Summary
Det nuvarande protokollet beskriver hur Western blotting och immunocytokemi i kombination med hämning av lysosomala enzymer kan användas för att demonstrera nedreglering av ciliär neurotrofisk faktor Receptor-α (CNTFRa), som förmedlas genom samverkan mellan Cytokine liknande faktor-1 (CLF-1 ) och den endocytiska receptorn sorLA.
Abstract
Det heterodimera cytokin kardiotrofin-liknande Cytokine: Cytokine-like Factor-1 (CLC: CLF-en) riktar den glykosylfosfatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRa att bilda ett trimert komplex som därefter rekryterar glykoprotein 130 / Leukemia Inhibitory Factor Receptor-β (gp 130 / LIFRp) för signalering. Både CLC och CNTFRa är nödvändiga för signalering men hittills CLF-en har endast varit känd som en förmodad facilitator av CLC sekretion. Emellertid har det nyligen visats att CLF-en innehåller tre bindningsställen: ett för CLC; en för CNTFRa (som kan främja monteringen av trimera komplex); och en för den endocytiska receptorn sorLA. Den senare webbplatsen finns högaffinitetsbindning av CLF-en, CLC: CLF-en, samt den trimera (CLC: CLF-en: CNTFRa) -komplexet till sorLA, och i sorLA-uttryckande celler de lösliga liganderna CLF-en och CLC : CLF-en snabbt tas upp och internaliseras. I celler som samuttrycker CNTFRa och sorLA, först binder CNTFRa CLC: CLF-1 för att bildaen membranassocierad trimera komplex, men det kan också anslutas till sorLA via den fria sorLA-bindningsställe i CLF-1. Som ett resultat, CNTFRa, som inte har någon kapacitet för endocytos på egen hand, är tugged utmed och internaliseras av sorLA förmedlad endocytos av CLC: CLF-en.
Det nuvarande protokollet beskriver de experimentella metoder som används för att visa i) sorLA-medierad och CLC: CLF-1-beroende nedreglering av ytan membran CNTFRa uttryck; ii) sorLA medierad endocytos och lysosomal målinriktning av CNTFRa; och iii) sänkte cellulärt svar på CLC: CLF-1-stimulering efter sorLA-medierad nedreglering av CNTFRa.
Introduction
CLC och CLF-1 utgör de två subenheter av heterodimera cytokinen CLC: CLF-en. 1-3 För mobilsignalen induktion, CLC: CLF-1 första mål den CNTFRa, dess primära och GPI-förankrade receptor, för att bilda en membranbundna trimera komplex. CLC: CLF-1: CNTFRa komplex därefter rekryterar gp130 / LIFRp som förmedlar trans signalering via Janus kinas / signalomvandlare och aktivatorer av transkription 3 (JAK / STAT3) väg 4. Möss som saknar någon av de tre subenheter visar en och samma fenotyp och dör inom 24 timmar efter födseln på grund av ett minskat antal ansikts neuroner och otillräcklig diande 5-8. Fynd i människor understryker också den funktionella konsekvensen av de tre subenheter. Således, mänskliga mutationer (homozygota eller sammansatta) orsakar dysfunktion av CLC: CLF-1 eller CNTFRa, alla resultat i den så kallade kall inducerad svettning / Crisponi syndrom, ett tillstånd som kännetecknas av symtom som impairöd diande och svälja, olika avvikelser i utseendet, temperatur spikar, och paradoxalt och BEGJUTA svettas vid låga temperaturer 9-11.
In vitro, är både nödvändig och tillräcklig för interaktion med gp 130 / LIFRp och induktion av signalering i cellerna 12 kombinationen av CLC och CNTFRa. Rollen av CLF-en å andra sidan är mindre tydligt. Det är inte direkt inblandad i signalering, och har länge betraktats som en bilaga som huvudsakligen tjänar till att underlätta den cellulära utsöndringen av CLC 1. Men nya rön visar att CLF-1 har ytterligare och mer viktiga funktioner implicerar både signal- och omsättning av CLC och CNTFRa. Således verkar det som om CLF-en innehåller tre oberoende bindningsställen: ett för sin välkända bindning till CLC; en som förmedlar direkt bindning till CNTFRa; och en tredjedel (hög affinitet) plats för interaktion med den endocytiska receptorn sorLA. Eftersom både CLC och CLF-1 verkar & #160, för att rikta CNTFRa med en betydligt lägre affinitet än CLC: CLF-1-komplexet, är det tänkbart att CLF-1 (via dess CNTFRa-bindningsställe) främjar enande CLC och CNTFRa och därigenom underlättar signalering 13.
CLF-en interaktion med sorLA, den viktigaste frågan om den nuvarande presentationen spelar en helt annan roll. SorLA är en av de fem typ 1-receptorer som utgör Vps10p domänreceptorfamiljen 14. Den uttrycks i en mängd olika vävnader, men i synnerhet i hjärna och neuronala vävnader 15. Liknar de andra familjemedlemmarna sorLA bär en N-terminal ligandbindande Vps10p-domän, men dessutom, innefattar det också andra domäntyper inklusive ligandbindande element som finns i medlemmar av low-density lipoprotein-receptorfamiljen 15. Dess cytoplasmasvans samverkar med flera adapter proteiner, t.ex. adapter protein-1 och -2 och sorLA förmedlar effektiva endocytosär liksom intracellulär sortering och transport av bundna proteiner 16-18. Den Vps10p-domänen består av ett stort tio-bladig β-propeller 19,20, som binder en rad obesläktade ligander inklusive CLF-1 (men framför allt, inte CLC) 13. Bindningsstället i CLF-en är tillgänglig även efter komplexbildning med CLC och CNTFRa vilket innebär att sorLA binder inte bara fri CLF-en, utan också CLC: CLF-en och den trimera komplex CLC: CLF-en: CNTFRa 13. SorLA förmedlar snabb endocytos av CLF-en och CLC: CLF-en, men dessa är lösliga proteiner medan CNTFRa är fixerad till ytmembranet av ett GPI-ankare. Frågan är därför om bindning av CLC: CLF-1: CNTFRa tillåter sorLA att internalisera hela komplexet och därigenom förändra ytan membran uttryck för CNTFRa (och den efterföljande cellulära känslighet för CLC: CLF-en signal induktion), och / eller omsättning CNTFRa.
De experiment som beskrivs i föreligganderapport har utformats för att klargöra följande frågor:
Har sorLA medla CLC: CLF-1-beroende nedreglering av yta-membran CNTFRa? För att klargöra detta, var det till en början försökte bestämma omsättning CNTFRa (i frånvaro och närvaro av sorLA) genom metabolisk märkning och puls chase experiment som beskrivs i 21. Emellertid har försök att märka CNTFRa med användning av en blandning av [S 35] cystein och [S 35] metionin visade dålig inkorporering av radioaktivitet. Detta antydde en mycket låg grad av ny-syntes, som med all sannolikhet inte skulle kunna kompensera för en plötslig och betydande förlust av receptorer. För att bestämma om CNTFRa var nedreglerad när sammankopplade via CLC: CLF-1 till sorLA, var det därför beslutat att helt enkelt mäta (med Western blotting) det totala cellulära pool av CNTFRa före och efter exponering för CLC: CLF-1 - och jämföra resultat i celler transfekterade eller inte transfekterats medsorLA.
Betyder sorLA rikta CNTFRa till lysosomer? För att besvara denna fråga, lokalisering av CNTFRa - intern via sin CLC: CLF-1-medierad bindning till sorLA - undersöktes med användning av immuncytokemi och märkning med antikroppar riktade mot CNTFRa och sena endosomen / lysosom markör Lysosomala-associerad membranprotein 1 (LAMP-1). Experimentet utfördes på celler som behandlats samt obehandlat med hämmare av lysosomala enzymer. Tanken var naturligtvis att om CNTFRa bröts ned i lysosomer, skulle celler som behandlats med enzymhämmare fram CNTFRa-färgning samlas i LAMP-1-positiva vesiklar, medan obehandlade celler skulle visa liten eller ingen färgning för CNTFRa.
Har CNTFRa nedreglering sänka cellulärt svar på CLC: CLF-1-stimulering? Den trimera komplex bestående av CLC, CLF-1, och CNTFRa signaler via gp130 / LIFRp heterodimer med hjälp av JAK / STAT3väg. Följaktligen är kapaciteten hos celler svarar på CLC: CLF-1-signalering vid nedreglering av CNTFRa undersöktes genom Western blot detektering och kvantifiering av fosfor-STAT3 (pSTAT3) / total STAT3 nivå i sorLA transfektanter.
Protocol
1. Western blotting av CNTFRa Lysat
- Uttrycka fullängds sorLA och Myc-tagged CNTFRa konstruktioner i humana embryonala njur-293 (HEK293) -celler med användning av pcDNA3.1 / Zeo (-) och pcDNA3.1 / Hyg (-), respektive. Transfektera HEK293-celler med konstrukten med användning av ett kommersiellt transfektionsreagens enligt tillverkarprotokoll. Välj stabila kloner i medium innehållande 150 mikrogram / ml Zeocin och / eller 500 mikrogram / ml Hygromycin B Gold 13.
- Utsädes lika antal HEK293-transfektanter som uttrycker antingen CNTFRa-Myc eller som samuttrycker CNTFRa-Myc / sorLA i två 4-brunnars plattor såsom visas i figur 1. Kultur cellerna i Dulbeccos Modified Eagle's-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin (fullständigt medium) i en 5% koldioxidinkubator vid 37 ° C.
- Vänta tills cellerna är 50-80% konfluenta.
- Ta bort mediet frånbrunnar, tvätta en gång med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS), och tillsätt färskt komplett medium med eller utan (kontroll) 10 nM CLC: CLF-en som visas i figur 1. Inkubera cellerna vid 37 ° C.
- Efter 0 och 5 h inkubation, återställa på medellång och förvara den vid 4 ° C i 1,5 ml rör. Tillsätt sedan 1% Triton X-100 lys-buffert (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0) kompletterat med en proteinasinhibitor cocktail till varje brunn (1 min, 4 ° C). Därefter överför cellysat till 1,5 ml rör (4 C).
- Snurra rören innehållande mediet och cellysat (3000 xg, 3 min, 4 C) och överföra supernatanterna till 1,5 ml rör (4 C). Kassera pellet. Överföring 5 mikroliter av varje cellysat supernatanten till nya 1,5 ml rör - använda dem för att mäta proteinhalten senare (steg 1,7). Omedelbart lägga icke-reducerande LDS provbuffert till alla supernatanterna och skaka proven.
- Använd 5 mikroliter alikvoter för att mäta protEin innehåll i cellysatet supernatanterna med hjälp av en kommersiell proteinanalys enligt tillverkarens protokoll.
- Värm proverna vid 95 C under 5 min.
- Utsätta en lika stor mängd protein från varje prov till reducerande SDS-PAGE 13 och Western-blotting 13 och visualisera innehållet i sorLA, β-aktin, och CNTFRa-Myc i mediet och i cellysaten med hjälp av kanin-anti-sorLA 16 (5 | ig / ml), mus-anti-β-aktin (0,4 | j, g / ml) och mus-anti-Myc (1 | ig / ml) antikroppar och de lämpliga HRP-kopplade sekundära antikroppar (1: 2000).
- Kvantifiera banden genom densitometri enligt tillverkarens protokoll.
2. Immuncytokemi i kombination med Lysosomala hämmare
- Seed HEK293-celler stabilt transfekterade med CNTFRa-Myc / sorLA på täckskivor i en 4-brunnar som visas i figur 2. Odla cellerna i fullmedium enligt ovan.
- Vänta tills cell sammanflödet är 20-40%.
- Avlägsna mediet från brunnarna och tillsätt fullständigt medium med eller utan 50 | ig / ml leupeptin och pepstatin A (leu / pep) (inhiberar lysosomala hydrolaser) till cellerna som visas i figur 2. Inkubera cellerna vid 37 ° C. Mediet måste bytas ut var 6 h under de följande 24 h inkubation.
- Efter 24 h inkubation, återigen byta ut mediet (med eller utan leu / pep) och denna gång tillsätt 10 nM CLC: CLF-en. Inkubera cellerna vid 37 C under 5 timmar.
- Tvätta cellerna en gång i PBS och fixera dem i 4% paraformaldehyd, pH 7 under 15 min vid RT.
Varning: Paraformaldehyd är mycket giftigt, undvika kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Handskar och skyddsglasögon bör användas och skräddarsydda lösningar i ett dragskåp. - Tvätta cellerna en gång i PBS och permeabilisera cellerna under 5 min vid RT i saponin utspädd i PBS (0,5% saponin).
- Utspädd get-anti-CNTFRa (1 | ig / ml) (särskiltinte den mus-anti-Myc som används för Western blotting) och mus-anti-LAMP-1 (15 | ig / ml) antikroppar i 0,5% saponin och inkubera cellerna med antikropparna under 2 h vid RT.
- Tvätta cellerna 4x (5 min) i 0,5% saponin och inkubera cellerna med åsna anti-get Alexa 488- och åsne-anti-mus-Alexa 568-konjugerade sekundära antikroppar (6 | ig / ml) under 2 h vid RT.
- Tvätta cellerna 4x (5 min) i 0,5% saponin, två gånger i avjoniserat vatten (1 min), och montera täckskivor på objektglas med hjälp av montering media.
- Analysera antikroppsfärgning av cellerna genom konfokalmikroskopi med hjälp av en laser-scanning konfokalmikroskop med en 63X C-Apochromat vattenimmersionsobjektiv, NA 1,2.
3. Western blot-detektion av pSTAT3 nivå
- Seed HEK293-sorLA-celler (som uttrycker endogena nivåer av CNTFRa) i en 4-brunnars platta såsom visas i figur 3. Odla cellerna i fullmedium enligt ovan.
- Vänta tillsceller är 50-80% sammanflytande.
- Ta bort mediet från brunnarna, tvätta en gång i PBS, och tillsätta färsk fullt medium med eller utan 10 nM CLC: CLF-1 till cellerna som visas i figur 3. Inkubera cellerna vid 37 C under 5 timmar.
- Avlägsna mediet, tvätta cellerna två gånger i osupplerat DMEM (blank medium; utan FBS och antibiotika), och sedan reincubate cellerna under 90 min (37 ° C) i tomt medium.
- Än en gång, avlägsna mediet och tillsätt färskt tomt medium med eller utan 5 nM CLC: CLF-1 (för att initiera STAT3 fosforylering) som visas i figur 3. Inkubera i 15 minuter vid 37 C.
- Snabbt ta bort mediet och lysering av cellerna (1 min, 4 C) genom tillsats av 1% Triton X-100 lys-buffert (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0) kompletterat med en proteinasinhibitor cocktail och en fosfatasinhibitor cocktail till varje brunn. Därefter överför cellysat till 1,5 ml rör (4 C).
- Transfer 5 mikroliter of varje supernatant till nya 1,5 ml rör - använd dem för att mäta proteinhalten senare (steg 3,8). Omedelbart lägga icke-reducerande LDS provbuffert till alla supernatanterna och skaka proven.
- Mäta innehållet av de 5 mikroliter alikvoter med användning av en kommersiell proteinanalys enligt tillverkarens protokoll protein.
- Sonikera varje prov vid RT tills de inte längre är viskös (ca 1 min) och därefter upphetta dem vid 95 C under 5 min.
- Utsätta en lika stor mängd protein från varje prov för SDS-PAGE 13 och Western-blotting 13 och visualisera innehållet i pSTAT3 och total STAT3 i cellysaten med hjälp av kanin-anti-pSTAT3 (1: 2000) och mus-anti-STAT3 (1: 1000 ) antikroppar och lämpliga HRP-kopplad mus och kanin sekundära antikroppar (1: 2000).
- Kvantifiera banden genom densitometri enligt tillverkarens protokoll.
Representative Results
Figur 1 visar en schematisk representation av cellsådd och CLC: CLF-en inkubation i protokoll 1. Figur 2 visar en schematisk representation av cellsådd och leu / pep och CLC: CLF-en inkubation i protokoll 2. Figur 3 visar en schematisk bild av cellsådd och CLC: CLF-en inkubation och stimulans i protokoll 3. Figur 4 visar sorLA-medierad CLC: CLF-1-beroende nedreglering av CNTFRa. Figur 5 visar den sorLA förmedlad endocytos och lysosomal målinriktning av CNTFRa. Figur 6 visar den nedre svar på CLC: CLF-en stimulering efter CNTFRa nedreglering.
Notera att band som betecknar CNTFRa-Myc har liknande densitet vid tiden noll, medan nedreglering av CNTFRa-Myc demonstreras av den svagare bandet i sorLA transfektanter after 5 timmar (Figur 4). Figur 5 visar att CNTFRa-Myc har ackumulerats i LAMP-1 positiva vesiklar av Leu / pep behandlade celler. Däremot är ingen ackumulering av CNTFRa-Myc ses i celler som inte utsatts för leu / pep behandling. Detta visar att CNTFRa-Myc sorteras till lysosomer och bryts ned. Såsom kan ses i figur 6, är nivån av pSTAT3 signifikant reducerad i förut stimulerade celler jämfört med nivån i celler som inte har exponerats för CLC: CLF-en. Detta är i enlighet med den observerade sorLA-medierad nedreglering av CNTFRa i pre-stimulerade celler (Figur 4).
Figur 1: Schematisk bild av cellsådd och CLC: CLF-en inkubation i protokoll 1. Seed HEK293-CNTFRa-Myc och HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler i två 4-brunnar (0 och 5 h) och inkubera celler med CLC: CLF-en som anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av cellsådd och leu / pep och CLC: CLF-en inkubation i protokoll 2. Seed HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler på täckglas i en 4-brunnar och inkubera celler med eller utan leu / pep och CLC: CLF-en som anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk bild av cellsådd och CLC: CLF inkubation och stimulans i protokoll 3. Seed HEK293-sorLA celler i en 4-brunnar och inkubera celler med eller utan CLC: (. pre-exp) CLF-en att nedreglera CNTFRa följt av CLC: CLF-1-stimulering (. stim) för att initiera STAT3 fosforylering som anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Resultat visar att SorLA förmedlar CLC: CLF-1-beroende nedreglering av CNTFRa. (A) HEK293-CNTFRa-Myc och (B) HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler inkuberades i frånvaro (vita staplar) eller närvaro (grå staplar) av 10 nM CLC: CLF-en. Efter 0 och5 h tillsattes inkubationen stoppas och innehållet av CNTFRa-Myc i mediet (m) och i cellysaten (l) detekterades med Western blotting och kvantifieras genom densitometri. De övre fälten visar Western blot resultat från representativa experiment och de lägre panelerna visar de detekterade nivåer av CNTFRa-Myc finns i cellysat. Nivåerna visas i förhållande till CNTFRa-Myc nivå i enkla och dubbla transfektanter vid 0 h. Varje kolumn representerar medelvärde ± SEM (n = 3). p-värden beräknades med användning av t-test. Återges efter ursprungliga siffran 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:Resultat visar att SorLA förmedlar endocytos och lysosomal målinriktning av CNTFRa. HEK293-CNTFRa-Myc / sorLA celler behandlades med eller utan leu / pep, odlades med 10 nM CLC: CLF-1 under 5 timmar, fast, och slutligen färgas med anti-CNTFRa och anti-LAMP-1-antikroppar som beskrivs i protokoll 2. Skala barer: 5 um. Återges efter ursprungliga siffran 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: SorLA-medierad nedreglering av CNTFRa åtföljs av en sänkt cellulär respons på CLC: CLF-en stimulering.
HEK293-sorLA celler förinkuberades i frånvaro eller närvaro av 10 nM CLC: (. Pre-exp) CLF-en i 5 h, svälta i blank-medium under 90 min, och stimulerades med 5 nM CLC: (. stim) CLF-en i 15 min. (Vänster) Staplarna visar de relativa nivåerna av pSTAT3 i cellerna. Varje kolumn representerar medelvärde ± SEM (n = 3) i förhållande till pSTAT3 nivå i celler förinkuberade i frånvaro av CLC: CLF-en men stimulerade med CLC: CLF-en. p-värdet beräknas med användning av t-test. (Höger) Western blot visar responsen hos pSTAT3 och STAT3 som erhållits i ett representativt experiment. Återges efter ursprungliga siffran 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet som beskrivs här kan användas specifikt för att demonstrera sorLA-medierad CLC: CLF-1-beroende nedreglering och lysosomal målinriktning av CNTFRa, liksom medföljande försvagat svar på CLC: CLF-1-stimulering.
HEK293-cellinje är väl lämpad för detta protokoll, eftersom de har endast en mindre endogen expression av CNTFRa och sorLA, är lätta att transfektera, uttrycka gp130 / LIFRp, och har en stor cellkroppen, som lämpar sig för immuncytokemi. Men i teorin varje cellinje med liknande egenskaper ska fungera lika bra.
Protokollet har två viktiga steg. Den första gäller steg 2,3, i vilken leu / pep mediet måste bytas ut ungefär var 6 h under 24 timmar. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i aktiva lysosomala enzymer och mindre eller ingen påvisbar ansamling av protein i lysosomerna. Den andra kritiska steget (3,4) avser tvätt på förinkubering med CLC: CLF-1. Det är imtigt att avlägsna eventuellt obunden ligand, och att tillåta cellerna tid att återhämta (att undvika fortsatt stimulering) i okompletterat DMEM (tomt medium). Detta kommer att säkerställa en låg bakgrundsnivå av pSTAT3 under efterföljande återstimulering med CLC: CLF-1 (steg 3,5).
Notably, Figur 6 visar att den cellulära responsen (pSTAT3) minskar parallellt med sorLA-medierad nedreglering av CNTFRa. Det bör understrykas dock att även om en minskad respons är i enlighet med (och som kan förväntas på) en minskning av CNTFRa poolen, inte bevisa att den låga CNTFRa uttryck står ensam för den reducerade cellulära svaret. Därför är förändringar - till följd av pre-stimulering eller transfektion - i någon av de funktionella elementen i signaleringsvägen uppströms till pSTAT3 kan ha bidragit till den förändrat svar.
Grundtanken i protokollet är inte begränsad till denna sär-lar receptorsystem. (. Dvs. en annan cellinje, andra antikroppar, andra ligander, etc) genom att modifiera protokollet kan den användas för att bestämma ligand-inducerad nedreglering av andra receptorer samt - oavsett sorLA's engagemang. Emellertid bör det noteras att analys av receptor-nedreglering genom Western blotting är huvudsakligen lämpad för receptorer, t ex GPI-förankrade receptorer, vilka uppvisar en långsam omsättning och en låg grad av ny syntes i ostimulerade celler. Således, i receptorer som uppvisar en hög nivå av ny-syntes, ligand-inducerad nedreglering kan kompenseras genom syntes av nya receptorer. Under dessa omständigheter kan nedreglering av receptorn poolen i stället bestämmas med hjälp av metabolisk märkning och puls-chase experiment som beskrivs i 21. Alternativt joderade antikropparna (företrädesvis Fc-fragment) som inte stör med receptorbindning kan användas för att "märka" ektodomänen av recepteller och den förväntade nedreglering kan sedan bestämmas genom radioaktiv räkning av cellpelleten och medium.
Av logistiska skäl transfekterade vi våra celler med CNTFRa bygga bär en Myc-tag, och i det nuvarande protokollet en mus anti-Myc-antikropp användes för Western blot-detektion av receptorn. Däremot var en get-anti-CNTFRa antikropp som används för immunocytokemi och dubbel märkning som LAMP-1 detekterades genom en mus-antikropp - och uppenbarligen använda av två primära musantikroppar skulle resultera i ospecifika (överlappande) färgning med sekundära antikroppar. Observera att eftersom den get-anti-CNTFRa fungerar även i Western-blotting (ej visade), det protokoll skulle enkelt kunna modifieras och tillämpas på celler transfekterade med omärkt CNTFRa.
Slutligen har det nyligen visats att även den endocytiska receptorn sortilin binder CLC: CLF-en med hög affinitet 22. Sålunda är det tänkbart att sortilin, liksomsorLA, anslutningar till CLC: är CNTFRa via CLF-1 och kunna förmedla endocytos och lysosomal målsökning av CNTFRa också. Använda sortilin stället för sorLA, kan detta protokoll användas för att klargöra denna fråga.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
