Summary
Dans le cœur, les événements moléculaires coordonnent la fonction électrique et contractile de l'organe. Un ensemble de techniques de microscopie de fluorescence de champ locales présentées ici permet l'enregistrement des variables cellulaires dans les cœurs intacts. mécanismes définissant la fonction cardiaque Identifier est essentiel dans la compréhension comment le cœur fonctionne dans des situations pathologiques.
Abstract
Dans le cœur, les études de signalisation moléculaire sont généralement effectuées dans des myocytes isolés. Cependant, de nombreuses situations pathologiques telles que l'ischémie et de l'arythmie ne peuvent être pleinement compris au niveau de l'organe entier. Ici, nous présentons la technique spectroscopique de microscopie par fluorescence de champ local (LFFM) qui permet la mesure de signaux cellulaires dans le coeur intact. La technique est basée sur une combinaison d'un coeur perfusé de Langendorff et des fibres optiques pour enregistrer les signaux fluorescents. LFFM a diverses applications dans le domaine de la physiologie cardiovasculaire pour étudier le cœur dans des conditions normales et pathologiques. les variables cardiaques multiples peuvent être surveillés à l'aide de différents indicateurs fluorescents. Ceux - ci comprennent cytosolique [Ca 2+], le réticulum sarcoplasmique intra-[Ca2 +] et du potentiel de membrane. Les sondes fluorescentes exogènes sont excités et la fluorescence émise détectés avec trois arrangements différents de la technique LFFM épifluorescences présenté dans cet article. Les différences entre ces centrales techniques sont le type de source de lumière utilisée pour l'excitation et sur la façon dont la lumière d'excitation est modulée. Le LFFM pulsée (PLFFM) utilise des impulsions de lumière laser en onde continue LFFM (CLFFM) utilise la lumière laser continu pour l'excitation. Enfin, on a utilisé comme troisième source de lumière des diodes électroluminescentes (DEL). Cet arrangement non cohérent est appelé pulsée microscopie à fluorescence LED (PLEDFM).
Introduction
Le cœur est l'organe central du système cardio-vasculaire. La contraction du coeur est déclenchée par une augmentation intracellulaire [Ca2 +]. La relation entre l' excitabilité électrique et les changements dans le Ca2 + intracellulaire de presse a été historiquement étudié dans les cellules dissociées enzymatiquement 1, 2. Cependant, les cellules cardiaques sont électriquement, métaboliquement et mécaniquement couplés 3, 4. Lorsqu'elle est isolée, les myocytes sont non seulement physiquement découplés, mais myocytes de différentes couches sont mélangés lors de la dissociation 5. En outre, malgré les énormes avantages qui ont émergé de l'étude des cellules isolées dans des conditions de serrage de tension, 6, 7, 8 la nature intrinsèque du cœur comme un syncytium alwa électriqueys pose la question de savoir comment fonctionnellement différentes sont dissociées de celles des cellules présentes dans le tissu 3.
Dans ce manuscrit, nous décrivons les progrès obtenus dans la connaissance de la physiologie cardiaque par l'utilisation de la microscopie à fluorescence de champ local (LFFM) techniques dans le coeur intact. LFFM utilise des indicateurs fluorescents pour mesurer plusieurs variables physiologiques tels que cytosolique Ca 2+, intra réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ et le potentiel de membrane. Ces mesures peuvent être obtenues simultanément et conjointement avec la pression ventriculaire 9, 10, électrocardiogrammes 9, potentiels d'action électriques (AP), les enregistrements actuels ioniques et flash photolyse de composés en cage 4, 11. En outre, ces mesures peuvent être obtenues par la stimulation du coeur intact à des fréquences plus élevées à proximitér aux taux physiologiques. Bien que plusieurs articles 9, 11, 12, 13, 14 ont été publiés par notre groupe en utilisant des techniques de LFFM, la présomption de complexités techniques liées à cette technique a empêché son utilisation massive dans l' étude ex vivo des phénomènes physiologiques dans le cœur et d' autres organes.
La technique de LFFM (figure 1) est basée sur des mesures de épifluorescence obtenues à l' aide d' une fibre optique multimode en contact avec le tissu. Comme toute technique d'imagerie par fluorescence de contact, la résolution optique est fonction du diamètre et de l'ouverture numérique (NA) de la fibre. Un diamètre supérieur et inférieur NA de la fibre augmente la résolution spatiale des mesures. AN et des diamètres de fibres peuvent varier 0,22 à 0,66 et de 50 um à 1 mm. Dansplisser le NA permettra d'améliorer le rapport signal sur bruit (S / N) en acceptant des photons arrivant d'un angle solide plus grande. Afin d'agir en tant que dispositif de épifluorescence, le faisceau lumineux est focalisé dans la fibre optique avec une lentille asphérique ou un objectif de épifluorescence où le NA de la lentille et le match de la fibre. Cette mise en correspondance de maximiser le transfert d'énergie d'excitation et de collecte de retour des photons émis par le fluorophore.
Pour exciter les indicateurs fluorescents exogènes chargés dans le tissu, les différentes sources lumineuses et de modes d'éclairage peuvent être utilisés. Nos études pionnières en utilisant le champ pulsé locale de microscopie par fluorescence 3, 12 (PLFFM) ont utilisé un laser à faible coût picoseconde (figure 1a, PLFFM). Ce type de source de lumière a l'énorme avantage d'exciter une grande fraction des molécules fluorophores sous la zone d'éclairage sans blanchiment sensiblement le colorant dueà l'impulsion courte durées 12. En outre, l'utilisation d'impulsions ultracourtes a permis l'évaluation de la durée de vie de fluorescence du colorant 12. La durée de vie de fluorescence est une propriété qui peut être utilisée pour quantifier la fraction des molécules de colorant liées au Ca 2+. Malheureusement, le sautillement temporelle des impulsions et des variations d'amplitude de l'impulsion à impulsion limiter l'application de cette stratégie expérimentale pour les cas où le changement de fluorescence produite par la liaison au colorant ligand est grande.
Vague (CW) lasers continus sont généralement utilisés comme la principale source d'éclairage dans LFFM (figure 1b, CLFFM). Le faisceau laser peut illuminer le tissu en continu ou peut être modulé ferroélectrique. La modulation du faisceau ferroélectrique permet la génération d'impulsions d'une microseconde de lumière. Cette modulation peut être commandée par le matériel externe. Cette procédure réduit non seulement considérablement til jittering temporel des impulsions lumineuses, mais permet également le mélange des faisceaux de longueurs d'onde différentes. Le mélange des faisceaux est réalisée par multiplexage de différents rayons lasers. En conséquence, plusieurs colorants ayant des propriétés spectrales différentes peuvent être excités pour effectuer des mesures d'une variété de variables physiologiques, par exemple, Rhod-2 Ca2 + cytosolique, MagFluo4 intra-SR Ca 2+ et di-8-ANEPPS pour le potentiel membranaire.
Bien que les lasers présentent divers avantages que la source lumineuse dans LFFM, d'autres types de sources lumineuses peuvent être utilisées, y compris des diodes électroluminescentes (DEL). Dans ce cas, la source de lumière d'excitation est composée d'une LED InGaN (Figure 1c, PLEDFM). Dans les LED, les photons sont émis spontanément lorsque les électrons de la bande de conduction recombinent avec des trous dans la bande de valence. La différence avec les lasers à l'état solide est que l'émission ne soit pas stimulée par d'autres photons. Il en résulte un faisceau non cohérent etune émission spectrale plus large pour les LED.
Différents types de LED haute puissance peuvent être utilisés. Pour les enregistrements AP en utilisant Di-8-ANEPPS et pour Ca2 + transitoires enregistrés en utilisant Fluo-4 , ou en alliage d'aluminium -Fluo-4, on utilise une diode électroluminescente qui présente une émission de crête typique à 485 nm (bleu) et une demi - largeur de 20 nm (Figure 1d). Pour Ca 2 + transitoires enregistrées avec Rhod-2, la LED a eu un pic d' émission typique à 540 nm (vert) et une demi - largeur de 35 nm (figure 1d). LED émettent dans une longueur d'onde de la bande et nécessitent donc des filtres pour affiner leur émission spectrale. En outre, la lumière puisée peut être généré à un débit de 1,6 kHz avec une durée de 20 ps. Les LEDS ont été puisées avec un transistor à effet de champ MOSFET de puissance rapide. des enregistrements simultanés avec différents indicateurs peuvent être effectués par multiplexage temporel des diodes électroluminescentes. Malheureusement, la lumière émise par les LED est plus difficile de se concentrer sur une fibre optique par rapport à un faisceau laser. Ainsi, le principal inconvénient de nousing LED est que leurs profils d'émission ont des déplacements angulaires (± 15 °) de l'axe principal, et un élément optique auxiliaire doit être utilisé pour la corriger.
Dans toutes les configurations optiques décrit précédemment, la lumière d'excitation est réfléchie à l'aide d'un miroir dichroïque. Le faisceau est ensuite focalisé par une lentille asphérique et un objectif de microscope sur une fibre optique multimode qui est positionné sur le tissu. Comme dans tout dispositif d'épifluorescence, le miroir dichroïque sert également à séparer l'excitation de la lumière émise. Le spectre de la lumière émise se déplace à travers un filtre de barrière pour éliminer toute excitation réfléchie. Enfin, la lumière émise est focalisée avec un objectif sur un photodétecteur (Figure 1).
La transduction de la lumière au courant électrique est effectuée par des photodiodes à avalanche de silicium. Ces diodes ont une réponse rapide et une sensibilité élevée permettant la détection de faible luminosité. lephotocourant produit par les photodiodes à avalanche peut être amplifié de deux manières: un amplificateur à transimpédance comportant un élément de contre- réaction résistif (figure 1E) , soit par un intégrateur pour convertir le courant en une tension (figure 1f). En utilisant la première approche, la tension de sortie est proportionnelle au courant photoélectrique et de la résistance de rétroaction. Un exemple typique de la détection de résistance de picosecondes impulsions laser est représenté sur les figures 2a, 2b et 2c. Panneau 2a illustre la sortie de l'amplificateur à transimpédance et le panneau 2b montre une expansion temporelle de l'intervalle indiqué par un astérisque (*). Un algorithme de suivi de pic a été mis en oeuvre pour détecter le pic (rouge) et la base (vert) pour les réponses fluorescentes 12. La mesure de la fluorescence de base fournit des informations à la fois du courant d'obscurité de la photodiode à avalanche et les interférences introduites par lig ambianteht et le couplage électromagnétique. Une représentation de sommets et bases est représentée sur la figure 2c. Cette figure illustre la fluorescence émise par le colorant (Rhod-2) lié à Ca 2+ au cours du cycle cardiaque d'un cœur battant perruche.
Dans le second procédé, la tension de sortie de l'intégrateur est une fonction de la rétroaction de courant et capacitif (figures 2d, 2e et 2f). La figure 2f montre deux cycles d'intégration consécutives: la première sans l' éclairage extérieur et la seconde avec des impulsions de lumière appliquées à partir d' une diode pulsée. Une description détaillée est présentée dans les figures 2g et 2h. Cette approche, bien que plus laborieuse, fournit un rapport S / N plus grand en raison de l'absence de bruit thermique dans le condensateur de rétroaction. L'instrument comprend une étape de synchronisation qui génère tout le contrôle et le multiplexage de la lumière d'excitation et commande l'intégration et headstage respériodes et. Ceci est habituellement réalisé avec un circuit numérique de traitement du signal qui effectue également une différenciation numérique du signal intégré de sortie en calculant une régression en ligne des données. Dans le cas d'utilisation d'une rétroaction résistive, toute A / D acquisition carte peut être utilisée.
Enfin, notre technique de LFFM est très polyvalent et peut être adapté à enregistrer à partir de plus d'une région. Ajout d'un diviseur de faisceau dans le trajet de la lumière nous permet de diviser la lumière en deux fibres optiques. Chaque fibre optique peut ensuite être placé sur différentes régions d'un tissu à, indépendamment, exciter et enregistrer les émissions des sondes fluorescentes exogènes. Cette modification nous permet d'évaluer dans quelle mesure les différences anatomiques régionales influencent les variables physiologiques. La figure 3 montre un diviseur de faisceau étant utilisé pour diviser la lumière d' excitation CW de telle sorte que deux fibres optiques sont utilisés pour mesurer transmural intracellulaire électrique ou [Ca 2+] niveaux d' esprith mineur-invasivité. transmurale signaux peuvent être enregistrés en plaçant une fibre sur l'endocarde et l'autre sur la couche d'épicarde de la paroi ventriculaire. Par conséquent, la technique de LFFM a la capacité de mesurer l'évolution temporelle des signaux cellulaires dans des régions différentes et peut être utilisée pour tester si des changements se produisent dans la région des situations pathologiques.
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Protocol
Ce protocole et toutes les manipulations de souris a été approuvé par le Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité UC Merced (n ° 2008-201). Des expériences avec des perruches ont été menées en 1999 selon les conditions générales pour l'utilisation des animaux établie par la commission scientifique de l'Institut vénézuélien de recherche scientifique (IVIC).
1. Langendorff Set Up Préparation
- Préparer une solution Tyrode contenant les concentrations de soluté suivantes en mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucose, 10 HEPES. Ajuster le pH de la solution de Tyrode à 7,4 avec NaOH et on filtre la solution à travers un filtre de 0,22 um.
- Chargez la solution Tyrode dans les seringues 60 ml et tous les tubes du Langendorff horizontal set-up 11, 12 illustrée à la figure 4. Assurez-vous d'éliminer toutes les bulles d'air.
- Connecter le tuyau en plastique à un réservoir O 2.
- Ajouter un T-adaptateur en plastique pour abaisser un "tube 5 dans la solution Tyrode dans la seringue de 60 ml.
- Fixer une pierre d'air en plastique à la fin du "tube 5 de manière O 2 fera des bulles dehors dans la solution Tyrode.
- Placer une suture chirurgicale non résorbable autour d'une aiguille utilisée comme une canule. L'aiguille est couplée au collecteur (voir la figure 4) qui permet de rétro-perfusion avec des solutions différentes. Enfin, l'aorte du coeur sera canulée dans l'aiguille.
2. Préparation des animaux et Coeur Dissection
- Peser et injecter la souris avec de l'héparine (ex. Souris de poids de 20 g, injecter 20 unités ou 200 pi) 15 min avant euthanasier par dislocation cervicale. Anesthésier perruches selon to les guides d'utilisation des animaux de votre protocole IACUC et procèdent ensuite à la dislocation cervicale.
NOTE: Utiliser 8 semaines souris ou 20 g perruches. - Retirer le cœur de la cavité thoracique après l' euthanasie. Extraire les cœurs perruche exactement de la même manière que celle décrite pour la souris.
- Nettoyez la poitrine de la souris avec de l'éthanol.
- Avec des ciseaux de dissection, faire une incision dans l'abdomen inférieur, puis couper les côtés vers le cou.
- Tirez le tissu coupé et la broche vers le bas.
- Couper le diaphragme. Soyez prudent lors de la coupe du diaphragme pour éviter d'endommager le cœur.
- Retirez les poumons et les tissus environnants.
- Utilisez des pinces pour ramasser le cœur sans presser. Couper l'aorte aussi longtemps que possible.
- Transporter le coeur sur une petite balance bateau avec environ 1 solution Tyrode mL.
- L'utilisation d'une suture chirurgicale non résorbable, attacher l'aorte sur l'appareil de Langendorff horizontal via unaiguille. Attachez l'aorte cardiaque à l'aide de deux pinces fines. Commencer rétro-perfusion en ouvrant la vanne située en série avec les seringues de 60 ml contenant une solution de Tyrode.
- Laisser le coeur se stabiliser pendant 10 min. Utiliser ce temps pour nettoyer le sang et le tissu adipeux entourant le coeur avant le chargement du colorant. Tirez le tissu adipeux près de la base du cœur avec des pincettes et couper à l'aide de petits ciseaux de dissection. Assurez-vous de le faire sous la vue d'un microscope à dissection.
3. cytosoliques Ca 2+ Mensurations: Préparation Dye Rhod-deux heures
- Ajouter 20 ul de 20% de Pluronic (un agent tensio-actif non ionique) dans le DMSO dans un flacon en plastique emballé spécial fourni par le fabricant de colorant contenant 50 pg de colorant.
- Mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, en évitant les bulles.
- Transférer le DMSO mélangé avec l'agent tensioactif non ionique et le colorant du flacon en plastique emballé spécial dans un flacon en verre transparent. Ajouter 1 mL de Tyrode solution dans le flacon de verre transparent.
- Soniquer pendant 15-20 min dans un bain de sonication.
- Perfuser le colorant en utilisant des pompes péristaltiques pendant 30 min à température ambiante.
- Placer le colorant dans la chambre de teinture.
- Utiliser un dispositif de serrage mécanique pour comprimer toutes les autres lignes de tubes reliés au collecteur. La pince est placée au-dessus du collecteur. Cela permettra d'éviter tout retour dans le tube relié à la seringue de 60 ml.
- Allumez la perfusion pompe péristaltique pour commencer la circulation du colorant. fermer immédiatement la vanne 3 voies en dessous de la seringue de 60 ml.
- Placer un petit tube qui est relié à l'aspiration de la pompe péristaltique à côté du coeur pour faire recirculer le colorant qui a été perfusé dans le coeur.
4. Intra-SR Ca 2+ Mensurations: Préparation Dye Mag-Fluo4AM
- Préparer Mag-Fluo4AM de la même manière que Rhod-deux heures. Reportez-vous à la section 3 pour des instructions étape-sage.
- after charger le colorant, ouvrir la vanne située en série avec les seringues de 60 ml contenant une solution Tyrode pour commencer rétro-perfusion. Veillez à retirer la pince au-dessus du collecteur.
- Ajouter une solution de Tyrode à la chambre horizontale et réchauffer à 37 ° C.
- Retro-perfuse avec une solution Tyrode pendant 45 min pour éliminer le colorant cytosolique.
5. Mesures membranaires potentiels: Préparation Dye Di-8-ANEPPS
- Ajouter 5 ml d'éthanol à 99% dans le flacon de teinture qui contient 5 mg de colorant.
- Aliquote de 10 pi dans 500 individuels 1 ml des flacons en plastique à l'aide d'une pipette à répétition.
- Dessécher dans un vide de vitesse et conserver à -20 ° C.
- Ajouter 20 ul de 20% de pluronic dans du DMSO dans un flacon en plastique avec 10 ug de colorant déshydraté.
- Mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, en évitant les bulles.
- Transférer le mélange contenant du DMSO en présence de Pluronic et le colorant dans le flacon en plastique dans un cylindre gradué (10 ml). Ajouter une solution de Tyrode à un vo finalelume de 5 ml.
- Soniquer pour 20-25 min dans un bain de sonication.
- Perfuser dans le coeur pendant 30 minutes en utilisant des pompes péristaltiques. Consulter les instructions pas à pas dans la section 3.5.
6. Enregistrement des signaux épicardiques
- Après le chargement du colorant, rétro-perfuser le coeur avec une solution Tyrode en retirant la pince au-dessus du collecteur. Ouvrir la vanne située en série avec la seringue de 60 ml contenant une solution de Tyrode. une solution de Tyrode rétro perfuse pendant 10 minutes pour stabiliser le coeur.
- Remplir la chambre horizontale avec une solution Tyrode et tourner sur l'unité de peltier pour amener la température du bain à 37 ° C.
- Positionner la fibre optique sur la surface du coeur.
- Placez la fibre optique à l'intérieur d'une pipette 2 ml, puis fixez la pipette à un micromanipulateur.
- Utilisez le micromanipulateur appuyer légèrement sur la fibre optique contre la surface de la LV.
- Extérieurement arpenter la heala température ambiante avec un stimulateur commandé par un générateur d'ondes.
- Programmer le générateur d'ondes pour fournir une impulsion carrée avec une largeur de 1 ms.
- Réglez le stimulateur pour être synchronisé extérieurement et connecter l'entrée externe au générateur d'ondes.
- Pour chaque sortie du stimulateur, connecter un fil à une aiguille d'acupuncture soudée à la fin.
- Placer les deux aiguilles d'acupuncture dans la pointe du coeur d'environ 3 mm les unes des autres.
- Seulement après que les aiguilles sont placées dans le tissu, tourner sur la sortie du stimulateur pour éviter un choc électrique.
- Dans le logiciel d'acquisition, d'ajuster la fréquence d'acquisition à 10 kHz.
7 . Enregistrement des signaux endocardique
- Reportez-vous à l'étape 6.1 et 6.2 pour stabiliser le coeur après le chargement du colorant.
- En utilisant un point 23Ga forte de la taille de la fibre optique, faire un petit trou dans la surface du cœur dans le LV près du septum. <li> Placer un adaptateur intravitréenne chirurgie de sclérotomie pour faciliter le positionnement de la première fibre optique dans l'endocarde au moyen d'un micromanipulateur.
- Extérieurement le rythme du cœur. Reportez-vous à l'étape 6.4.
- Dans le logiciel d'acquisition, d'ajuster la fréquence d'acquisition à 10 kHz.
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Representative Results
AP et Ca 2 + transitoires dans l' endocarde et l' épicarde
Afin de comparer les signaux à travers la paroi ventriculaire, une fibre optique est positionnée dans l'endocarde et l'autre dans l'épicarde. La comparaison de la morphologie d'un point d'accès enregistré à partir de l'endocarde de l'un de l'épicarde est la meilleure façon d'évaluer la fonction transmurale. La paroi ventriculaire est très hétérogène et, par conséquent, la morphologie des points d'accès sont très différentes dans ces deux régions. Il est bien connu que l'endocarde a moins I que l'épicarde 17, 18, 19. Le moins I rend la repolarisation de la phase 1 plus lente dans l'endocarde 18, 20. Figure 5b shOWS un enregistrement optique typique de l'AP de l'endocarde et l'épicarde. Pour effectuer ces enregistrements, les cœurs de souris ont été chargées avec le colorant potentiométrique di-8-ANEPPS et la fluorescence a été mesurée en utilisant la technique CLFFM. La morphologie de l'AP optiquement enregistrée, en particulier dans la phase 1, montre un cours plus lent de temps pour l'endocarde (Potentiel d' action Durée (APD) 30 est 8.01 ms ± 2,5) par rapport à épicarde (3,4 ms ± 0,59) (figure 5b). En général, le TTA peut être décrit comme étant le temps que prend le point d' accès à un certain pourcentage repolariser comprenant 30, 70 ou 90 (figure 5a). Ces traces ont été normalisées et décalée pour avoir la phase de chevauchement 0. Lorsque l'on compare les APDs (Figure 5c), nous voyons que l'endocarde et l' épicarde sont significativement différentes au cours de la phase 1. Bien que ces points d' accès sont des signaux de fluorescence, ils peuvent être étalonnés à un particulier le potentiel de membrane en mesurant simultanément l'AP avecmicroélectrodes forte remplie de 3 M KCl 13.
En plus de potentiel de membrane, des indicateurs fluorescents exogènes peuvent être utilisés pour surveiller intracellulaire [Ca2 +]. En règle générale, nous utilisons Rhod-deux heures pour mesurer intracellulaires Ca 2 + transitoires en raison de sa gamme dynamique élevée et sa capacité à rester dans le cytosol même à des températures physiologiques. La figure 6b montre un enregistrement typique des transitoires de Ca2 + intracellulaire dans la couche d'endocarde et d' épicarde. Ces résultats ont été partiellement publiée 15. Afin de comparer les différences régionales dans l'intracellulaire [Ca 2+] niveaux, la cinétique des Ca 2 + transitoires ont été évalués (figure 6a). Dans l' ensemble, l'analyse des Ca2 cinétiques transitoires (Figure 6c) montre que les Ca 2 + transitoires de l'endocarde avaient signifificativement cinétique plus lente que celles enregistrées à partir du épicarde.
Ca2 + dynamique dans la lumière du SR
Dans le cœur, la montée et la chute de intracellulaire [Ca 2+] niveaux sont essentiels dans la définition de variables physiologiques , y compris la pression, la contractilité, et durée potentielle d' action (APD). La section précédente décrit notre capacité à mesurer les cytosolique Ca 2 + transitoires. Le Ca 2+ libéré de la SR est en grande partie responsable de la hausse des intracellulaires cytosolique Ca 2+. Ainsi, pour chaque augmentation du Ca2 * intracellulaire existe un Ca2 + appauvrissement de la SR. Cependant, cytosolique Ca 2 + transitoires ne sont pas uniquement due à SR Ca 2+ libération, mais également Ca 2+ entrant dans la cellule à travers la membrane plasmique. Notre laboratoire16 a été en mesure d'évaluer la teneur en Ca2 + SR par l'utilisation d'un colorant fluorescent, Mag-Fluo-quatre heures. Bien que ce colorant est désestérifié dans le myoplasme et la SR, les myocytes peuvent extruder la fraction cytosolique. Ce profilé de colorant peut être favorisée par une simple augmentation de la température à 37 ° C. A cette température, le colorant cytosolique est éliminé par une cassette d'ATP-binding protéine de type membranaire. Heureusement, cette protéine est absente dans la membrane SR. Par conséquent, après avoir augmenté la température à 37 ° C, la fluorescence enregistré en utilisant la technique de PLFFM est principalement le résultat du Ca2 + se liant au colorant à l' intérieur de la SR. Afin de tester la spécificité de la mesure d' un organite, une impulsion de caféine a été appliquée pour stimuler la libération de Ca par RyR. Il est possible d'observer que le signal est en effet à la suite de l'épuisement de SR (figure 7). La caféine induite par SR Ca 2+ libération (figure 7a) Produire à la fois une diminution de la pression diastolique de Mag-Fluo-4 fluorescence (92 ± 0,05% (n = 4, p = 0,012)) et une diminution de l'amplitude des transitoires de Ca2 + (51 ± 0,21% (N = 4, p = 0,003)) 16. SR intra traces enregistrées avant et après le stimulus de la caféine sont représentés vers le bas sur la figure 7b à 7d. Au fil du temps de la stimulation de la caféine, de l'amplitude de l'appauvrissement de SR est plus petite. La figure 7e montre que l' épuisement SR induit non seulement une diminution de l'amplitude du signal Ca2 + mais ralentit le Ca2 + processus de libération SR. La trace de fluorescence dans la figure 7a a été publié précédemment 15.
Pulsée LED: Les potentiels d'action
Dans la figure 5 , nous avons montré que Di-8-ANEPPS peut signaler les changementsdans le potentiel de membrane quand elle est excitée à 532 nm. Sous cette condition d'excitation, on observe une diminution de la fluorescence émise à la longueur d'onde supérieur à 590 nm. Fait intéressant, lorsque ce colorant potentiométrique est excité à proximité de sa longueur d'onde d'excitation maximale (~ 476 nm), l'émission de fluorescence des décalages de colorant vers des longueurs d'onde de plus faible lorsque la dépolarise la membrane. Par conséquent, ce décalage spectral nous permet d'enregistrer la fluorescence émise à deux longueurs d'onde différentes. Cette propriété spectrale de Di-8-ANEPPS permet le rationnement de la fluorescence émise enregistrée à deux longueurs d'onde différentes, une caractéristique qui est habituellement d'une grande valeur, car l'enregistrement calculée finale sera indépendante de la concentration de colorant dans la membrane. Afin de tirer pleinement parti du décalage spectral Di-8-ANEPPS, nous avons utilisé des LED à impulsions comme source de lumière. Nous avons utilisé la lumière bleue pulsée pour exciter le fluorophore. L'excitation a été réalisée à 485 nm, à proximité de la longueur d'onde de di-8-A pic d'absorptionNMP (~ 476 nm). Acquisition en deux bandes d'émission spectroscopiques différentes permet la formation du rapport et de la capacité d'augmenter S / N et rejeter le bruit de mode commun, comme la lumière de l'environnement et artefacts de mouvement dans les cœurs où le découpleur blebbistatin mécanique n'a pas été utilisé contractante. Cette situation est très importante pour les conditions expérimentales où à la fois l'activité mécanique du coeur et de la cinétique de Ca2 + transitoire doivent être mesurés simultanément.
Le chronogramme de la PLEDFM est illustrée sur la figure 8a. Le diagramme comprend la logique de commande pour l'intégration et remise à zéro du headstage de photodétection, le temps de marche-arrêt de la diode électroluminescente et la conversion analogique-numérique. Au cours de l'évolution temporelle d'un point d'accès, la fluorescence détectée dans la bande de longueur d'onde verte indique une augmentation de l'intensité alors que la fluorescence détectée dans la bande rouge diminue. La figure 8B montreque la modification du signal de fluorescence produite par la dépolarisation de la membrane se déplace dans des directions différentes. Cependant, l'artefact de mouvement produit par la contraction du coeur est toujours orienté dans le même sens, indépendamment de la longueur d'onde d'émission. Comme expliqué précédemment, les données des deux canaux (vert et rouge) doivent être un logiciel conditionné avant de calculer le rapport. Le conditionnement comprend décalage et de gain corrections. La sélection des corrections de niveau décalage et de gain est pas automatique. L'utilisateur du logiciel doit sélectionner les variables à l'état de traces avant le rapport. Le rapport résultant dans le panneau 8b (figure 8) montre que l'artefact introduit par le mouvement du myocarde a annulé.
La variation relative de la fluorescence di-8-ANEPPS lors d'une AP est généralement très faible (~ 8% par 100 mV). Cette di-8-ANEPPS changement de fluorescence est beaucoup plus petite que celle produite par le Ca2 + binding à Rhod-2 (<200%). Ainsi, afin d'augmenter le rapport signal sur bruit du di-8-ANEPPS, plusieurs enregistrements peuvent être moyennées.
Pulsed LED: enregistrements simultanés de Ca 2+ et le potentiel de membrane
Le dernier objectif en utilisant cette approche expérimentale consiste à effectuer des enregistrements simultanés de Ca 2 + transitoires et les points d' accès. enregistrements simultanés de multiples signaux physiologiques nécessitent la résolution des difficultés techniques liées aux différents aspects du système, y compris: le couplage de la source de lumière avec la fibre optique, correspondant au spectre du colorant d'absorption avec l'émission des LED, la conception analogique et circuit électronique numérique générer la synchronisation et l'acquisition ainsi que le développement de logiciel rapide pour analyser les données en ligne.
Dans ousEtude de r, le choix des colorants dépend de leurs caractéristiques spectrales. Flourophores utilisés pour mesurer les signaux divers doivent absorber dans différentes bandes spectrales. Cette condition est essentielle pour distinguer entre les sources de signal. Chaque fois qu'une diode ayant une longueur d'onde différente est utilisée pour exciter le tissu, la fluorescence détectée correspond au signal associé avec le colorant absorbant dans cette longueur d'onde. De cette façon, l'émission de fluorescence provenant de différents colorants, mais dans la même bande de longueurs d'onde, peut être distinguée par l'heure à laquelle chacun d'eux est excité.
Néanmoins, la diaphonie entre les spectres de colorant ne peut pas être complètement évitée. En effet, les caractéristiques d'absorption spectrale des colorants qui absorbent la lumière en font des longueurs d'onde éloignées de leur pic d'absorption. Dans nos expériences, la diaphonie a été réalisée de deux façons: (1) Rhod-2 étant excité par la DEL bleue, en ajoutant un signal de Ca2 + au rouge channel AP trace, et (2) Di-8-ANEPPS étant excité par la LED verte, qui apparaît sur le Ca 2+ signal transitoire (Figure 9f). Cette diaphonie peut être corrigé en ligne, comme cela est illustré sur la figure 9. La procédure fonctionne parce que le signal intrus est un petit pourcentage du signal qui doit être mesuré. Enfin, en utilisant ce type de traitement algébrique du fluorecence parmi les colorants nous a permis de séparer l' AP (figure 9d) forment les transitoires de Ca2 + (figure 9H). Un aperçu détaillé de ce traitement est décrit dans la légende de la figure. Il est important de noter que toutes les expériences LED pulsée ont été réalisées un 28 ° C.
Figure 1: Champ local Fluorescence Microscopy (LFFM). Le LFFM se compose d'un agencement à épifluorescenceen utilisant une fibre optique multimode qui est en contact avec le tissu pour enregistrer la fluorescence émise par les colorants exogènes perfuses dans le coeur. Le LFFM set-up peut utiliser trois sources lumineuses différentes , y compris (a) PLFFM, où la lumière d'excitation est fourni par un pico laser pulsé Nd-Yag; (B) CLFFM, lorsque les lasers à ondes continues sont utilisées et les impulsions lumineuses sont générées par un modulateur ferroélectrique permettant le multiplexage des lasers de longueurs d' onde différentes; et (c) PLEDFM, où les LED ayant plus larges spectres d'émission avec des émissions de pointe de (d) 485 nm et 540 nm pour les LED bleues et vertes, respectivement, sont pulsée électroniquement. Lorsque les sources laser sont utilisés, le faisceau est défocalisé par un élargisseur de faisceau. Enfin, les miroirs dichroïques et des lentilles de focalisation focalisent le faisceau sur l'extrémité distale de la fibre optique qui est légèrement pressé contre le tissu. La lumière émise se déplace à travers la même fibre optique, miroir dichroïque, emiles filtres de fission, et est focalisé sur une photodiode à avalanche où les photons sont convertis en un courant électrique. Le courant peut être amplifié par deux procédés (e) de l' amplificateur de transimpédance, dont la tension de sortie résultante est proportionnelle au courant photoélectrique et de la résistance de rétroaction; (F) de l' intégrateur, dont la tension de sortie est fonction de la rétroaction de courant et capacitif. Enfin, le signal est acquis par un convertisseur A / D et visualisées sur un ordinateur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: résistive et conversion capacitive. (A) Un exemple typique de la détection de résistance de picosecondes impulsions laser est représentée. L'astérisque (b)représente un intervalle de temps étendu, où un algorithme de suivi de pic a été mis en oeuvre pour détecter le pic (rouge) et la base (vert). (C) Une représentation de traces calculées à partir des pics et des bases des enregistrements est indiqué pour Rhod-2 réponses fluorescentes dans une perruche cœur battant à l' extérieur rythme à 7 Hz et la température du bain mis à 37 ° C. d à h) Le photocourant converti par un intégrateur utilisant une rétroaction capacitive. Enregistrements typiques de coeur de la souris intacte Ca 2 + transitoires sont présentés dans deux différentes échelles de temps (d et e). (F) L'intégration de deux cycles consécutifs avec et sans éclairage LED sont affichés. L'intégrale du signal augmente linéairement à mesure que le photocourant charge le condensateur de rétroaction. La pente de l'intégrale dépendante du temps (tg (ɵ)) est proportionnelle au nombre de photons impactant la jonction d'avalanche, en plus de la recombinaison électron-trou induite par la pactivité hononic lorsque la diode d'avalanche ne détecte pas de photons. Les signaux numériques contrôlant l' intégration de headstage et réinitialiser les périodes sont présentés dans le panneau g. Les signaux détectés au cours de la période de non-éclairage (DC) et LED d' éclairage (F) sont indiqués dans le tableau h. La soustraction de courant continu F et fournit la mesure réelle de la fluorescence détectée transitoires de Ca2 + provenant de souris stimulés coeurs extérieurement à 9 Hz à 37 ° C (h). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: LFFM pour Epicardium et mesures endocarde. Le CLFFM set-up a été utilisé pour mesurer la fluorescence émise par les colorants fluorescents exogènes présents dans l'un de épicarded couches endocarde. L'addition d'un diviseur de faisceau a facilité l'enregistrement de différentes variables physiologiques dans l'épicarde et l'endocarde. Deux fibres optiques ont été utilisés avec leurs headstages individuels pour détecter de l'épicarde et endocarde. Une petite incision circulaire a été faite dans le ventricule et une fibre optique est enfilée dans un enregistrement à partir de l'endocarde. Ce set-up utilisé un convertisseur courant-tension avec une rétroaction résistive. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Chambre horizontale avec contrôle de la température. Un diagramme montrant la Langendorff set-up où les cœurs intacts sont maintenus fonctionnels pendant des heures. Le coeur est attachée à une aiguille à travers laquelle toutes les solutions et colorantssont rétro-perfusé dans le cœur via les coronaries bifurquant l'aorte. La chambre est positionnée au-dessus d'une unité à effet Peltier pour maintenir la température du bain, qui est lu par un capteur de température relié à un voltmètre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Transmural action Mesures potentielles dans les coeurs intacts. (A) la durée du potentiel d' action (APD) est évaluée comme le temps qu'il faut pour terminer 30%, 70%, ou 90% de la repolarisation AP. (B) Di-8-ANEPPS fluorescence du épicarde (noir) et endocarde (gris) montrent AP différences morphologiques dans repolarisation entre les deux couches de la paroi ventriculaire. (C) Après avoir évalué til Apd 30, 70, et 90 dans l'endocarde et l'épicarde, les résultats montrent que des différences significatives ont eu lieu dans 30 APD (8 ± 2,5 ms endocarde vs 3 ± 0,6 ms épicarde). Coeurs ont été stimulés à 6 Hz et la température réglée à 37 ° C. Les données sont la moyenne ± SEM de 5 coeurs. * P <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Transmural Ca 2+ Mesures transitoires dans les coeurs intacts. (A) Les paramètres de Ca 2+ cinétiques transitoires mesurés sont: le temps qu'il faut pour atteindre un maximum, le temps de pic (TP); le temps nécessaire pour passer de 10% à 90% de la montée, temps de montée (RT); le temps qu'il faut pour aller de 10% à 90% de la désintégration, temps de décroissance (DT); et lele temps nécessaire pour terminer 50% du transitoire, la moitié de la durée (HD). (B) Fluorescence émise par Rhod 2 après excitation avec une CW show laser épicarde vert (noir) et endocarde (gris) Ca 2 + transitoires avec des différences de relaxation. c) Ca 2 + transitoires de l'endocarde avait une cinétique sensiblement plus lente en RT, TP, HD, et DT que ceux enregistrés à partir de l'épicarde. Coeurs ont été stimulés à 6 Hz et la température réglée à 37 ° C. Les données sont la moyenne ± SEM de 5 coeurs. * P <0,05. Modifié à partir de Mattiazzi et al. 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: SR Mesures Intra Ca 2+ dans les coeurs intacts.(A) La fluorescence émise par le Mag-Fluo-4 colorant diminue au fil du temps, ce qui reflète une diminution de la concentration SR intra Ca 2+. (B) La vision élargie de la diminution de Mag-Fluo 4 fluorescence indiquant Ca 2+ déplétion induite par Ca 2+ libération de la SR. (C) Une vision élargie de la diminution de l'amplitude transitoire de Mag-Fluo 4 fluorescence représentant Ca 2+ libération modifiée par perfuser coeurs avec mM de caféine 20. (D) Après une longue application de caféine, soit une diminution à la fois du niveau diastolique de Mag-Fluo-4 fluorescence et de l'amplitude des transitoires de Ca2 + [jusqu'à 92 ± 0,05% (n = 4, p = 0,012) , et 51 ± 0,21% (n = 4, p = 0,003) des valeurs initiales, respectivement], est observée. À mesure que le temps passe à partir de la caféine, la plus petite est l'amplitude de l'épuisement SR. (E) des traces Normalisé en bd montre que l' épuisement SR non seulement induires diminue du signal Ca 2+ , mais ralentit également SR Ca 2+ reconstitution. Coeurs ont été stimulés à 4 Hz et la température réglée à 37 ° C. Fluorescence trace est de Kornyeyev et al. 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: Mesures Ratiométrique de points d' accès dans les cœurs intacts avec pulsée LED. (A) Le diagramme de synchronisation incluant l' intégration et remise à zéro du headstage, on-off fois de la LED et un enregistrement réel est illustré. (B) Les traces des deux canaux ont des valeurs de repos et le décalage est corrigé en déplaçant les leviers jusqu'à ce que chaque AP est précédée d'une valeur de repos. Gain de chaque canal est également adjusted. Notez qu'un très grand artefact de mouvement apparaît sur les deux canaux entre les deux dépolarisations. Une fois le logiciel traite les signaux ratiometrically, le résultat est un point d'accès sans artefacts visibles (bleu). Coeurs ont été stimulés à 3 Hz et la température réglée à 28 ° C. Tous les enregistrements affichés sont une moyenne de 10 traces. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9: simultanées Ca 2+ Transitoires et mesures AP dans les coeurs intacts avec pulsée LED. La contamination de la diaphonie des signaux lors de l' enregistrement à la fois Ca 2+ et AP peut être corrigée en ligne. Le colorant potentiométrique, di-8-ANEPPS, est excité avec 20 ms impulsions de LED bleues (a). Les signaux sont split, filtrée avec du rouge passe-bande et filtres verts. Ces signaux sont détectés par deux photodiodes à avalanche différents indiqués comme le rouge (b) et le canal vert (c). Il est possible d'observer que les deux signaux, rouges et verts, présentent un artefact de mouvement notable qui apparaît comme une déviation vers le bas. Les deux signaux, rouge et vert, sont excentrée puis amplifiés. Les signaux conditionnés sont utilisés pour calculer le rapport entre eux et le résultat est représenté en d. Il est possible d'observer que , dans le rapport entre les deux signaux (d) les objets en mouvement sont annulés. Panel e illustre la séquence d'impulsions logiques qui contrôlent une LED émettant dans le vert utilisé pour exciter l'indicateur Ca 2+ Rhod-2. Les signaux fluorescents obtenus à l' aide de cette procédure sont présentés dans f. Bien que la trace dans le f représente la plupart du temps une augmentation du signal de fluorescence due à la bindin Ca2g à Rhod-2, il est également possible d'observer une déviation négative dans la trace en raison d'un signal détecté par fluorescence de Di-8-ANEPPS lorsque ce colorant est excité par la lumière verte. Ce problème peut être corrigé en soustrayant le signal potentiométrique représenté en g. Le résultat de la soustraction est représentée dans le panneau h lorsqu'un Ca2 + signaler libre d'une contamination AP est obtenue. Coeurs ont été stimulés à 3 Hz et la température réglée à 28 ° C. Tous les enregistrements affichés sont une moyenne de 10 traces. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce document est centré dans la description des techniques de fluorescence de terrain locales pour évaluer la fonction des myocytes cardiaques ex vivo. L'étude de ces cellules dans un milieu couplé est non seulement plus physiologique, mais il est également très appropriée pour évaluer les pathologies au niveau de l'organe. Les événements cellulaires sous - jacents couplage excitation-contraction (ECC) peuvent être évalués au niveau de l' organe entier avec l'utilisation de sondes moléculaires qui contrôlent intracellulaires Ca 2+ dynamique (Rhod 2 cytosolique Ca 2+, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) et activité électrique (di-8-ANEPPS). Ici, nous avons présenté trois techniques LFFM à épifluorescence que les deux excitent et de recueillir l'émission à partir d'indicateurs fluorescents à l'aide de fibres optiques. Ils diffèrent en fonction de la source lumineuse utilisée et le type de modulation de la lumière. Le PLFFM utilise un laser que les impulsions de lumière, CLFFM utilise la lumière laser continu, tandis que LEDFM utilise des LED qui peuvent également être puisées dans le PLEDFM. Tous cessont présentés sur la figure 1 comme un ensemble, mais il peut être construit avec un seul des trois dispositifs à épifluorescence. En outre, la lumière détectée peut être traitée de différentes façons. Par exemple, la figure 2 illustre deux situations dans lesquelles le photocourant peut être soit intégrée , soit directement converti en une tension par l' intermédiaire d'un convertisseur courant-tension. En général, l'approche LFFM peut être utilisé pour mesurer simultanément plusieurs sites anatomiques, comme on le voit pour la figure 3.
La méthode présentée ici pour évaluer les propriétés cardiaques au niveau de l'organe intact est plus adéquat pour étudier les problèmes dans lesquels le couplage entre les cellules est essentiel dans la définition du comportement du tissu. L'hétérogénéité intrinsèque du coeur peut produire différentes formes d' onde AP 13, 21, 22 sur la base du tissu spécifique à partir de laquelle CElls sont originaires. Par conséquent, les études d'organes entiers fournissent l'occasion d'évaluer la fonction physiologique locale de la cellule dans les différentes structures anatomiques. De plus, nous avons vu que les événements intracellulaires comme les étincelles et les ondes ont des cinétiques différentes dans les cellules dissociées que dans l'organe intact 15.
Le Langendorff set-up (figure 4) est essentiel dans le maintien du coeur dans une situation qui est plus proche de in vivo. De plus, il permet à l'retroperfusion de plusieurs médicaments et différentes sondes moléculaires fluorescentes qui permettent la mesure de plusieurs variables physiologiques. La modification des sondes fluorescentes exogènes utilisées, ce qui augmente la taille de la fibre optique, ou le choix d'une source de lumière différente peut considérablement modifier l'application de la technique. En outre, l'unité à effet Peltier en dessous de la chambre horizontale peut faciliter l'étude de la dynamique de Ca à différentes températures. L'ajout d'accessoiresà LFFM comme un diviseur de faisceau peut augmenter le nombre de fibres optiques utilisés pour enregistrer de différentes régions dans le coeur intact. Ceci est une adaptation très utile pour tester si les différences régionales se produisent dans les scénarios pathologiques. La figure 3 montre l'endocarde et l' épicarde évaluée simultanément. En outre, perfusant le coeur avec différents agonistes nous permet de comprendre comment les différentes régions à travers la paroi ventriculaire sont réglementés. La signalisation électrique (Figure 5) et Ca 2+ cinétique (Figure 6) hétérogénéités peut être comparé à l'épicarde et endocarde. De plus, plusieurs colorants ayant différentes longueurs d'onde d'excitation et des filtres d'émission peuvent être utilisés. Par exemple, en utilisant Mag-Fluo-4, niveaux de Ca2 + dans la lumière du SR peuvent être enregistrées (figure 7). Faire varier la taille de la fibre optique peut également augmenter la capacité de cette méthode par fluorescence permettant l'enregistrement d'une larrégion ger.
Cet article montre également que, outre les lasers coûteux, les LED peuvent être utilisées en tant que source de lumière d'excitation dans la technique. La figure 8 montre que ce type peu coûteux de source de lumière peut être utilisée pour mesurer ratiometrically APs. La mesure ratiométrique représentée sur la figure 8 est avantageuse dans la production d' un enregistrement final sans artefacts expérimentaux , y compris ceux provoqués par le mouvement. Enfin, même le Ca 2+ transitoire et AP peuvent être optiquement enregistrées, simultanément, par des longueurs d' onde différentes et de multiplexage utilisant des colorants avec le même spectre d'émission. Le traitement des signaux décrits dans la figure 9 est essentielle pour éliminer la contamination interne produite par le chevauchement des spectres d'émission des colorants. Enregistrement Ca 2 + transitoires et les points d' accès, en même temps, mais que deux signaux de sortie indépendants est bénéfique dans l' étude ECC et Ca 2+ induite par Ca 2+
LFFM est une technique avec de multiples applications dans la physiologie cellulaire des tissus intacts. Cependant, une limitation majeure est que la fluorescence enregistrée est la moyenne de l'émission des indicateurs fluorescents sous-jacentes dans la zone locale où la fibre optique est en contact avec le tissu. Même quand on utilise deux fibres optiques, LFFM ne permet pas une répartition spatiale subcellulaire des signaux mesurés. Cartographie optique est une meilleure technique pour le suivi de variables physiologiques qui changent dans l' espace et le temps, comme la propagation de l'AP, Ca 2 + transitoires, et alternans 23, 24, 25. LFFM est également incapable de fournir l'imagerie des structures, comme la microscopie confocale et d'autres techniques de cartographie optique. Néanmoins, l'utilisation de la fibre optique, il est pratique dans rent des signaux locaux de fluorescence provenant de l'endocarde ou d'autres régions qui sont difficiles, voire impossible, d'accéder à un coeur intact avec un microscope confocal.
La comparaison entre les variables physiologiques obtenues à partir de coeurs intacts et des expériences de myocytes isolés est difficile. Le plus grand avantage de l'utilisation de myocytes cardiaques isolés est l'occasion unique d'évaluer les propriétés biophysiques des cellules dans des conditions de patch-clamp. En revanche, LFFM permet l'étude du phénomène physiologique et pathologique dans un environnement plus natif. Par exemple, dans les cœurs intacts , nous pouvons évaluer les différences transmurale 15, la dépendance de la fréquence cardiaque de l' AP et de Ca 2+ à physiologique varie 13 qui sont inaccessibles dans des cellules isolées. En outre, nous pouvons étudier les effets d'une lésion ischémique sur la fonction du cœur intact 9, 10. Whole coeur exexperiences nous permettent également d'évaluer l'interaction entre les autres types et myocytes 11 cellules.
LFFM permet la visualisation de signaux cellulaires au niveau du cœur intact dans lequel les cellules ont un couplage physiologique. LFFM permet l'étude de l'activité intracellulaire tandis que les cellules sont encore dans l'organe intact. En combinaison avec des colorants fluorescents et épiluminescence, LFFM peut surveiller deux propriétés cardiaques clés: Ca 2+ dynamique et activité électrique.
Enfin, la méthode présentée ici peut avoir de multiples applications dans l'étude de ECC. Il est un outil qui révèle comment les signaux supramoléculaire sont affectés dans des situations pathologiques telles que des arythmies 16 et l' ischémie 9, 15. Cette technique est un must pour étudier ces pathologies, car ils ne peuvent être compris au niveau de l'organe intact.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Alicia Mattiazzi pour la discussion critique des travaux présentés. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (R01 HL-084487) à ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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