Summary
El presente protocolo describe cómo blotting e inmunocitoquímica combinada con la inhibición de las enzimas lisosomales Western se puede utilizar para demostrar la regulación a la baja de factor neurotrófico ciliar Receptor-α (CNTFRα), que se transporta por la interacción entre citoquinas como Factor-1 (CLF-1 ) y el receptor de endocítica sorLA.
Abstract
La citoquina heterodimérica cardiotrofina-como citoquinas: Citoquinas como Factor-1 (CLC: CLF-1) se dirige a la glicosilfosfatidilinositol (GPI) -anclada CNTFRα para formar un complejo trimérico que posteriormente reclutas glicoproteína 130 / inhibidor de la leucemia del receptor del factor-β (gp130 / LIFRβ) para la señalización. Tanto CLC y CNTFRα son necesarios para la señalización, pero hasta ahora CLF-1 sólo se ha conocido como un facilitador putativo de la secreción de CLC. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la CLF-1 contiene tres sitios de unión: una para CLC; uno para CNTFRα (que puede promover el ensamblaje del complejo trimérico); y uno para el receptor de endocítica sorLA. Este último sitio proporciona la unión de CLF-1, CLC alta afinidad: CLF-1, así como el trímero (CLC: CLF-1: CNTFRα) complejo a sorLA, y en células sorLA-expresión de los ligandos solubles CLF-1 y CLC : CLF-1 se toman rápidamente hacia arriba y interiorizado. En las células que expresan co-CNTFRα y sorLA, CNTFRα primera une CLC: CLF-1 para formarun complejo trimérico asociada a la membrana, sino que también se conecta a sorLA a través del sitio libre de unión sorLA-en CLF-1. Como resultado, CNTFRα, que no tiene capacidad para la endocitosis por su cuenta, se tiró a lo largo y internalizado por la endocitosis mediada por sorLA de CLC: CLF-1.
El presente protocolo describe los procedimientos experimentales utilizados para demostrar i) mediada por la sorLA y CLC: regulación a la baja de CLF-1 dependiente de expresión CNTFRα-superficie de la membrana; ii) endocitosis y lisosómica de CNTFRα sorLA mediada; y iii) la respuesta celular bajado a CLC: CLF-1-estimulación en la regulación negativa mediada por sorLA de CNTFRα.
Introduction
El CLC y CLF-1 constituyen las dos subunidades de la citoquina heterodimérica CLC: CLF-1 a 1-3. Para la inducción de señales celulares, CLC: CLF-1 primeros objetivos de la CNTFRα, su receptor primario y anclada a GPI, para formar un complejo trimérico unida a la membrana. El CLC: CLF-1: Complejo de CNTFRα recluta posteriormente gp130 / LIFRβ que media transmembrana de señalización a través de la quinasa Janus / transductores de señal y activadores de la transcripción 3 (JAK / STAT3) vía 4. Los ratones deficientes en cualquiera de las tres subunidades de pantalla una y el mismo fenotipo y mueren dentro de 24 h después de su nacimiento debido a un número reducido de neuronas faciales y insuficiente succión 5-8. Los hallazgos en seres humanos asimismo de relieve la coherencia funcional de las tres subunidades. Por lo tanto, las mutaciones humanas (homocigotos o compuestos) disfunción causando de CLC: CLF-1 o CNTFRα, todo el resultado en la llamada sudoración inducida por el frío síndrome / Crisponi, una condición caracterizada por síntomas tales como impaila succión y la deglución roja, varios rasgos dismórficos, picos de temperatura, y paradójico y perfundir sudando a bajas temperaturas 9-11.
In vitro, la combinación de CLC y CNTFRα es a la vez necesaria y suficiente para la interacción con gp130 / LIFRβ y la inducción de la señalización en las células 12. El papel de CLF-1, por otro lado es menos clara. No está directamente implicada en la señalización, y durante mucho tiempo ha sido considerado como un apéndice que sirve principalmente para facilitar la secreción celular de CLC 1. Sin embargo, los recientes hallazgos muestran que CLF-1 tiene funciones adicionales y más importantes que implican tanto la señalización y la rotación de la CVX y CNTFRα. Por lo tanto, parece que la CLF-1 contiene tres sitios de unión independientes: una para su conocido unión a CLC; uno que media en la unión directa a la CNTFRα; y un tercer sitio (alta afinidad) para la interacción con el receptor de endocítica sorLA. Dado que tanto la CVX y CLF-1 parecen & #160; para apuntar CNTFRα con una considerable afinidad más baja que la CLC: Complejo de CLF-1, es concebible que CLF-1 (a través de su sitio de unión a CNTFRα) promueve la unificación de CLC y CNTFRα y por lo tanto facilita la señalización 13.
la interacción de CLF-1 con sorLA, el tema principal de la presentación presente, juega un papel completamente diferente. SorLA es uno de los cinco receptores tipo 1 que constituyen la familia de receptores Vps10p-14 dominio. Se expresa en una variedad de tejidos, pero en particular en el cerebro y los tejidos neuronales 15. De manera similar a los otros miembros de la familia sorLA lleva un ligando N-terminal de unión Vps10p-dominio, pero además, comprende también otros tipos de dominio, incluyendo elementos de unión a ligandos que se encuentran en miembros de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad 15. Su cola citoplásmica interactúa con varias proteínas adaptadoras, por ejemplo, el adaptador de la proteína-1 y -2, y sorLA transmite endocytos eficienteses así como la clasificación intracelular y el transporte de las proteínas unidas 16-18. El Vps10p-dominio comprende un gran diez palas de la hélice β-19,20, que se une una serie de ligandos no relacionados entre ellos CLF-1 (pero sobre todo, no CLC) 13. El sitio de unión en CLF-1 es accesible incluso después de la formación de complejos con CLC y CNTFRα que significa que sorLA se une no sólo libre de CLF-1, pero también CLC: CLF-1 y el CLC complejo trimérico: CLF-1: CNTFRα 13. SorLA transmite rápida endocitosis de CLF-1 y CLC: CLF-1, pero estos son proteínas solubles mientras que CNTFRα se fija a la membrana de la superficie de un anclaje GPI. La pregunta es, por tanto, si el enlace de la CVX: CLF-1: CNTFRα permite sorLA para internalizar todo el complejo y por lo tanto alterar la expresión de membrana de superficie de CNTFRα (y la susceptibilidad celular posterior al CLC: CLF-1 señal de inducción), y / o la facturación de CNTFRα.
Los experimentos descritos en la presenteinforme fueron diseñados para aclarar las siguientes preguntas:
No mediar sorLA CLC: regulación a la baja de CLF-1 dependiente de la superficie de la membrana CNTFRα? Para aclarar esto, se intentó inicialmente para determinar el volumen de negocios de CNTFRα (en ausencia y presencia de sorLA) por medio del etiquetado y de pulso-caza experimentos metabólicos como se describe en el 21. Sin embargo, los intentos para etiquetar CNTFRα usando una mezcla de [S 35] cisteína y [S 35] metionina mostró pobre incorporación de radiactividad. Esto sugirió un grado muy bajo de nueva síntesis, que con toda probabilidad no sería capaz de compensar una pérdida repentina y significativa de los receptores. Para determinar si CNTFRα se downregulated cuando están interconectados a través de CLC: CLF-1 a sorLA, lo que se decidió simplemente para medir (utilizando el Western Blot) de la piscina celular total de CNTFRα antes y después de la exposición a la CLC: CLF-1 - y la comparación de resultados en las células transfectadas o no transfectadas consorLA.
¿Tiene objetivo sorLA CNTFRα a los lisosomas? Para responder a esta pregunta, la localización de CNTFRα - internalizado a través de su CLC: CLF-1 mediada por la unión a sorLA - se examinó mediante inmunocitoquímica, y etiquetado con anticuerpos dirigidos hacia CNTFRα y finales del endosoma / lisosoma marcador lisosomal asociada a la proteína de membrana 1 (LAMP-1). El experimento se realizó en las células tratadas, así como sin tratar con inhibidores de las enzimas lisosomales. La idea era, por supuesto, que si CNTFRα se degrada en los lisosomas, las células tratadas con inhibidores de la enzima presentarían CNTFRα-tinción se acumula en LAMP-1 vesículas positivas, mientras que las células no tratadas mostrarían poca o ninguna tinción para CNTFRα.
No CNTFRα regulación a la baja a reducir la respuesta celular al CLC: CLF-1 estimulación? El complejo trimérico que consiste en CLC, CLF-1, y las señales de CNTFRα a través de la gp130 / heterodímero LIFRβ utilizando la JAK / STAT3camino. En consecuencia, la capacidad de las células para responder a CLC: CLF-1 de señalización al downregulation de CNTFRα fue explorada por la detección de transferencia de Western y la cuantificación del nivel de fosfo-STAT3 STAT3 (pSTAT3) / total en el transfectantes SorLA.
Protocol
1. Western Blotting de CNTFRα lisados
- Expresan de larga duración sorLA y etiquetada Myc-CNTFRα construye en el riñón embrionario humano 293 (HEK293) células por medio de pcDNA3.1 / Zeo (-) y pcDNA3.1 / hyg (-), respectivamente. Transfectar las células HEK293 con las construcciones usando un reactivo de transfección comercial según el protocolo del fabricante. Seleccionar clones estables en medio que contiene 150 mg / ml de zeocina y / o 500 mg / ml de higromicina B Oro 13.
- Seed números iguales de células HEK293 transfectadas que expresan CNTFRα-Myc o co-expresión de CNTFRα-Myc / sorLA en dos placas de 4 pocillos como se muestra en la Figura 1. La cultura las células en Dulbecco modificado del Águila Medium (DMEM) suplementado con 10% fetal de suero bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina (medio completo) en un incubador de dióxido de carbono al 5% a 37 ° C.
- Espere hasta que las células son un 50 - 80% de confluencia.
- Retire el medio de lapozos, lavar una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), y se añade medio fresco completo con o sin (control) 10 nM CLC: CLF-1 como se indica en la Figura 1. Se incuban las células a 37 ° C.
- Después de 0 y 5 h de incubación, recuperar el medio y lo almacena a 4 ° C en tubos de 1,5 mL. A continuación, añadir tampón de 1% de Triton X-100 de lisis (20 mM Tris-HCl, EDTA 10 mM, pH 8,0) suplementado con un cóctel inhibidor de proteinasa a cada pocillo (1 min, 4 ° C). Posteriormente, la transferencia de los lisados de células a tubos de 1,5 mL (4 C).
- Girar los tubos que contienen el lisado de células y medio (3.000 x g, 3 min, 4 ° C) y transferir los sobrenadantes a tubos de 1,5 mL (4 C). Se desecha el precipitado. Transferencia de 5 l de cada sobrenadante de lisado celular a nuevos tubos de 1,5 mL - utilizarlos para medir el contenido de proteína más adelante (paso 1.7). Inmediatamente, añadir no reductores tampón de muestra LDS a todos los sobrenadantes y agitar las muestras.
- Usa los 5 alícuotas para medir la protcontenido ein en los sobrenadantes de lisados celulares usando un ensayo de proteína comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Calentar las muestras a 95 ° C durante 5 min.
- Sujeto una cantidad igual de proteína de cada muestra a la reducción de SDS-PAGE 13 y Western Blot 13 y visualizar el contenido de sorLA, β-actina, y CNTFRα-Myc en el medio y en los lisados celulares de conejo anti-sorLA 16 (5 g / ml), ratón anti-β-actina (0,4 mg / ml), y de ratón anti-Myc (/ ml) anticuerpos 1 mg y los anticuerpos secundarios ligados a HRP apropiadas (1: 2000).
- Cuantificar las bandas por densitometría de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2. La inmunocitoquímica en combinación con inhibidores lisosomales
- Sembrar las células HEK293 transfectadas de forma estable con CNTFRα-Myc / sorLA en portaobjetos de cubierta en una placa de 4 pocillos como se muestra en la Figura 2. Cultivar las células en medio completo que anteriormente.
- Esperar hasta la confluencia celular es 20 - 40%.
- Eliminar el medio de los pocillos y añadir medio completo con o sin 50 mg / ml de leupeptina y pepstatina A de (leu / pep) (inhibe hidrolasas lisosomales) a las células como se indica en la Figura 2. Se incuban las células a 37 ° C. El medio debe ser reemplazado cada 6 h durante las siguientes 24 horas de incubación.
- Después de 24 h de incubación, una vez más sustituir el medio (con o sin leu / pep) y esta vez añadir 10 nM CLC: CLF-1. Se incuban las células a 37ºC durante 5 h.
- Lavar las células una vez en PBS y fijarlas en paraformaldehído al 4%, pH 7 durante 15 min a RT.
Precaución: El paraformaldehído es altamente tóxico, evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. Guantes y gafas de seguridad deben ser usados y soluciones hechas dentro de una campana de humos. - Lavar las células una vez en PBS y permeabilizar las células durante 5 min a RT en saponina diluido en PBS (0,5% de saponina).
- Diluir cabra anti-CNTFRα (1 mg / ml) (en particularno el ratón anti-Myc utiliza para transferencia de Western) y el ratón anticuerpos anti-LAMP-1 (15 g / ml) en 0,5% de saponina e incubar las células con los anticuerpos para 2 h a TA.
- Lavar las células 4x (5 min) en 0,5% de saponina e incubar las células con burro anti-cabra Alexa 488- y burro anti-ratón de Alexa anticuerpos secundarios conjugados (568-6 mg / ml) durante 2 h a TA.
- Se lavan las células 4x (5 min) en 0,5% de saponina, dos veces en agua desionizada (1 min), y montar la cubierta se desliza en el microscopio utilizando medios de montaje.
- Analizar el anticuerpo-tinción de las células por microscopía confocal usando un microscopio confocal de escaneo láser con un objetivo de inmersión en agua 63X C-Apocromático, NA 1.2.
3. Western Blot-detección del nivel pSTAT3
- Seed células HEK293-SorLA (que expresan niveles endógenos de CNTFRα) en una placa de 4 pocillos como se muestra en la Figura 3. Cultivar las células en medio completo que anteriormente.
- Espere hasta que ellas células son un 50 - 80% confluente.
- Eliminar el medio de los pocillos, lavar una vez en PBS, y se añade medio fresco completo con o sin 10 nM CLC: CLF-1 a las células como se indica en la Figura 3. Se incuban las células a 37ºC durante 5 h.
- Se elimina el medio, se lavan las células dos veces en DMEM sin suplementos (medio en blanco; sin FBS y antibióticos), y luego reincubate las células durante 90 minutos (37 ° C) en un medio en blanco.
- Una vez más, se elimina el medio y se añade medio fresco en blanco con o sin 5 nM CLC: CLF-1 (para iniciar la fosforilación de STAT3) como se indica en la figura 3. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C.
- eliminar rápidamente el medio y lisar las células (1 min, 4 ° C) mediante la adición de tampón de 1% de Triton X-100 de lisis (20 mM Tris-HCl, EDTA 10 mM, pH 8,0) suplementado con un cóctel inhibidor de proteinasa y un inhibidor de fosfatasa cóctel a cada pocillo. Posteriormente, la transferencia de los lisados de células a tubos de 1,5 mL (4 C).
- Transferir 5 l of cada sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mL - los utilizan para medir el contenido de proteína más adelante (paso 3.8). Inmediatamente, añadir no reductores tampón de muestra LDS a todos los sobrenadantes y agitar las muestras.
- Mida el contenido de proteína de los 5 alícuotas utilizando un ensayo de proteína comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Sonicar cada muestra a RT hasta que ya no viscoso (aproximadamente 1 min) y posteriormente son calentarlos a 95 ° C durante 5 min.
- Sujeto una cantidad igual de proteína de cada muestra para SDS-PAGE 13 y Western Blot 13 y visualizar el contenido de pSTAT3 y STAT3 total en los lisados de células de conejo anti-pSTAT3 (1: 2000) y el ratón anti-STAT3 (1: 1000 ) anticuerpos y el ratón HRP-ligado y conejo anticuerpos secundarios apropiados (1: 2000).
- Cuantificar las bandas por densitometría de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Representative Results
La figura 1 muestra una representación esquemática de la célula-siembra y CLC: CLF-1 de incubación en el protocolo 1. La figura 2 muestra una representación esquemática de la célula-siembra y leu / pep y CLC: CLF-1 de incubación en el protocolo 2. La figura 3 muestra una representación esquemática de la célula-siembra y CLC: CLF-1 incubación y estimulación en el protocolo 3. la figura 4 muestra el CLC mediada por sorLA: downregulation CLF-1 dependiente de CNTFRα. Figura 5 muestra la mediada por endocitosis y sorLA lisosómica de CNTFRα. La figura 6 muestra la menor respuesta a la CLC: CLF-1 estimulación después de CNTFRα regulación a la baja.
Tenga en cuenta que las bandas que significan CNTFRα-Myc tienen densidad similar en el tiempo cero, mientras que la regulación por disminución de CNTFRα-Myc se demuestra por la banda más débil en transfectantes SorLA faetr 5 h (Figura 4). La Figura 5 muestra que CNTFRα-Myc se ha acumulado en LAMP-1 vesículas positivos de células leu / pep tratada. En contraste, no hay acumulación de CNTFRα-Myc se ve en las células no sometidas a tratamiento leu / pep. Esto demuestra que CNTFRα-Myc se ordena a los lisosomas y degradada. Como puede verse en la Figura 6, el nivel de pSTAT3 se reduce significativamente en las células pre-estimulado en comparación con el nivel en las células que no ha sido expuesto a CLC: CLF-1. Esto está de acuerdo con la observada mediada downregulation sorLA de CNTFRα en las células pre-estimulado (Figura 4).
Figura 1: Representación esquemática de la célula-siembra y CLC: CLF-1 de incubación en el protocolo células HEK293-CNTFRα-myc y HEK293-CNTFRα-Myc / SorLA 1. semilla en dos 4-y placas (0 y 5 h) y se incuban las células con CLC: CLF-1 como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática de la célula-siembra y Leu / pep y CLC: CLF-1 incubación en el protocolo 2. Seed células HEK293-CNTFRα-Myc / SorLA en la cubierta se desliza en una placa de 4 pocillos y se incuban las células con o sin leu / Pep y CLC: CLF-1 como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación esquemática de la célula-siembra y CLC: CLF de incubación y la estimulación en el protocolo 3. Semillas células HEK293-SorLA en una placa de 4 pocillos y se incuban las células con o sin CLC: (. pre-exp) CLF-1 para regular a la baja la CNTFRα seguido por CLC: CLF-1 estimulación (. stim) para iniciar la fosforilación de STAT3 como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados que muestran que SorLA media CLC: regulación a la baja de CLF-1 dependiente de CNTFRα. (A) células (B) HEK293-CNTFRα-Myc / SorLA HEK293-CNTFRα-Myc y se incubaron en ausencia (columnas blancas) o presencia (columnas grises) de 10 nM CLC: CLF-1. Después de 0 y5 h, la incubación se detuvo y el contenido de CNTFRα-Myc en el medio (m) y en los lisados celulares se detectó (l) por transferencia de Western y se cuantificaron por densitometría. Los paneles superiores muestran los resultados de transferencia de Western de los experimentos representativos y los paneles inferiores muestran los niveles detectados de CNTFRα-Myc se encuentran en los lisados celulares. Los niveles se muestran en relación con el nivel CNTFRα-Myc en los transfectantes individuales y dobles a 0 h. Cada columna representa la media ± SEM (n = 3). los valores de p calculados utilizando la prueba t. Reproducido figura original después de 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:Los resultados muestran que SorLA media la endocitosis y lisosomal de CNTFRα. células HEK293-CNTFRα-Myc / SorLA se trataron con o sin leu / pep, se incubaron con 10 CLC nM: CLF 1-para 5 h, fijo, y, finalmente, teñidas utilizando anti-CNTFRα y anti LAMP--1 anticuerpos como se describe en el protocolo 2. Las barras de escala: 5 m. Reproducido figura original después de 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: downregulation mediada por SorLA de CNTFRα está acompañada por una respuesta celular rebajado a CLC: CLF-1 estimulación.
células HEK293-SorLA se pre-incubaron en ausencia o presencia de 10 nM CLC: (. pre-exp) CLF-1 durante 5 h, hambre en blanmedio k para 90 min, y se estimularon con 5 nM CLC: (. stim) CLF-1 durante 15 min. (Izquierda) Las columnas muestran los niveles relativos de pSTAT3 en las células. Cada columna representa la media ± SEM (n = 3) con respecto al nivel de pSTAT3 en las células preincubadas en ausencia de CLC: CLF-1 pero estimulados con CLC: CLF-1. p-valor calculado usando la prueba t. (Derecha) La transferencia de Western muestra la respuesta de pSTAT3 y STAT3 obtenido en un experimento representativo. Reproducido figura original después de 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo descrito aquí puede ser utilizado específicamente para demostrar la CLC mediada por sorLA: downregulation CLF-1-dependiente y lisosómica de CNTFRα, así como la que acompaña a la respuesta debilitado a CLC: CLF-1 estimulación.
La línea celular HEK293 es muy adecuado para este protocolo, ya que sólo tienen una menor expresión endógena de CNTFRα y sorLA, son fáciles de transfectar, expresa gp130 / LIFRβ, y tener un cuerpo de células grandes, que es adecuado para inmunocitoquímica. Sin embargo, en teoría cualquier línea celular con propiedades similares debería funcionar tan bien.
El protocolo tiene dos pasos críticos. La primera se refiere paso 2.3, en el que el medio leu / pep debe ser reemplazado aproximadamente cada 6 h durante 24 h. El no hacerlo puede resultar en enzimas lisosomales activos y menos o ninguna acumulación de la proteína detectable en los lisosomas. El segundo paso crítico (3,4) preocupaciones sobre lavado pre-incubación con CLC: CLF-1. Es importante para eliminar cualquier ligando no unido, y para permitir a las células tiempo para recuperarse (evitando la estimulación continua) en DMEM sin suplementos (medio en blanco). Esto asegurará un bajo nivel de fondo de pSTAT3 durante la posterior re-estimulación con CLC: CLF-1 (paso 3.5).
En particular, la Figura 6 demuestra que la respuesta celular (pSTAT3) disminuye en paralelo con la regulación a la baja mediada por sorLA de CNTFRα. Cabe destacar sin embargo, que a pesar de una respuesta reducida es de acuerdo con (y lo que se espera a) una reducción de la piscina CNTFRα, no se demuestra que la expresión de bajo CNTFRα por sí solo representa la respuesta celular reducida. Así, los cambios - resultantes de pre-estimulación o transfección - en cualquiera de los elementos funcionales de la vía de señalización aguas arriba de pSTAT3 pueden haber contribuido a la respuesta alterada.
El concepto básico del protocolo no se limita a este particusistema receptor lar. (. Es decir, otra línea celular, otros anticuerpos, otros ligandos, etc) modificando el protocolo que puede ser utilizado para determinar la regulación a la baja inducida por ligando de otros receptores, así - independientemente de la participación sorLA's. Sin embargo, hay que señalar que el análisis de receptor-regulación a la baja por transferencia Western es adecuado principalmente para los receptores, por ejemplo, receptores ancladas a GPI, que exhiben una baja rotación y un bajo grado de nueva síntesis en las células no estimuladas. Así, en los receptores que muestran un alto nivel de nueva síntesis, la regulación por disminución inducida por el ligando puede ser compensada por la síntesis de nuevos receptores. En estas circunstancias, la regulación a la baja de la piscina receptor en lugar se puede determinar por medio del etiquetado y de pulso-caza experimentos metabólicos como se describe en 21. Alternativamente, los anticuerpos yodados (preferentemente fragmentos Fc) que no interfieren con la unión al receptor se puede utilizar para "etiqueta" el ectodominio de la recepto, y la regulación a la baja esperada puede entonces ser determinado mediante recuento radiactivo de sedimento de células y medio.
Por razones logísticas que transfectadas nuestras células con un CNTFRα construyen lleva una etiqueta Myc, y en el presente protocolo se utilizó un anticuerpo anti-Myc ratón para blot detección occidental del receptor. Por el contrario, se utilizó un anticuerpo anti-cabra CNTFRα para inmunocitoquímica y doble etiquetado como LAMP-1 se detectó mediante un anticuerpo de ratón - y utilizar obviamente de dos anticuerpos primarios de ratón resultaría en la tinción inespecífica (superposición) con anticuerpos secundarios. Tenga en cuenta que puesto que la cabra anti-CNTFRα también trabaja en secante (no mostrada) Western, el protocolo podría fácilmente ser modificada y se aplicó a las células transfectadas con sin etiquetar CNTFRα.
Por último, recientemente se ha demostrado que también la sortilin receptor endocítica une CLC: CLF-1 con alta afinidad 22. Por lo tanto, es concebible que sortilin, comosorLA, interconecta a CLC: CNTFRα a través de CLF-1 y es capaz de mediar la endocitosis y lisosomal de CNTFRα también. Usando sortilin en lugar de sorLA, el presente protocolo puede ser usado para aclarar esta cuestión.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
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