde bir kez yıkayın ve nM CLC veya 10 olmayan, taze tam ortam ekleyin: CLF-1 hücreleri, Şekil 3'te gösterildiği gibi. 5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- , Orta çıkarın katkısız DMEM hücreler iki kez yıkayın (boş ortam, FBS ve antibiyotiksiz) ve boş bir ortam içinde 90 dakika boyunca (37 ° C) hücreler reincubate.
- Şekil 3'te gösterildiği gibi (STAT3 fosforilasyonunu başlatmak için) CLF-1: Bir kez daha, orta kaldırmak ile ya da 5 nM CLC olmayan taze bir boş ortam ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Hızlı bir şekilde (1 dakika, 4 ° C) proteinaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü ile takviye edilmiş,% 1 Triton X-100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 8.0) eklenerek hücreler orta kaldırmak ve lize her kuyuya kokteyl. Daha sonra, 1.5 ml tüpler (4 ° C) hücre lizatları aktarın.
- Transferi 5 uL of yeni 1.5 ml tüpler her süpernatant - (3.8 adım) daha sonra protein içeriğini ölçmek için kullanabilirsiniz. Hemen tüm süpernatanlanna indirgeyici olmayan LDS numune tampon ekleyin ve örnekleri girdap.
- imalatçının protokolüne göre, ticari bir protein deneyini kullanarak 5 uL alikot protein içeriğini ölçmek.
- artık yapışkan (yaklaşık 1 dakika) ve daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtmak kadar oda sıcaklığında her bir örnek sonikasyon.
- SDS-PAGE ve Batı 13 13 kurutma, her numunenin protein eşit tutar, ve tavşan anti-pSTAT3 (1: 2000) kullanılarak hücre lizatları içinde pSTAT3 içeriğini toplam STAT3 görselleştirmek, anti-STAT3 ve fare (1: 1000 ) antikorları ve uygun HRP-bağlı fare ve tavşan sekonder antikor (1: 2000).
- üreticinin protokolüne uygun olarak yoğunluk ile bantlar sayısal olarak.
Representative Results
Şekil 1, hücre ekim CLC şematik olarak gösterilmektedir: Protokol 2 Şekil 3'te CLF 1 İnkübasyon: protokolünde CLF 1 inkübasyon 1. Şekil 2, hücre tohumlama ve Leu / PEP CLC şematik bir temsilini göstermektedir sorLA aracılı CLC protokolü 3. Şekil 4'te CLF 1 inkübasyon ve stimülasyon gösterir: hücre ekim CLC şematik bir temsilini göstermektedir CNTFRα CLF-1 bağımlı baskılanması. Şekil 5, CNTFRα hedeflenmesi sorLA aracılı endositoz ve lizozomal gösterir. CNTFRα baskılanması sonra CLF-1 stimülasyonu: Şekil 6 CLC alt tepki gösterir.
CNTFRα-Myc baskılanması sorLA transfektanlarında zayıf bant afte ile gösterilir ise CNTFRα-myc anlamına grupları, sıfır zamanında içindeki yoğunluğu NotR5, H (Şekil 4). Şekil 5, CNTFRα-myc leu / PEP muamele edilmiş hücrelerin LAMP-1 pozitif veziküllerinde birikmiş göstermektedir. Bunun aksine, CNTFRα-Myc birikmesi leu / PEP muameleye tabi hücrelerde görülmektedir. Bu CNTFRα-Myc lizozomlar sıralanır ve bozulmuş olduğunu göstermektedir. CLF-1: Şekil 6'da görülebileceği gibi, CLC maruz edilmemiştir hücrelerde seviyesine kıyasla, pSTAT3 seviyesinin önemli ölçüde önceden uyarılmış hücrelerde azaltılır. Bu ön-uyarılmış hücrelerde CNTFRα gözlenen sorLA aracılı ile aşağı doğru düzenleme (Şekil 4) ile uyumludur.
Şekil 1: İki 4- protokolde CLF-1 inkübasyon 1. Tohum HEK293-CNTFRα-Myc ve HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA hücreleri: hücre tohumlama ve CLC şematik gösterimigözlü levhalar (0 ile 5 saat) ve CLC kuluçkaya bırakılır: CLF 1 belirtildiği gibi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre tohumlama ve ley / moral ve şematik gösterimi CLC: CLF-1, 4-plaka kapak slaytlar üzerinde protokol 2. Tohum HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA hücrelerinde kuluçka ile veya leu olmadan hücreleri inkübe / moral ve CLC: CLF-1 belirtildiği gibi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: hücre tohumlama ve CLC şematik gösterimi: Bir 4 plaka protokol 3. Tohum HEK293-sorLA hücrelerinde CLF inkübasyon ve stimülasyon ile veya CLC olmadan hücreleri inkübe: (. öncesi exp) CLF-1 downregülasyon belirtildiği gibi STAT3 fosforilasyon başlatmak için CLF-1 stimülasyonu (stim.): CNTFRα CLC izledi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: SorLA aracılık ettiğini gösteren Sonuçlar CLC: CNTFRα CLF-1-bağımlı downregülasyonun. (A), HEK293-CNTFRα-myc, ve (B) HEK293-CNTFRα-myc / sorLA hücrelerinin yokluğunda, 10 nM CLC (beyaz sütunlar) ya da bulunduğu halde (gri sütunlar) içinde enkübe edilmiştir: CLF-1. 0 sonra ve5H, inkübasyon durdurulmuş ve orta (M) CNTFRα-Myc içeriği ve hücre lizatları içinde (I) Western blot ile tespit edildi ve densitometri ile nicelleştirilmiştir. Üst panel Örnek deneylerden elde edilen Western blot sonuçları gösterir ve alt paneller hücre lizatlarında bulunan CNTFRα-Myc tespit edilen düzeyleri göstermektedir. düzeyleri 0 saatte tek ve çift transfektanlarında CNTFRα-myc seviyesine göre gösterilmiştir. Her bir sütun, ortalama ± SEM temsil eder (n = 3). P-değerleri t-testi kullanılarak hesaplanır. Orijinal şekil 13 sonra çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:SorLA endositoz ve CNTFRα hedefleme lızozomal aracılık ettiğini gösteren sonuçları. HEK293-CNTFRα-myc / sorLA hücreler 10 nM CLC inkübe, veya leu / PEP olmadan muamele edilmiştir: protokolde tarif edildiği gibi CLF-1, 5 saat boyunca, anti-CNTFRα ve anti lambalı-1 antikorları ile tespit ve son olarak da lekeli 2. Ölçek çubukları: 5 mikron. Orijinal şekil 13 sonra çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: CLF-1 stimülasyonu: CNTFRα bölgesinin SorLA aracılı baskılanması CLC için alçaltılmış bir hücresel yanıt eşlik eder.
HEK293-sorLA hücreleri ya da yokluğunda, 10 nM CLC varlığında önceden kuluçkalanmıştır: (. Ön exp), 5 saat boyunca CLF-1, Blan mahrum bırakılırK, 90 dakika orta ve 5 nM CLC ile stimüle: (. STIM) CLF-1 15 dakika karıştırıldı. (Sol) sütun hücrelerinde pSTAT3 göreli düzeylerini göstermektedir. CLF 1, ancak CLC ile stimüle: CLF 1 her sütun CLC yokluğunda ön-inkübe hücrelerde pSTAT3 seviyeye (N = 3) göre ortalama ± SEM temsil eder. t-testi kullanılarak hesaplanır p-değeri. (Sağ) Batı beneği, temsili bir deneyden elde edilen pSTAT3 ve STAT3 tepki gösterir. Orijinal şekil 13 sonra çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada açıklanan protokol sorLA aracılı CLC göstermek için özel olarak kullanılabilir: CLF-1 bağımlı baskılanması ve CNTFRα hedeflenmesi lızozomal yanı sıra CLC eşlik eden zayıflatılmış karşılık: CLF-1 stimülasyonu.
Onlar, CNTFRα ve sorLA sadece küçük bir endojen ifade var ekspres gp130 / LIFRβ, transferinde kolay ve immünsitokimya uygundur büyük bir hücre gövdesi, sahip olduğu HEK293 hücre hattı, bu protokol için çok uygundur. Ancak, teorik olarak benzer özelliklere sahip herhangi bir hücre hattı da çalışır.
protokol iki kritik adımlar vardır. Birincisi leu / PEP ortamı 24 saat boyunca, yaklaşık her 6 saatte bir değiştirilmelidir ki 2.3, aşama. Aksi takdirde, aktif lizozomal enzimleri ve daha az veya lizozomlar protein tespit edilebilir bir birikmesine neden olabilir. ikinci kritik aşama (3.4) CLC ile ön kuluçkaya yatırıldıktan sonra da yıkama ilgilidir: CLF-1. Bu imnem li bağlanmamış ligandı çıkarmak için, ve hücreler zaman katkısız DMEM (boş ortam) (devamı stimülasyonu kaçınarak) kurtarmak için izin vermek. CLF-1 (adım 3.5): Bu CLC ile müteakip tekrar uyarma sırasında pSTAT3 düşük arka plan düzeyi sağlayacaktır.
Özellikle, Şekil 6, hücresel yanıtı (pSTAT3) CNTFRα bölgesinin sorLA aracılı baskılanması paralel olarak azaldığı gösterilmiştir. Azaltılmış tepki CNTFRα havuzun bir azalma (ve üzerine beklenen) uyarınca olmasına rağmen, düşük CNTFRα ifade tek başına azalmış hücresel yanıt hesapları olduğunu ispat olmadığını, ancak vurgulanmalıdır. Böylece, bu değişiklikler - Ön stimülasyon veya transfeksiyon kaynaklanan - akış yukarı pSTAT3 için sinyal yolunun işlevsel elemanlarının bir değişmiş yanıta katkıda bulunmuş olabilir.
protokol temel kavramı bu particu sınırlı değildirlar reseptör sistemi. (. Örneğin, bir başka hücre hattı, diğer antikorlar ile, başka ligandlar, vs.) - bağımsız sorLA's tutulum protokolünü değiştirerek bunun yanı sıra, diğer reseptörlere ligand bağlı infekte belirlemek için kullanılabilir. Ancak, Western blotting ile reseptör baskılanması analizi esas olarak örneğin, reseptör, yavaş ciro ve uyarılmamış hücrelerde yeni sentez düşük derecesi sergilerler ve GPI-ankorlu reseptörleri için uygun olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, yeni sentez yüksek seviyede gösteren reseptörleri, ligand-bağlı baskılanması yeni reseptörler sentezi ile telafi edilebilir. 21 'de tanımlanan, bu koşullar altında, reseptör havuz baskılanması yerine metabolik etiketleme ve darbe kovalayıcı deneyler ile belirlenebilir. Seçenek olarak ise, reseptör ile karışmaz iyotlanmış antikorlar (tercihen Fc fragmanları) "etiket" RECEPT ekto için kullanılabilir bağlanmaya ve beklenen baskılanması daha sonra hücre peleti ve ortamın radyoaktif sayımı ile tespit edilebilir.
Lojistik nedenlerle bir CNTFRα ile hücreleri myc-etiketi taşıyan yapı transfekte ve mevcut protokol, bir fare anti-myc antikoru reseptörün Western blot algılama için kullanılmıştır. Bunun aksine, bir keçi anti-CNTFRα antikoru LAMP-1, bir fare antikoru ile tespit edildiği gibi, bağışıklık kimyası ve çift etiketleme için kullanıldı - ve tabii ki sekonder antikor ile spesifik olmayan (çakışan) boyama neden olur, iki primer fare antikorları kullanır. keçi anti-CNTFRα aynı zamanda (gösterilmemiş olan) Western blotlama çalışır, çünkü protokolü kolaylıkla değiştirilebilir ve etiketsiz CNTFRα ile transfekte edilmiş hücrelerin de uygulanabilir olduğunu not edin.
Yüksek afiniteli 22 CLF-1: Son olarak, son zamanlarda, aynı zamanda endositik reseptör sortilin CLC bağlandığı gösterilmiştir. Bu nedenle, bu akla bu sortilin gibi olduğusorLA CLC için ara bağlantılar: CLF-1 ile CNTFRα endositoz ve de CNTFRα hedefleme lızozomal aracılık edebilir. yerine sorLA ve sortilin kullanarak, mevcut protokol bu soruyu netleştirmek için kullanılabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
