Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे पश्चिमी सोख्ता और लाइसोसोमल एंजाइमों के निषेध के साथ संयुक्त immunocytochemistry सिलिअरी neurotrophic कारक रिसेप्टर-α (CNTFRα), जो साइटोकाइन तरह फैक्टर -1 (जमानती-1 के बीच बातचीत से अवगत करा दिया है डाउनरेगुलेशन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ) और endocytic रिसेप्टर sorLA।
Abstract
heterodimeric साइटोकाइन Cardiotrophin-तरह साइटोकाइन: साइटोकाइन तरह फैक्टर -1 (सीएलसी: जमानती-1) (लक्ष्य glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई) CNTFRα -anchored एक trimeric जटिल है कि बाद में ग्लाइकोप्रोटीन रंगरूटों 130 / लेकिमिया निरोधात्मक कारक रिसेप्टर-β के लिए फार्म gp130 / LIFRβ) संकेतन के लिए। दोनों सीएलसी और CNTFRα संकेत लेकिन अब तक जमानती -1 केवल सीएलसी स्राव के एक ख्यात सुविधा के रूप में जाना जाता रहा है के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, यह हाल ही में दिखाया गया है कि जमानती -1 तीन बाध्यकारी साइटों में शामिल किया गया है: सीएलसी के लिए एक; CNTFRα के लिए एक (कि trimeric परिसर के विधानसभा बढ़ावा कर सकते हैं); और endocytic रिसेप्टर sorLA के लिए एक। जमानती -1, साथ ही trimeric (सीएलसी: जमानती-1: CNTFRα) उत्तरार्द्ध साइट उच्च आत्मीयता जमानती -1, सीएलसी के बंधन प्रदान करता है sorLA करने के लिए जटिल है, और में घुलनशील ligands जमानती -1 और सीएलसी sorLA व्यक्त कोशिकाओं : जमानती -1 तेजी से ऊपर ले लिया है और भली भाँति रहे हैं। कोशिकाओं सह व्यक्त CNTFRα और sorLA में, CNTFRα पहले सीएलसी बांधता: जमानती-1 के लिए फार्मएक झिल्ली जुड़े trimeric जटिल है, लेकिन यह भी sorLA को जमानती -1 में मुक्त sorLA बाध्यकारी साइट के माध्यम से जोड़ता है। नतीजतन, CNTFRα, जो अपने दम पर endocytosis के लिए कोई क्षमता है, साथ tugged और सीएलसी के sorLA की मध्यस्थता endocytosis से भली भाँति है: जमानती -1।
वर्तमान प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक मैं प्रदर्शित करने के लिए) sorLA की मध्यस्थता और सीएलसी इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: सतह की झिल्ली CNTFRα अभिव्यक्ति की जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन; ii) sorLA की मध्यस्थता endocytosis और लाइसोसोमल CNTFRα का निशाना बना; और iii) सीएलसी के लिए उतारा सेलुलर प्रतिक्रिया: जमानती-1-उत्तेजना CNTFRα की sorLA की मध्यस्थता डाउनरेगुलेशन पर।
Introduction
जमानती -1 1-3: सीएलसी और जमानती -1 heterodimeric साइटोकाइन सीएलसी की दो यूनिटों का गठन। सेलुलर संकेत शामिल करने के लिए, सीएलसी: जमानती -1 पहला लक्ष्य CNTFRα, इसका प्राथमिक और जीपीआई लंगर रिसेप्टर, एक झिल्ली ही सीमित trimeric जटिल बनाने के लिए। सीएलसी: जमानती-1: CNTFRα जटिल बाद में रंगरूटों gp130 / LIFRβ जो transmembrane जानूस Kinase / सिग्नल ट्रान्सड्यूसरों और ट्रांसक्रिप्शन 3 (जे ए / Stat3) मार्ग 4 की Activators के माध्यम से संकेत मध्यस्थता करता है। चूहे तीन यूनिटों में से किसी में कमी एक प्रदर्शन और एक ही phenotype और चेहरे न्यूरॉन्स और अपर्याप्त दूध पिलाती 5-8 की संख्या कम होने के कारण 24 घंटे के भीतर जन्म के बाद मर जाते हैं। मानव में निष्कर्ष इसी तरह तीन यूनिटों के कार्यात्मक जुटना को रेखांकित। इस प्रकार, मानव म्यूटेशन (homozygote या यौगिक) सीएलसी के कारण रोग: जमानती -1 या CNTFRα, तथाकथित ठंड प्रेरित पसीना / Crisponi सिंड्रोम में सभी परिणाम, एक की हालत ऐसी impai जैसे लक्षणों की विशेषतालाल दूध पिलाती और निगलने, विभिन्न कुरूपता सुविधाओं, तापमान spikes, और उलटी और निम्न तापमान 9-11 पर पसीना आ रहा है छिड़कना।
इन विट्रो में, सीएलसी और CNTFRα के संयोजन दोनों आवश्यक और और gp130 / LIFRβ के साथ बातचीत कोशिकाओं 12 में संकेत के शामिल होने के लिए पर्याप्त है। दूसरी ओर जमानती -1 की भूमिका कम स्पष्ट है। यह सीधे संकेतन में शामिल नहीं है, और लंबे समय तक एक परिशिष्ट है कि मुख्य रूप से सीएलसी 1 के सेलुलर स्राव की सुविधा के लिए कार्य करता है के रूप में माना गया है। हालांकि, हाल के निष्कर्ष है कि जमानती -1 इसमें संकेत और सीएलसी और CNTFRα का कारोबार फंसाने अतिरिक्त और अधिक महत्वपूर्ण कार्य किया है दिखाने के लिए। इस प्रकार, यह प्रतीत होता है कि जमानती -1 तीन स्वतंत्र बाध्यकारी साइटों में शामिल हैं: एक के लिए अपने प्रसिद्ध सीएलसी के लिए बाध्य; कि प्रत्यक्ष CNTFRα के लिए बाध्यकारी मध्यस्थता एक; और endocytic रिसेप्टर sorLA के साथ बातचीत के लिए एक तिहाई (उच्च आत्मीयता) साइट। दोनों के रूप में सीएलसी और जमानती -1 लग & #160; सीएलसी की तुलना में काफी कम आत्मीयता के साथ CNTFRα निशाना बनाने के लिए: जमानती -1 जटिल है, यह कल्पना है कि जमानती -1 (अपने CNTFRα बाध्यकारी साइट के माध्यम से) सीएलसी और CNTFRα के एकीकरण को बढ़ावा देता है और इस तरह 13 सिगनल की सुविधा।
sorLA साथ जमानती -1 की बातचीत, वर्तमान प्रस्तुति का मुख्य मुद्दा है, एक पूरी तरह से अलग भूमिका निभाता है। SorLA पांच प्रकार 1 रिसेप्टर्स कि Vps10p-डोमेन रिसेप्टर परिवार 14 गठन में से एक है। यह ऊतकों की एक किस्म में लेकिन मस्तिष्क और neuronal ऊतकों 15 में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है। परिवार के अन्य सदस्यों के लिए इसी प्रकार sorLA एक एन टर्मिनल ligand Vps10p-डोमेन बाध्यकारी किया जाता है, लेकिन इसके अलावा, यह भी कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर परिवार के सदस्यों के 15 में पाया ligand बाध्यकारी तत्वों सहित अन्य डोमेन प्रकार शामिल हैं। इसके cytoplasmic पूंछ कई एडाप्टर प्रोटीन, जैसे, अनुकूलक प्रोटीन -1 और -2, और sorLA के साथ सूचना का आदान प्रदान कुशल endocytos बता देते हैंहै साथ ही साथ intracellular छँटाई और बाध्य प्रोटीन 16-18 के परिवहन। Vps10p-डोमेन के एक बड़े दस पंखों β-प्रोपेलर 19,20, जो जमानती -1 (लेकिन विशेष रूप से, सीएलसी नहीं) 13 सहित असंबंधित ligands की एक श्रृंखला बांधता शामिल हैं। जमानती -1 में बाध्यकारी साइट पहुँचा जा सकता है के बाद भी जिसका अर्थ है कि sorLA न केवल बांधता सीएलसी और CNTFRα साथ जटिल गठन मुक्त जमानती -1, लेकिन यह भी सीएलसी: जमानती -1 और trimeric जटिल सीएलसी: जमानती-1: CNTFRα 13। SorLA जमानती -1 और सीएलसी के तेजी से endocytosis बता देते हैं: जमानती -1, लेकिन इन घुलनशील प्रोटीन CNTFRα एक जीपीआई-लंगर से सतह की झिल्ली को तय हो गई है, जबकि रहे हैं। सवाल इसलिए अगर सीएलसी के बंधन जाता है: जमानती-1: CNTFRα sorLA पूरे परिसर internalize करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह CNTFRα की सतह की झिल्ली अभिव्यक्ति (और सीएलसी के लिए बाद सेलुलर संवेदनशीलता: जमानती -1 संकेत प्रेरण) को बदलने के लिए, और / या CNTFRα का कारोबार।
प्रयोगों वर्तमान में वर्णितरिपोर्ट के बाद सवालों को स्पष्ट करने के लिए बनाया गया:
sorLA सीएलसी मध्यस्थता करता है: सतह की झिल्ली CNTFRα के जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन? यह स्पष्ट करने के लिए, यह शुरू में 21 में वर्णित के रूप CNTFRα का कारोबार निर्धारित करने के लिए चयापचय लेबलिंग और नाड़ी-चेस प्रयोगों के माध्यम से (अनुपस्थिति और sorLA की उपस्थिति में) की कोशिश की थी। हालांकि, CNTFRα [एस 35] सिस्टीन का एक मिश्रण का उपयोग कर और [एस 35] methionine रेडियोधर्मिता के गरीब समावेश दिखाया लेबल करने के लिए प्रयास करता है। इस नए-संश्लेषण का एक बहुत कम डिग्री है, जो सभी संभावना में रिसेप्टर्स के अचानक और महत्वपूर्ण नुकसान की भरपाई करने में असमर्थ होगा सुझाव दिया। यदि CNTFRα जब सीएलसी के माध्यम से जुड़े downregulated था निर्धारित करने के लिए: जमानती -1 sorLA करने के लिए, इसलिए यह (पश्चिमी सोख्ता का उपयोग) पहले और सीएलसी से संपर्क के बाद बस को मापने के लिए CNTFRα की कुल सेलुलर पूल का फैसला किया गया था: जमानती-1 - और परिणामों की तुलना करने कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट या साथ ट्रांसफ़ेक्ट नहींsorLA।
sorLA लाइसोसोम को CNTFRα लक्ष्य है? इस सवाल का, CNTFRα के स्थानीयकरण का जवाब है - अपने सीएलसी के माध्यम से भली भाँति: जमानती-1-मध्यस्थता sorLA के लिए बाध्य - immunocytochemistry का उपयोग कर जांच की गई थी, और और CNTFRα की ओर निर्देशित एंटीबॉडी देर इंडो सोम / lysosome मार्कर लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 के साथ लेबलिंग (दीपक -1)। प्रयोग लाइसोसोमल एंजाइमों के अवरोधकों के साथ इलाज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इलाज कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था। विचार कोर्स की थी कि अगर CNTFRα लाइसोसोम में अपमानित किया गया था, एंजाइम inhibitors के साथ इलाज किया कोशिकाओं, CNTFRα धुंधला दीपक -1 सकारात्मक पुटिकाओं में जमते पेश अनुपचारित कोशिकाओं CNTFRα के लिए कम या कोई धुंधला दिखा सकते हैं, जबकि होगा।
जमानती -1 उत्तेजना: CNTFRα डाउनरेगुलेशन सीएलसी के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को कम करता है? trimeric gp130 / LIFRβ heterodimer जे ए / Stat3 का उपयोग कर के माध्यम से सीएलसी, जमानती-1, और CNTFRα संकेतों से मिलकर जटिलमार्ग। तदनुसार, कोशिकाओं की क्षमता सीएलसी के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए: CNTFRα के डाउनरेगुलेशन पर जमानती -1 सिगनल पश्चिमी धब्बा का पता लगाने और phospho-Stat3 (pSTAT3) / sorLA transfectants में कुल Stat3 स्तर के quantitation द्वारा पता लगाया गया था।
Protocol
1. CNTFRα lysates के पश्चिमी सोख्ता
- एक्सप्रेस पूर्ण लंबाई sorLA और Myc टैग CNTFRα मानव भ्रूण गुर्दे में constructs 293 (HEK293) कोशिकाओं pcDNA3.1 / Zeo का उपयोग कर (-) और pcDNA3.1 / HYG (-), क्रमशः। manufacturer's प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग निर्माणों के साथ HEK293 कोशिकाओं transfect। 150 माइक्रोग्राम / एमएल Zeocin और / या 500 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी गोल्ड 13 युक्त मध्यम में स्थिर क्लोन का चयन करें।
- HEK293 के बीज बराबर संख्या व्यक्त transfectants या तो CNTFRα-Myc या सह व्यक्त दो 4 अच्छी तरह प्लेटें में CNTFRα-Myc / sorLA के रूप में चित्रा 1. संस्कृति से पता चला है Dulbecco में कोशिकाओं को संशोधित Eagle's मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण के साथ पूरक गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 37 सी में एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्ण मध्यम)।
- रुको जब तक कोशिकाओं 50 हैं - 80% मिला हुआ।
- से मध्यम निकालेंचित्र 1 में संकेत दिया जमानती-1: कुओं, Dulbecco फॉस्फेट खारा बफर (DPBS) के साथ एक बार धोने, और के साथ या बिना (नियंत्रण) 10 एनएम सीएलसी ताजा पूर्ण माध्यम जोड़ें। 37 सी में कोशिकाओं को सेते हैं।
- बाद ऊष्मायन के 0 और 5 घंटे, मध्यम वसूली और 1.5 एमएल ट्यूबों में 4 सेल्सियस पर दुकान। फिर 1% ट्राइटन X-100 lysis बफर (20 मिमी Tris एचसीएल, 10 मिमी EDTA, 8.0 पीएच) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक proteinase अवरोध कॉकटेल (1 मिनट, 4 सी) के साथ पूरक जोड़ें। बाद में, 1.5 एमएल ट्यूब (4 सी) के लिए सेल lysates हस्तांतरण।
- मध्यम और सेल lysate (3000 XG, 3 मिनट, 4 सी) युक्त ट्यूबों स्पिन और 1.5 एमएल ट्यूब (4 सी) के लिए supernatants हस्तांतरण। गोली त्यागें। स्थानांतरण 5 नए 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए प्रत्येक सेल lysate सतह पर तैरनेवाला के μL - बाद में प्रोटीन की मात्रा को मापने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं (1.7 कदम)। इसके तत्काल बाद, सभी supernatants को nonreducing एलडीएस नमूना बफर जोड़ने और नमूने भंवर।
- prot को मापने के लिए 5 μL aliquots का प्रयोग करेंनिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक प्रोटीन परख का उपयोग सेल lysate supernatants में ein सामग्री।
- 5 मिनट के लिए 95 सी पर नमूने हीट।
- एसडीएस पृष्ठ 13 को कम करने और पश्चिमी 13 सोख्ता के लिए प्रत्येक नमूने से प्रोटीन के बराबर राशि का विषय है और मध्यम में और सेल lysates में खरगोश का उपयोग कर विरोधी sorLA 16 sorLA, β-actin, और CNTFRα-Myc की सामग्री कल्पना (5 माइक्रोग्राम / एमएल), माउस विरोधी β-actin (0.4 माइक्रोग्राम / एमएल), और माउस विरोधी Myc (1 माइक्रोग्राम / एमएल) एंटीबॉडी और उचित एचआरपी-लिंक्ड माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 2,000)।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डेन्टिसिटोमीटरी द्वारा बैंड यों।
2. लाइसोसोमल Inhibitors के साथ संयोजन में Immunocytochemistry
- बीज HEK293 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया एक 4 अच्छी तरह से थाली में कवर स्लाइड पर CNTFRα-Myc / sorLA साथ ट्रांसफ़ेक्ट। संस्कृति पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं के रूप में ऊपर।
- रुको जब तक सेल संगम 20 - 40%।
- कुओं से मध्यम निकालें और के साथ या 50 माइक्रोग्राम / leupeptin एमएल के बिना और pepstatin एक (लियू / पीईपी) (रोकता लाइसोसोमल हाइड्रोलिसिस) कोशिकाओं का पूरा मध्यम जोड़ने के रूप में चित्रा 2 में संकेत दिया। 37 सी में कोशिकाओं को सेते हैं। मध्यम ऊष्मायन के बाद 24 घंटे के दौरान हर 6 घंटे की जगह होना चाहिए।
- ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, एक बार फिर से मध्यम (के साथ या बिना लियू / पीईपी) की जगह है और इस बार 10 एनएम सीएलसी जोड़ें: जमानती -1। 5 घंटे के लिए 37 सी में कोशिकाओं को सेते हैं।
- पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धो लें और आरटी पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde, पीएच 7 में उन्हें ठीक।
सावधानी: Paraformaldehyde, बेहद जहरीला है त्वचा, आंखों, और श्लेष्मा के साथ संपर्क से बचें। दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहना जाना चाहिए और समाधान एक धूआं हुड के अंदर कर दिया। - पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धो लें और पीबीएस में पतला सैपोनिन में आरटी पर 5 मिनट (0.5% सैपोनिन) के लिए कोशिकाओं permeabilize।
- पतला बकरी विरोधी CNTFRα (1 माइक्रोग्राम / एमएल) (विशेष रूप सेनहीं माउस विरोधी Myc 0.5% सैपोनिन में विरोधी दीपक -1 (15 माइक्रोग्राम / एमएल) एंटीबॉडी पश्चिमी सोख्ता) और माउस के लिए इस्तेमाल किया और आरटी पर 2 घंटे के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
- धो कोशिकाओं 4x (5 मिनट) 0.5% सैपोनिन में और गधा विरोधी बकरी एलेक्सा 488- और गधा विरोधी माउस एलेक्सा 568 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (6 माइक्रोग्राम / एमएल) आरटी पर 2 घंटे के लिए के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
- 0.5% सैपोनिन में धो कोशिकाओं 4x (5 मिनट), विआयनीकृत पानी (1 मिनट) में दो बार, और कवर स्लाइड माइक्रोस्कोप पर बढ़ते मीडिया का उपयोग कर स्लाइड माउंट।
- confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं को एक 63X सी Apochromat पानी विसर्जन उद्देश्य, एनए 1.2 के साथ एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के एंटीबॉडी धुंधला विश्लेषण।
3. पश्चिमी pSTAT3 स्तर की ब्लाट-खोज
- बीज HEK293-sorLA कोशिकाओं को एक 4 अच्छी तरह से थाली में (जो CNTFRα की अंतर्जात स्तर व्यक्त) के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है। संस्कृति पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं के रूप में ऊपर।
- जब तक प्रतीक्षा करें80% मिला हुआ - कोशिकाओं 50 हैं।
- कोशिकाओं को जमानती-1 के रूप में चित्रा 3 में संकेत: कुओं से मध्यम निकालें, पीबीएस में एक बार धोने, और के साथ या बिना 10 एनएम सीएलसी ताजा पूर्ण माध्यम जोड़ें। 5 घंटे के लिए 37 सी में कोशिकाओं को सेते हैं।
- मध्यम निकालें, कोशिकाओं unsupplemented DMEM में दो बार धोने (रिक्त मध्यम; FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना), और फिर खाली माध्यम में 90 मिनट (37 सी) के लिए कोशिकाओं reincubate।
- एक बार फिर, मध्यम हटाने और के साथ या बिना 5 एनएम सीएलसी ताजा खाली माध्यम जोड़ें: (Stat3 फोस्फोराइलेशन आरंभ करने के लिए) के रूप में चित्रा 3 में संकेत जमानती -1। 37 सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- जल्दी से मध्यम हटाने और (1 मिनट, 4 सी) 1% ट्राइटन X-100 lysis बफर (20 मिमी Tris एचसीएल, 10 मिमी EDTA, 8.0 पीएच) एक proteinase अवरोध कॉकटेल और एक फॉस्फेट अवरोध करनेवाला के साथ पूरक जोड़कर कोशिकाओं lyse प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए कॉकटेल। बाद में, 1.5 एमएल ट्यूब (4 सी) के लिए सेल lysates हस्तांतरण।
- स्थानांतरण 5 μL ओएफ नया 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला - उन का उपयोग करने के बाद (3.8 चरण) प्रोटीन सामग्री को मापने के लिए। इसके तत्काल बाद, सभी supernatants को nonreducing एलडीएस नमूना बफर जोड़ने और नमूने भंवर।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक प्रोटीन परख का उपयोग 5 μL aliquots में प्रोटीन की मात्रा को मापने।
- आरटी पर प्रत्येक नमूना Sonicate जब तक वे अब चिपचिपा (लगभग 1 मिनट) कोई और बाद में 5 मिनट के लिए 95 सेल्सियस पर उन्हें गर्मी।
- एसडीएस पृष्ठ 13 और पश्चिमी सोख्ता से 13 प्रत्येक नमूने से प्रोटीन के बराबर राशि का विषय है और खरगोश का उपयोग कर विरोधी pSTAT3 (1: 2000) सेल lysates में pSTAT3 की सामग्री और कुल Stat3 कल्पना और माउस विरोधी Stat3 (1: 1,000 ) एंटीबॉडी और उचित एचआरपी-लिंक्ड माउस और खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 2,000)।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डेन्टिसिटोमीटरी द्वारा बैंड यों।
Representative Results
चित्रा 1 सेल बोने और सीएलसी का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है: प्रोटोकॉल 2. 3 चित्र में जमानती -1 ऊष्मायन: प्रोटोकॉल में जमानती -1 ऊष्मायन 1. चित्रा 2 सेल बोने और लियू / स्फूर्ति और सीएलसी का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है sorLA की मध्यस्थता सीएलसी जमानती -1 ऊष्मायन और प्रोटोकॉल 3. चित्रा 4 में उत्तेजना पता चलता है:: सेल बोने और सीएलसी का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता CNTFRα के जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन। चित्रा 5 sorLA की मध्यस्थता endocytosis और लाइसोसोमल CNTFRα के लक्षित कर पता चलता है। CNTFRα डाउनरेगुलेशन के बाद जमानती -1 उत्तेजना: चित्रा 6 सीएलसी के लिए कम प्रतिक्रिया से पता चलता।
ध्यान दें कि वाचक CNTFRα-Myc बैंड, बार शून्य पर समान घनत्व है, जबकि CNTFRα-Myc के डाउनरेगुलेशन afte sorLA transfectants में कमजोर बैंड द्वारा प्रदर्शन किया हैआर 5 घंटे (चित्रा 4)। चित्रा 5 से पता चलता है कि CNTFRα-Myc दीपक -1 लियू / पेप इलाज कोशिकाओं के सकारात्मक पुटिकाओं में जमा किया है। इसके विपरीत, CNTFRα-Myc का कोई संचय लियू / पेप उपचार के अधीन नहीं कोशिकाओं में देखा जाता है। यह दर्शाता है कि CNTFRα-Myc लाइसोसोम को हल और अपमानित किया जाता है। जमानती-1: 6 चित्र में देखा जा सकता है, pSTAT3 का स्तर काफी कोशिकाओं में स्तर है कि सीएलसी को उजागर नहीं किया गया है की तुलना में पूर्व प्रेरित कोशिकाओं में कम हो जाता है। इस पूर्व प्रेरित कोशिकाओं में CNTFRα मनाया sorLA की मध्यस्थता downregulation (चित्रा 4) के अनुसार है।
चित्रा 1: दो 4 में जमानती -1 प्रोटोकॉल में ऊष्मायन 1. बीज HEK293-CNTFRα-Myc और HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA कोशिकाओं: सेल बोने और सीएलसी की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वअच्छी तरह प्लेटें (0 और 5 ज) और सीएलसी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं: जमानती-1 के रूप में संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सेल बोने और लियू / स्फूर्ति और की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व सीएलसी: जमानती-1 एक 4 अच्छी तरह से थाली में कवर स्लाइड पर प्रोटोकॉल 2. बीज HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA कोशिकाओं में ऊष्मायन और के साथ या बिना लियू कोशिकाओं सेते / स्फूर्ति और सीएलसी: जमानती-1 के रूप में संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र तीन: सेल बोने और सीएलसी की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: एक 4 अच्छी तरह से थाली में जमानती ऊष्मायन और प्रोटोकॉल 3. बीज HEK293-sorLA कोशिकाओं में उत्तेजना और के साथ या बिना सीएलसी कोशिकाओं सेते हैं: (। पूर्व ऍक्स्प) जमानती -1 downregulate करने के लिए के रूप में संकेत Stat3 फोस्फोराइलेशन आरंभ करने के लिए जमानती -1 उत्तेजना (stim।): CNTFRα सीएलसी द्वारा पीछा किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: दिखा रहा है कि SorLA मध्यस्थता परिणाम सीएलसी: CNTFRα के जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन। (ए) HEK293-CNTFRα-Myc और (बी) HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA कोशिकाओं अनुपस्थिति (सफेद स्तंभों) या उपस्थिति (ग्रे कॉलम) 10 एनएम सीएलसी के में incubated रहे थे: जमानती -1। 0 के बाद और5 घंटे, ऊष्मायन बंद कर दिया गया था और मध्यम (एम) में CNTFRα-Myc की सामग्री और सेल lysates में (एल) पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाया और densitometry द्वारा मात्रा गया था। ऊपरी पैनल प्रतिनिधि प्रयोगों से पश्चिमी धब्बा परिणाम दिखाने के लिए और कम पैनल सेल lysates में पाया CNTFRα-Myc का पता लगाया स्तर दिखा। स्तरों 0 घंटे में सिंगल और डबल transfectants में CNTFRα-Myc स्तर के सापेक्ष दिखाए जाते हैं। प्रत्येक स्तंभ का प्रतिनिधित्व करता है मतलब ± SEM (एन = 3)। पी मूल्यों टी परीक्षण का उपयोग कर की गणना की। मूल आंकड़ा 13 के बाद Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:परिणाम दिखा रहा है कि SorLA endocytosis और लाइसोसोमल CNTFRα का निशाना बना मध्यस्थता करता है। HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA कोशिकाओं के साथ या बिना लियू / पेप इलाज किया गया, 10 एनएम सीएलसी के साथ incubated: जमानती-1, 5 घंटे के लिए तय हो गई है, और विरोधी CNTFRα और विरोधी दीपक -1 एंटीबॉडी का उपयोग अंत में दाग प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 2. स्केल सलाखों: 5 माइक्रोन। मूल आंकड़ा 13 के बाद Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: जमानती -1 उत्तेजना: CNTFRα की SorLA की मध्यस्थता डाउनरेगुलेशन सीएलसी के लिए एक कम सेलुलर प्रतिक्रिया के साथ है।
HEK293-sorLA कोशिकाओं अभाव या 10 एनएम सीएलसी की उपस्थिति में पूर्व incubated गया: (। पूर्व ऍक्स्प) जमानती-1 से 5 घंटे के लिए, blan में भूखे90 मिनट के लिए कश्मीर मध्यम, और 5 एनएम सीएलसी के साथ प्रेरित: (। Stim) जमानती-1 15 मिनट के लिए। (बाएं) कॉलम कोशिकाओं में pSTAT3 के रिश्तेदार का स्तर दिखा। जमानती -1 लेकिन सीएलसी के साथ प्रेरित: जमानती -1 प्रत्येक स्तंभ मतलब ± SEM (एन = 3) सीएलसी के अभाव में preincubated कोशिकाओं में pSTAT3 स्तर के सापेक्ष प्रतिनिधित्व करता है। पी मूल्य टी परीक्षण का उपयोग कर की गणना की। (दाएं) पश्चिमी धब्बा एक प्रतिनिधि प्रयोग में प्राप्त pSTAT3 और Stat3 की प्रतिक्रिया से पता चलता। मूल आंकड़ा 13 के बाद Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से इस्तेमाल किया जा सकता sorLA की मध्यस्थता सीएलसी प्रदर्शित करने के लिए: जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन और लाइसोसोमल CNTFRα का निशाना बना है, साथ ही सीएलसी करने के साथ कमजोर प्रतिक्रिया: जमानती -1 उत्तेजना।
HEK293 सेल लाइन इस प्रोटोकॉल के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, के रूप में वे CNTFRα और sorLA का केवल एक छोटी सी अंतर्जात अभिव्यक्ति है, transfect करने के लिए आसान, एक्सप्रेस gp130 / LIFRβ हैं, और एक बड़े सेल शरीर है, जो immunocytochemistry के लिए अनुकूल है। हालांकि, सिद्धांत रूप में इसी तरह की संपत्ति के साथ किसी भी कोशिका पंक्ति के रूप में अच्छी तरह से काम करना चाहिए।
प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण कदम है। पहली चिंताओं 2.3, जिसमें लियू / पेप मध्यम 24 घंटे के लिए जगह होना चाहिए लगभग हर 6 घंटे के कदम। ऐसा करने में विफलता सक्रिय लाइसोसोमल एंजाइमों और कम या लाइसोसोम में प्रोटीन की नहीं detectable संचय में परिणाम हो सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम (3.4) सीएलसी के साथ पूर्व ऊष्मायन पर धोने चिंताएं: जमानती -1। यह IM हैअहम किसी भी अपार ligand दूर करने के लिए, और कोशिकाओं समय unsupplemented DMEM (खाली मध्यम) में (जारी उत्तेजना से बचने) ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए। जमानती-1 (3.5 चरण): यह सीएलसी के साथ बाद में फिर से उत्तेजना के दौरान pSTAT3 के एक कम पृष्ठभूमि के स्तर को सुनिश्चित करेगा।
विशेष रूप से, चित्रा 6 दर्शाता है कि सेलुलर प्रतिक्रिया (pSTAT3) CNTFRα की sorLA की मध्यस्थता डाउनरेगुलेशन के साथ समानांतर में कम हो जाती है। लेकिन उसे यह भी जोर दिया जाना चाहिए, हालांकि एक कम प्रतिक्रिया के साथ (और पर उम्मीद की जा करने के लिए) CNTFRα पूल की कमी अनुसार है, यह साबित नहीं है कि कम CNTFRα अभिव्यक्ति अकेले कम हो सेलुलर प्रतिक्रिया के लिए खातों। इस प्रकार, परिवर्तन - पूर्व उत्तेजना या अभिकर्मक से उत्पन्न - नदी के ऊपर pSTAT3 को संकेतन मार्ग के कार्यात्मक तत्वों में से किसी में बदल जवाबी कार्रवाई के लिए योगदान हो सकता है।
प्रोटोकॉल की मूल अवधारणा इस खासकर तक सीमित नहीं हैLAR रिसेप्टर प्रणाली। (। यानी एक और सेल लाइन, अन्य एंटीबॉडी, अन्य ligands, आदि) - sorLA's भागीदारी की परवाह किए बिना प्रोटोकॉल को संशोधित करके इसे अन्य रिसेप्टर्स की ligand प्रेरित डाउनरेगुलेशन के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रिसेप्टर downregulation पश्चिमी सोख्ता द्वारा की विश्लेषण मुख्य रूप से रिसेप्टर्स, जैसे, जीपीआई लंगर रिसेप्टर्स है, जो एक धीमी गति से कारोबार और unstimulated कोशिकाओं में नया संश्लेषण की एक डिग्री कम प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार, नए-संश्लेषण के एक उच्च स्तर दिखा रिसेप्टर्स में, ligand प्रेरित डाउनरेगुलेशन के लिए नए रिसेप्टर्स के संश्लेषण से मुआवजा दिया जा सकता है। इन परिस्थितियों में, रिसेप्टर पूल के डाउनरेगुलेशन बजाय चयापचय लेबलिंग और नाड़ी-चेस प्रयोगों के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है 21 में वर्णित है। वैकल्पिक रूप से, iodinated एंटीबॉडी (अधिमानतः एफसी-टुकड़े) कि रिसेप्टर के साथ हस्तक्षेप नहीं करते बाइंडिंग "टैग" RECEPT की ectodomain करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताया, और उम्मीद डाउनरेगुलेशन तो सेल गोली और मध्यम के रेडियोधर्मी गिनती के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
रसद कारणों से हम एक CNTFRα के साथ हमारी कोशिकाओं को एक Myc टैग ले जाने का निर्माण ट्रांसफ़ेक्ट, और वर्तमान प्रोटोकॉल में एक चूहे विरोधी Myc एंटीबॉडी रिसेप्टर के पश्चिमी धब्बा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके विपरीत, एक बकरी विरोधी CNTFRα एंटीबॉडी के रूप में दीपक -1 एक माउस एंटीबॉडी द्वारा खोजा गया था immunocytochemistry और डबल लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था - और स्पष्ट रूप से दो प्राथमिक माउस एंटीबॉडी के उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ unspecific (ओवरलैपिंग) धुंधला में नतीजा होगा। ध्यान दें कि जब से बकरी विरोधी CNTFRα भी पश्चिमी सोख्ता (नहीं दिखाया गया) में काम करता है, प्रोटोकॉल आसानी से संशोधित और untagged CNTFRα साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है।
अंत में, यह हाल ही में दिखाया गया है कि यह भी endocytic रिसेप्टर sortilin बांधता सीएलसी है: उच्च आत्मीयता 22 के साथ जमानती -1। इस प्रकार, यह कल्पना है कि sortilin है, जैसेsorLA, सीएलसी के लिए interconnects: जमानती -1 के माध्यम से CNTFRα और endocytosis और लाइसोसोमल CNTFRα के लक्षित कर के रूप में अच्छी तरह से मध्यस्थता करने में सक्षम है। sorLA के बजाय sortilin का उपयोग करना, वर्तमान प्रोटोकॉल इस सवाल का स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
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