Summary
Den nuværende protokol beskriver, hvordan Western blotting og immuncytokemi kombineret med hæmning af lysosomale enzymer kan bruges til at demonstrere nedregulering af ciliarneurotrofiske Factor receptor-α (CNTFRa), der transporteres af samspillet mellem Cytokine-lignende faktor-1 (CLF-1 ) og den endocytiske receptor sorLA.
Abstract
Det heterodimere cytokin cardiotrophin-lignende Cytokine: Cytokin-lignende faktor-1 (CLC: CLF-1) er rettet mod glycosylphosphatidylinositol (GPI) -forankret CNTFRa for at danne et trimert kompleks, der efterfølgende rekrutter glycoprotein 130 / leukæmi inhibitorisk faktor receptor-β (gp130 / LIFRβ) til signalering. Både CLC og CNTFRa er nødvendige til signalering men hidtil CLF-1 har kun været kendt som en formodet formidler af CLC sekretion. Men er det for nylig blevet vist, at CLF-1 indeholder tre bindingssteder: en for CLC; én for CNTFRa (som kan fremme samling af trimere kompleks); og et for endocytiske receptor sorLA. Sidstnævnte site giver højaffinitetsbinding af CLF-1, CLC: CLF-1, såvel som det trimere (CLC: CLF-1: CNTFRa) kompleks til sorLA, og i sorLA-udtrykkende celler de opløselige ligander CLF-1 og CLC : CLF-1 hurtigt taget op og internaliseret. I celler co-udtrykkende CNTFRa og sorLA, CNTFRa først binder CLC: CLF-1 til dannelse afen membran-associeret trimert kompleks, men det forbinder også til sorLA via gratis sorLA-bindingssted i CLF-1. Som et resultat, CNTFRa, der har ikke plads til endocytose på sin egen, er trak sammen og internaliseret af sorLA endocytose af CLC: CLF-1.
Den nuværende protokol beskriver de eksperimentelle procedurer, der anvendes til at demonstrere i) sorLA-medierede og CLC: CLF-1-afhængige nedregulering af overfladen-membran CNTFRa udtryk; ii) sorLA endocytose og lysosomal målretning af CNTFRa; og iii) den sænkede cellulære respons på CLC: CLF-1-stimulation ved sorLA-medieret nedregulering af CNTFRa.
Introduction
CLC og CLF-1 udgør de to underenheder af det heterodimere cytokin CLC: CLF-1 1-3. For cellulær signal induktion, CLC: CLF-1 første mål for CNTFRa, dens primære og GPI-forankret receptor, at danne en membran-bundne trimert kompleks. CLC: CLF-1: CNTFRa kompleks efterfølgende rekrutterer gp130 / LIFRβ der formidler transmembrane signalering via Janus-kinase / Signal transducere og aktivatorer af transskription 3 (JAK / STAT3) vej 4. Mus mangelfuld i nogen af de tre subunits viser en og samme fænotype og dør inden 24 timer efter fødslen på grund af et reduceret antal facial neuroner og utilstrækkelig diegivning 5-8. Resultaterne i mennesker ligeledes understrege funktionelle sammenhæng i de tre subunits. Således menneskelige mutationer (homozygote eller sammensatte) forårsager dysfunktion af CLC: CLF-1 eller CNTFRa, alle resultere i den såkaldte kolde-induceret svedtendens / Crisponi syndrom, en tilstand karakteriseret ved symptomer såsom impairød diegivning og synke, diverse dysmorfe funktioner, temperatur pigge, og paradoksalt og perfundere sveden ved lave temperaturer 9-11.
In vitro, kombinationen af CLC og CNTFRa er både nødvendige og tilstrækkelige for interaktion med gp130 / LIFRβ og induktionen af signalering i celler 12. Rolle CLF-1 på den anden side er mindre klar. Det er ikke direkte involveret i signalering, og har længe været betragtet som et appendiks, der primært tjener til at lette den cellulære sekretion af CLC 1. De seneste resultater viser, at CLF-1 har yderligere og mere vigtige funktioner implicerer både signal- og omsætning af CLC og CNTFRa. Det fremgår således, at CLF-1 indeholder tre uafhængige bindingssteder: en for sin velkendte binding til CLC; en, der medierer direkte binding til CNTFRa; og en tredje (høj affinitet) site for interaktion med endocytiske receptor sorLA. Som både CLC og CLF-1 synes & #160; at målrette CNTFRa med en betydelig lavere affinitet end CLC: CLF-1-kompleks, er det tænkeligt, at CLF-1 (via dets CNTFRa-bindingssted) fremmer forening CLC og CNTFRa og letter dermed signalering 13.
CLF-1 samspil med sorLA, det vigtigste spørgsmål af den nuværende præsentation, spiller en helt anden rolle. SorLA er en af de fem type 1 receptorer, der udgør Vps10p-domænet receptorfamilie 14. Det udtrykkes i en række væv, men navnlig i hjernen og neuronale væv 15. Svarende til de andre familiemedlemmer sorLA bærer en N-terminal ligand-binding Vps10p-domæne, men derudover den omfatter også andre domæne typer, herunder ligandbindende elementer, der findes i medlemmer af low-density lipoprotein receptor familie 15. Dens cytoplasmatiske hale interagerer med flere adapter proteiner, f.eks adapter protein-1 og -2, og sorLA formidler effektive endocytoser samt intracellulær sortering og transport af bundne proteiner 16-18. Den Vps10p-domænet består af en stor ti-bladet β-propel 19,20, der binder en række uafhængige ligander, herunder CLF-1 (men især, ikke CLC) 13. Bindingsstedet i CLF-1 er tilgængelig, selv efter kompleksdannelse med CLC og CNTFRa hvilket betyder, at sorLA binder ikke kun gratis CLF-1, men også CLC: CLF-1 og det trimere kompleks CLC: CLF-1: CNTFRa 13. SorLA formidler hurtig endocytose af CLF-1 og CLC: CLF-1, men disse er opløselige proteiner henviser CNTFRa er fastgjort til overfladen membran ved et GPI-anker. Spørgsmålet er derfor, om binding af CLC: CLF-1: CNTFRa tillader sorLA at internalisere hele komplekset og derved ændre overfladen-membran udtryk for CNTFRa (og den efterfølgende cellulære modtagelighed for CLC: CLF-1 signal induktion), og / eller omsætning CNTFRa.
Forsøgene beskrevet i den foreliggenderapport var designet til at afklare følgende spørgsmål:
Er sorLA mægle CLC: CLF-1-afhængige nedregulering af overfladen-membran CNTFRa? For at afklare dette, blev det i første omgang forsøgte at bestemme omsætningen af CNTFRa (i fravær og tilstedeværelse af sorLA) ved hjælp af metaboliske mærkning og pulse-chase eksperimenter som beskrevet i 21. Men forsøg på at mærke CNTFRa anvendelse af en blanding af [S 35] cystein og [S 35] methionin viste dårlig inkorporering af radioaktivitet. Dette antydede en meget lav grad af nye syntese, som efter al sandsynlighed vil være i stand til at kompensere for en pludselig og betydelig tab af receptorer. At afgøre, om CNTFRa blev nedreguleret, når forbundet med hinanden via CLC: CLF-1 til sorLA, blev det derfor besluttet blot at måle (ved hjælp af Western blotting) det samlede cellulære pulje af CNTFRa før og efter udsættelse for CLC: CLF-1 - og at sammenligne resultater i celler transficeret eller ej transficeret medsorLA.
Er sorLA målrette CNTFRa til lysosomer? For at besvare dette spørgsmål, lokalisering af CNTFRa - internaliseret via sin CLC: CLF-1-medieret binding til sorLA - blev undersøgt ved hjælp af immunocytokemi, og mærkning med antistoffer rettet mod CNTFRa og sene-endosomet / lysosomer markør Lysosomal-associerede Membrane Protein 1 (LAMP-1). Forsøget blev udført på celler behandlet samt ubehandlet med inhibitorer af lysosomale enzymer. Ideen var jo, at hvis CNTFRa blev nedbrudt i lysosomer, ville celler behandlet med enzym-hæmmere præsentere CNTFRa-farvning akkumulere i LAMP-1-positive vesikler, mens ubehandlede celler ville vise lidt eller ingen farvning for CNTFRa.
Er CNTFRa nedregulering sænke den cellulære respons på CLC: CLF-1 stimulation? Det trimere kompleks bestående af CLC, CLF-1, og CNTFRa signaler via gp130 / LIFRβ heterodimer hjælp af JAK / STAT3pathway. Følgelig kapaciteten af celler reagerer på CLC: CLF-1-signalering ved nedregulering af CNTFRa blev udforsket ved Western blot-påvisning og kvantificering af phospho-STAT3 (pSTAT3) / total STAT3 niveau i sorLA transfektanter.
Protocol
1. Western blotting af CNTFRa Lysater
- Hurtig fuldlængde sorLA og Myc-tagget CNTFRa konstruktioner i humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler under anvendelse af pcDNA3.1 / Zeo (-) og pcDNA3.1 / Hyg (-), henholdsvis. Transficere HEK293-celler med konstruktionerne under anvendelse af et kommercielt transfektionsreagens ifølge producentgaranti protokol. Vælg stabile kloner i medium indeholdende 150 ug / ml Zeocin og / eller 500 pg / ml hygromycin B Gold 13.
- Seed lige mange HEK293 transfektanterne udtrykker enten CNTFRa-Myc eller co-udtrykker CNTFRa-Myc / sorLA i to 4-brønds plader som vist i figur 1. Kultur cellerne i Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (fuld medium) i en 5% carbondioxid-inkubator ved 37 ° C.
- Vent cellerne er 50-80% sammenflydende.
- Fjern mediet frabrønde, vaske en gang med Dulbecco phosphatbufret saltvand (DPBS), og der tilsættes frisk fuld medium med eller uden (kontrol) 10 nM CLC: CLF-1 som angivet i figur 1. Inkuber cellerne ved 37 ° C.
- Efter 0 og 5 timers inkubation, genvinde mellemlang og opbevar det ved 4 ˚C i 1,5 ml rør. Derefter tilsættes 1% Triton X-100 lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 8,0) suppleret med en proteinaseinhibitor cocktail til hver brønd (1 min, 4 C). Efterfølgende overføre cellelysaterne til 1,5 ml rør (4 C).
- Spin rør, der indeholder mediet og cellelysatet (3000 xg, 3 min, 4 ˚C) og overføre supernatanterne til 1,5 ml rør (4 c). Kassér pelleten. Overfør 5 pi af hver cellelysat supernatanten til nye 1,5-ml rør - bruge dem til at måle proteinindholdet senere (trin 1.7). Straks, tilføje reducerende LDS prøvebuffer til alle supernatanterne og vortex prøverne.
- Brug 5 pi prøver til måling af protEin indhold i cellelysatet supernatanter under anvendelse af et kommercielt protein-assay ifølge producentens protokol.
- Opvarm prøverne ved 95 C i 5 min.
- Underkaste en tilsvarende mængde protein fra hver prøve til reducerende SDS-PAGE 13 og Western blotting 13 og visualisere indholdet af sorLA, β-actin, og CNTFRa-Myc i mediet og i cellelysaterne under anvendelse af kanin-anti-sorLA 16 (5 ug / ml), muse-anti-β-actin (0,4 pg / ml), og muse-anti-Myc (1 ug / ml) antistoffer og de passende HRP-koblede sekundære antistoffer (1: 2.000).
- Kvantificere de bånd ved densitometri ifølge producentens protokol.
2. Immuncytokemi i kombination med Lysosomal Inhibitors
- Seed HEK293-celler stabilt transficeret med CNTFRa-Myc / sorLA om dækslides i en 4-brønds plade som vist i figur 2. Dyrke cellerne i fuld medium som ovenfor.
- Vent indtil celle konfluens 20 - 40%.
- Fjern mediet fra brøndene og tilføj fuld medium med eller uden 50 ug / ml leupeptin og pepstatin A (leu / pep) (inhiberer lysosomale hydrolaser) til cellerne som angivet i figur 2. Inkuber cellerne ved 37 ° C. Mediet skal udskiftes hver 6. time i løbet af de følgende 24 timer inkubation.
- Efter 24 timers inkubation igen erstatte mediet (med eller uden leu / pep) og denne gang tilsættes 10 nM CLC: CLF-1. Inkuber cellerne ved 37 C i 5 timer.
- Vask cellerne en gang i PBS og fikseres i 4% paraformaldehyd, pH 7 i 15 minutter ved stuetemperatur.
Forsigtig: Paraformaldehyd er meget giftigt, undgå kontakt med hud, øjne og slimhinder. Handsker og sikkerhedsbriller skal bæres og løsninger lavet inde i en emhætte. - Vask cellerne en gang i PBS og permeabilisere cellerne i 5 minutter ved stuetemperatur i saponin fortyndet i PBS (0,5% saponin).
- Fortynd gede-anti-CNTFRa (1 ug / ml) (navnligikke muse-anti-Myc anvendt til Western blotting) og muse anti-LAMP-1 (15 ug / mL) antistoffer i 0,5% saponin og inkuberes cellerne med antistofferne i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask cellerne 4x (5 min) i 0,5% saponin og inkuberes cellerne med æsel-anti-gede-Alexa 488- og æsel-anti-muse Alexa 568-konjugerede sekundære antistoffer (6 ug / ml) i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask cellerne 4x (5 min) i 0,5% saponin, to gange i deioniseret vand (1 min), og montere dækslides på mikroskopglasplader med montering medier.
- Analyser antistof-farvning af cellerne ved konfokal mikroskopi under anvendelse af en laser-scanning konfokal mikroskop med en 63X C-Apochromat nedsænkning i vand mål, NA 1.2.
3. Western blot-påvisning af pSTAT3 Level
- Seed HEK293-sorLA celler (som udtrykker endogene niveauer af CNTFRa) i en 4-brønds plade som vist i figur 3. Dyrke cellerne i fuld medium som ovenfor.
- Vent tilceller udgør 50 - med 80% sammenflydende.
- Fjern mediet fra brøndene, vaskes en gang i PBS, og der tilsættes frisk fuld medium med eller uden 10 nM CLC: CLF-1 til cellerne som indikeret i figur 3. Inkuber cellerne ved 37 C i 5 timer.
- Fjern mediet, vask af cellerne to gange i usuppleret DMEM (blank medium; uden FBS og antibiotika), og derefter reincubate cellerne i 90 min (37 ° C) i tomme medium.
- Igen, fjern medium og tilsæt frisk blank medium med eller uden 5 nM CLC: CLF-1 (at initiere STAT3 phosphorylering) som angivet i figur 3. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C.
- Hurtigt at fjerne mediet og lysere cellerne (1 min, 4 C) ved tilsætning af 1% Triton X-100 lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 8,0) suppleret med en proteinase inhibitor cocktail og en phosphataseinhibitor cocktail til hver brønd. Efterfølgende overføre cellelysaterne til 1,5 ml rør (4 C).
- Transfer o 5 pif hver supernatant til nye 1,5 ml rør - bruge dem til at måle proteinindholdet senere (trin 3.8). Straks, tilføje reducerende LDS prøvebuffer til alle supernatanterne og vortex prøverne.
- Måle proteinindholdet i de 5 pi prøver under anvendelse af en kommerciel protein assay ifølge producentens protokol.
- Sonikeres hver prøve ved stuetemperatur, indtil de ikke længere er viskos (ca. 1 min) og efterfølgende varme dem ved 95 C i 5 min.
- Underkaste en tilsvarende mængde protein fra hver prøve til SDS-PAGE 13 og Western blotting 13 og visualisere indholdet af pSTAT3 og total STAT3 i cellelysaterne under anvendelse af kanin-anti-pSTAT3 (1: 2000) og muse-anti-STAT3 (1: 1,000 ) antistoffer og de passende HRP-koblet muse- og kanin sekundære antistoffer (1: 2.000).
- Kvantificere de bånd ved densitometri ifølge producentens protokol.
Representative Results
Figur 1 viser en skematisk fremstilling af cellepodning og CLC: CLF-1 inkubation i protokol 1. Figur 2 viser en skematisk fremstilling af cellepodning og leu / pep og CLC: CLF-1 inkubation i protokol 2. Figur 3 viser en skematisk repræsentation af cellepodning og CLC: CLF-1 inkubation og stimulering i protokol 3. Figur 4 viser sorLA-medierede CLC: CLF-1-afhængig nedregulering af CNTFRa. Figur 5 viser sorLA endocytose og lysosomal målretning af CNTFRa. Figur 6 viser den nedre reaktion på CLC: CLF-1-stimulering efter CNTFRa nedregulering.
Bemærk, at bands der betyder CNTFRa-Myc har lignende tæthed på tidspunkt nul, mens nedregulering af CNTFRa-Myc demonstreres ved svagere bånd i sorLA transfektanter afteR 5 timer (figur 4). Figur 5 viser, at CNTFRa-Myc er ophobet i LAMP-1-positive vesikler Leu / pep behandlede celler. I modsætning hertil er ingen akkumulering af CNTFRa-Myc set i celler ikke udsættes for leu / pep behandling. Dette viser, at CNTFRa-Myc er sorteret til lysosomer og nedbrudt. Som det kan ses i figur 6, er niveauet af pSTAT3 signifikant reduceret i præ-stimulerede celler sammenlignet med niveauet i celler, der ikke er udsat for CLC: CLF-1. Dette er i overensstemmelse med den observerede sorLA-medieret nedregulering af CNTFRa i de præ-stimulerede celler (figur 4).
Figur 1: Skematisk fremstilling af celle-såning og CLC: CLF-1 inkubation i protokol 1. Seed HEK293-CNTFRa-myc og HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler i to 4-brønds plader (0 og 5 h) og inkuberes celler med CLC: CLF-1 som indikeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk fremstilling af celle-såning og leu / pep og CLC: CLF-1 inkubation i protokol 2. Seed HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler på dækslides i en 4-brønds plade og inkuberes celler med eller uden leu / pep og CLC: CLF-1 som angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skematisk fremstilling af cellepodning og CLC: CLF inkubation og stimulering i protokol 3. Seed HEK293-sorLA celler i en 4-brønds plade og inkuberes celler med eller uden CLC: (. pre-exp) CLF-1 at nedregulere den CNTFRa efterfulgt af CLC: CLF-1-stimulering (. stim) at indlede STAT3 phosphorylering som angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Resultater viser, at SorLA medierer CLC: CLF-1-afhængige nedregulering af CNTFRa. (A) HEK293-CNTFRa-Myc og (B) HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler blev inkuberet i fravær (hvide søjler) eller nærvær (grå søjler) på 10 nM CLC: CLF-1. Efter 0 og5 timer blev inkubationen standses, og indholdet af CNTFRa-Myc i mediet (m) og i cellelysaterne (l) blev påvist ved Western-blotting og kvantificeret ved densitometri. De øvre paneler viser Western blot-resultater fra repræsentative eksperimenter og de nedre paneler viser de detekterede niveauer af CNTFRa-Myc fundet i cellelysaterne. Niveauerne er vist i forhold til den CNTFRa-Myc niveau i enkelt og dobbelt transfektanter ved 0 t. Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3). p-værdier beregnes under anvendelse af t-test. Gengivet efter oprindelige figur 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:Resultater viser, at SorLA medierer endocytose og lysosomal målretning af CNTFRa. HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler blev behandlet med eller uden leu / pep, inkuberet med 10 nM CLC: CLF-1 i 5 timer, fikseret, og endelig farves under anvendelse af anti-CNTFRa og anti-LAMP-1 antistoffer, som beskrevet i protokol 2. Scale barer: 5 um. Gengivet efter oprindelige figur 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: SorLA-medieret nedregulering af CNTFRa er ledsaget af en sænket cellerespons på CLC: CLF-1-stimulering.
HEK293-sorLA celler blev præ-inkuberet i fravær eller nærvær af 10 nM CLC: (. Pre-exp) CLF-1 i 5 timer, sultet i blank medium i 90 minutter, og stimuleret med 5 nM CLC: (. stim) CLF-1 i 15 min. (Venstre) Søjlerne viser de relative niveauer af pSTAT3 i cellerne. Hver søjle repræsenterer middel ± SEM (n = 3) i forhold til pSTAT3 niveau i celler præinkuberet i fravær af CLC: CLF-1, men stimuleret med CLC: CLF-1. p-værdi beregnet ved anvendelse af t-test. (Til højre) Western blot viser respons pSTAT3 og STAT3 opnået i et repræsentativt eksperiment. Gengivet efter oprindelige figur 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den her beskrevne protokol kan bruges specielt til at demonstrere sorLA-medierede CLC: CLF-1-afhængige nedregulering og lysosomale målretning af CNTFRa, samt den medfølgende svækket reaktion på CLC: CLF-1 stimulering.
Den HEK293 cellelinie er velegnet til denne protokol, da de har kun en mindre endogen udtryk for CNTFRa og sorLA, er nemme at transficere, udtrykke gp130 / LIFRβ, og har en stor celle krop, som er egnet til immuncytokemi. Men i teorien enhver cellelinie med lignende egenskaber skal arbejde så godt.
Protokollen har to kritiske trin. Den første vedrører trin 2.3, i hvilken leu / pep medium skal udskiftes cirka hver 6 timer i 24 timer. I modsat fald kan resultere i aktive lysosomale enzymer og mindre eller ingen påviselig ophobning af protein i lysosomerne. Den anden kritiske trin (3.4) bekymringer vask på pre-inkubation med CLC: CLF-1. Det er imtigt at fjerne eventuelt ubundet ligand, og tillade cellerne tid til at komme (undgå fortsatte stimulering) i ikke-suppleret DMEM (blank medium). Dette vil sikre et lavt baggrundsniveau af pSTAT3 under den efterfølgende restimulering med CLC: CLF-1 (trin 3.5).
Især Figur 6 viser, at den cellulære respons (pSTAT3) aftager parallelt med sorLA-medierede nedregulering af CNTFRa. Det skal understreges dog, at selv om en nedsat respons er i overensstemmelse med (og kan forventes ved) en reduktion af CNTFRa pool, betyder det ikke, at den lave CNTFRa ekspression tegner sig alene for den reducerede cellulære respons. Således ændringer - som følge af præ-stimulering eller transfektion - kan i nogen af de funktionelle elementer i signalvejen opstrøms til pSTAT3 have bidraget til den ændret respons.
Det grundlæggende koncept af protokollen er ikke begrænset til denne particular receptor system. (. Dvs. en anden cellelinie, andre antistoffer, andre ligander, etc.) ved at modificere protokol det kan bruges til at bestemme ligand-induceret nedregulering af andre receptorer samt - uanset sorLA's engagement. Det skal dog bemærkes, at analysen af receptor-nedregulering ved Western blotting hovedsagelig er velegnet til receptorer, fx GPI-forankrede receptorer, der udviser en langsom omsætning og en lav grad af ny syntese i ustimulerede celler. Således i receptorer udviser et højt niveau af nye-syntese, ligand-induceret nedregulering kan der kompenseres for ved syntese af nye receptorer. Under disse omstændigheder kan nedreguleringen af receptoren puljen i stedet bestemmes ved hjælp af metabolisk mærkning og pulse-chase forsøg som beskrevet i 21. Alternativt ioderede antistoffer (fortrinsvis Fc-fragmenter), som ikke interfererer med receptor-binding kan anvendes til at "mærke" ektodomænet af recepteller, og det forventede nedregulering kan derefter bestemmes ved radioaktiv tælling af cellepellet og medium.
Af logistiske årsager transficerede vi vores celler med et CNTFRa konstruktion bærer et Myc-tag, og i den foreliggende protokol en muse-anti-Myc-antistof blev anvendt til Western blot-påvisning af receptoren. I modsætning hertil blev et gede-anti-CNTFRa antistof, der anvendes til immunocytokemi og dobbelt mærkning som LAMP-1 blev påvist ved et muse-antistof - og naturligvis anvendelse af to primære museantistoffer ville resultere i uspecifik (overlappende) farvning med sekundære antistoffer. Bemærk, at eftersom gede-anti-CNTFRa også virker i Western blotting (ikke vist), protokollen kunne let modificeres og anvendes på celler transficeret med ukodet CNTFRa.
Endelig er det for nylig blevet vist, at også endocytiske receptor sortilin binder CLC: CLF-1 med høj affinitet 22. Det er således tænkeligt, at sortilin, ligesomsorLA, forbinder til CLC: CNTFRa via CLF-1 og er i stand til at mægle endocytose og lysosomal målretning af CNTFRa så godt. Brug sortilin stedet for sorLA, kan denne protokol bruges til at afklare dette spørgsmål.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
