Summary
心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。
Abstract
心臓では、分子シグナリング研究は、通常、単離された筋細胞で行われています。しかしながら、このような虚血および不整脈などの多くの病的状態は、完全に全臓器レベルで理解することができます。ここでは、無傷の心の中の細胞の信号の測定を可能にするローカルフィールド蛍光顕微鏡（LFFM）の分光技術を提示します。技術は、蛍光シグナルを記録するランゲンドルフ灌流心臓および光ファイバの組み合わせに基づいています。 LFFMは正常および病的条件下で心を勉強する心血管生理学の分野で様々な用途があります。複数の心臓の変数は異なる蛍光指示薬を用いてモニターすることができます。これらは、細胞質ゾルの[Ca 2+]、イントラ筋小胞体の[Ca 2+]および膜電位が含まれます。外因性蛍光プローブが励起され、放出される蛍光はLFFM落射蛍光技術の三つの異なるアレンジで検出します本論文での。これらの技術の中で中心的な違いは、励起用の励起光が変調されている方法で使用される光源の種類です。連続波LFFM（CLFFM）は、励起用の連続レーザ光を使用しながら、パルスLFFM（PLFFM）は、レーザ光パルスを使用しています。最後に、発光ダイオード（LED）は、第3の光源として使用しました。この非コヒーレント構成は、パルス状のLED蛍光顕微鏡（PLEDFM）と呼ばれています。
Introduction
心臓は心臓血管系の中心的な器官です。心臓の収縮は、細胞内の[Ca 2+] iの増加によって開始されます。細胞内Ca 2+放出における電気的興奮と変化の関係は、歴史的に、酵素的に解離した細胞1、2で研究されています。しかし、心臓の細胞は、電気的であり、代謝的及び機械的に結合された3、4。単離された場合、筋細胞だけでなく、物理的にカップリングしていないですが、異なる層から筋細胞を解離5中に混合されます。また、電圧クランプ条件下で単離された細胞の研究から浮上している巨大な利点、6、7、8電気シンシチウムALWAとして心の本質的な性質にもかかわらず、YS組織3に存在するものから細胞を解離する方法を機能的に異なるという問題を提起します。
本稿では、我々は、無傷の心臓における局所電場蛍光顕微鏡（LFFM）技術の使用により、心臓生理学の知識で得られた進歩について説明します。 LFFMは、細胞質ゾルのCa 2+、イントラ筋小胞体（SR）のCa 2+および膜電位などの複数の生理学的変数を測定するための蛍光指示薬を使用しています。これらの測定は、同時に心室圧9に関連して10、心電図9、電気的活動電位（APS）、イオン電流の記録とケージド化合物4、11のフラッシュ光分解を得ることができます。また、これらの測定値は、近い高い周波数で無傷の心臓をペーシングすることによって得ることができます生理率rと。いくつかの記事9、11、12、13、14は LFFM技術を使用して、我々のグループによって公開されているが、この技術に関連した技術的な複雑の推定は、心臓や他の臓器におけるex vivoの生理現象を研究する上での大規模な使用を妨げてきました。
LFFM技術（ 図1）は、組織と接触しているマルチモード光ファイバを使用して得られたエピ蛍光測定値に基づいています。任意の接触の蛍光イメージング技術と同様に、光学的分解能は、ファイバの直径と開口数（NA）に依存します。ファイバのNAが高い小径の測定の空間分解能を増加させます。 NASおよび繊維径は、0.22から0.66まで、50ミクロンからそれぞれ1mmとの範囲とすることができます。にNAのしわは、より大きな立体角から到来する光子を受け入れることによって信号対雑音比（S / N）に信号を改善します。落射蛍光装置として機能させるために、光ビームは、非球面レンズまたはレンズとファイバ一致NA落射蛍光対物レンズで光ファイバに集光されます。このマッチングは、励起用およびフルオロフォアによって放出された光子をバック収集するためのエネルギー伝達を最大化します。
組織内にロードされた外因性の蛍光標識を励起するために、異なる光源及び照明モードを利用することができます。パルス局所視野蛍光顕微鏡3、12（PLFFM）を使用して我々の先駆的な研究では、低コストのピコ秒レーザー（ 図1a、PLFFM）を用います。光源のこのタイプは、実質的に起因する色素を漂白することなく、照明領域の下のフルオロフォア分子の励磁大きな画分の大きな利点を有しています短パルス持続時間12へ。また、超短パルスの使用は、色素12の蛍光寿命の評価を可能にしました。蛍光寿命は、Ca 2+に結合した色素分子の割合を定量化するために使用することができる特性です。残念なことに、パルス間の振幅のパルスと変動の時間的なジッタは、色素に結合するリガンドによって生じる蛍光の変化が大きい場合に、この実験ストラテジーの適用を制限します。
連続波（CW）レーザは、通常LFFM（ 図1b、CLFFM）の主照明源として使用されます。レーザビームは、連続的に、組織を照明することができるか、ferroelectrically調節することができます。ビームの強誘電体の変調は、光のマイクロ秒のパルスの生成を可能にします。この変調は、外部ハードウェアによって制御することができます。この手順では、劇的トンを低減するだけでなく彼の光パルスの時間的ジッタだけでなく、異なる波長の光を混合することができます。光の混合は、異なるレーザからの多重線によって行われます。結果として、異なるスペクトル特性を有する複数の色素は、例えば、生理学的変数の種々の測定を実行するために励起することができるRhod-2細胞質ゾルの Ca 2+のための、MagFluo4イントラSR の Ca 2+、ジ-8-ANEPPS用用膜電位。
LFFM光源としてレーザは、存在する種々の利点があるが、他のタイプの光源は、発光ダイオード（LED）などを用いることができます。この場合、励起光源は、InGaNのLED（ 図1c、PLEDFM）から成っていました。伝導帯から電子が価電子帯の正孔と再結合するときのLEDにおいて、光子が自然に放出されます。固体レーザとの違いは、発光が他の光子によって刺激されないことです。これは、非コヒーレントなビームをもたらすとLEDの広いスペクトル放射。
ハイパワーLEDの異なる種類を使用することができます。 Fluo-4またはマグのFluo-4を使用して記録ディ-8-ANEPPSを使用して、APの記録のためにおよびCa 2+過渡現象のために、我々は485nmの（青）で、典型的なピーク発光および20nmの半分の幅を有するLEDを使用しました（ 図1D）。 Rhod-2で記録した Ca 2+過渡現象のために、LEDは540nmの（緑）、35 nmの（ 図1D）の半分の幅で、典型的なピーク発光を有していました。 LEDは、バンドの波長で発光するので、それらのスペクトル放射を絞り込むためのフィルタを必要とします。また、パルス光は、20マイクロ秒の持続時間で1.6キロヘルツのレートで生成することができます。 LEDは、高速パワーMOSFET電界効果トランジスタを用いてパルスしました。異なる指標との同時記録は時間多重LEDによって行うことができます。残念ながら、LEDによって放射される光は、レーザ光に比べて光ファイバに集中することはより困難です。このように、私たちの主な欠点LEDをることは、それらの放出プロファイルは、メイン軸からの角度変位（±15°）を持っており、補助光学部品は、それを修正するために使用しなければならないことです。
前述の光学的構成のすべてにおいて、励起光は、ダイクロイックミラーを用いて反射されます。ビームは、その後、組織に配置されているマルチモード光ファイバに非球面レンズと顕微鏡対物レンズによって集束されます。任意の落射蛍光装置のように、ダイクロイックミラーは、また、放射された光から励起を分離するのに役立ちます。放出された光スペクトルは、任意の反射された励起を除去するために、バリアフィルタを通って戻って移動します。最後に、放出された光は光検出器（ 図1）上に目的に集束されます。
光から電流への変換は、シリコンアバランシェフォトダイオードによって実行されます。これらのダイオードは、高速応答、低光の検出を可能にする高感度を持っています。ザアバランシェフォトダイオードによって生成される光電流は、2つの方法で増幅することができる：トランスインピーダンス増幅器は、帰還抵抗素子（ 図1eの）を有するまたは電圧（ 図1F）に電流を変換する積分器。第一のアプローチを使用して、出力電圧は、光電流と帰還抵抗に比例します。ピコ秒レーザパルスの抵抗検出の典型的な例は、 図2a、2b及び2cに示されています。パネル2aは、トランスインピーダンスアンプの出力を示し、パネル2bは、アスタリスク（*）で示された区間の時間展開を示しています。ピーク追跡アルゴリズムは、蛍光応答12のピーク（赤）とベース（緑）を検出するために実装されました。ベース蛍光の測定は、周囲LIGによって導入アバランシェフォトダイオードの暗電流および干渉の両方の情報を提供しますHTと電磁結合。ピークと塩基の表現は、 図2cに示されています。この図は、鼓動しているインコの心臓の心周期中の Ca 2+に結合した色素（Rhod-2）が発する蛍光を示しています。
第二の方法では、積分器の出力電圧は、電流と容量性フィードバック（ 図2D、2E、及び2F）の関数です。 図2Fは、2つの連続した統合サイクルを示していますなし外部照明およびパルスLEDから照射された光パルスと第二と第一。詳細な説明は 、 図2Gおよび2Hに示されています。このアプローチは、より面倒が、によりフィードバックコンデンサにおける熱雑音が存在しないため、より大きなS / Nを提供します。機器は、励起光の全ての制御および多重化を生成し、ヘッドステージの統合及び解像度を指示するタイミング段階を含みますらの期間。これは、通常、データのオンライン回帰を計算することによって、統合された出力信号のデジタル分化を行うデジタル信号処理回路を用いて行われます。抵抗性フィードバックを用いた場合には、任意のA / D取得ボードを使用することができます。
最後に、我々のLFFM技術は、非常に汎用性であり、複数の領域から記録するように適合させることができます。光路中にビームスプリッタを追加すると、私たちは2本の光ファイバに光を分割することができます。各光ファイバは、その後、外因性の蛍光プローブから、独立して、励起する組織と記録放出の異なる領域に配置することができます。この変更は、生理学的変数にどのように影響するかを解剖学的な地域差を評価するために私達を許可します。 図3は、2本の光ファイバを経電気または細胞内の[Ca 2+] iレベルのウィットを測定するために使用されるようにCW励起光を分割するために使用されるビームスプリッタを示します時間マイナー侵襲。経た信号は、1つの心内膜上のファイバと心室壁の心外膜層の上に他方を配置することによって記録することができます。したがって、LFFM技術は、異なる領域における細胞シグナルの経時変化を測定する能力を有しており、地域の変化は、病理学的状況で起こるかどうかをテストするために使用することができます。
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Protocol
このプロトコルは、すべてのマウスの取り扱いは、UCマーセド施設内動物管理使用委員会（第2008から201）によって承認されました。インコを用いた実験は、科学研究のためのベネズエラ研究所（IVIC）の科学委員会によって確立された動物の使用のための一般的なポリシーに従って、1999年に実施しました。
1.ランゲンドルフセットアップの準備
- 140のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、0.33 HPO 4、10グルコース、10 HEPES 2のNa：MMで、次の溶質濃度を含むタイロード溶液を調製します。 NaOHで7.4にタイロード溶液のpHを調整し、0.22μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。
- 60 mLの注射器と水平ランゲンドルフセットアップ11、 図4に示す12の全てのチューブにタイロード溶液をロードします。すべての気泡を排除することを確認します。
- O 2タンクにプラスチックチューブを接続します。
- 60 mLシリンジ中のタイロード溶液に5 "チューブを下げるためにプラスチック製のティーアダプタを追加します。
- タイロード溶液中に2意志バブルうちOので、5 "チューブの端部にプラスチック製のエアストーンを取り付けます。
- カニューレとして使用する針の周りの非吸収性縫合糸を配置します。針は、異なるソリューションでレトロ灌流を可能にするマニホールド（ 図4参照）に接続されています。最後に、心臓の大動脈は、針にカニューレされます。
2.動物の準備と心解剖
- 頚椎脱臼により安楽死の前に計量し、注入マウスをヘパリン（体重20グラムの例：マウス、20単位または200μLに注入する）15分。麻酔インコ応じトン頸椎脱臼を進め、あなたのIACUCプロトコルの動物使用ガイドoおよび。
注：8週齢のマウスまたは20グラムのインコを使用してください。 - 安楽死の後の胸腔から心臓を取り出します。マウスについて説明したように全く同じようにインコの心を抽出します。
- エタノールでマウスの胸をきれいにしてください。
- 解剖ハサミを使用して、下腹部に切開を行い、その後、首に向かって側面をカット。
- 切断組織を引いて、それを突き止めます。
- 振動板をカットします。心臓の損傷を防ぐために、振動板をカットするときは注意してください。
- 肺と周囲の組織を削除します。
- それを圧迫することなく、心をすくうためにピンセットを使用してください。できるだけ長く大動脈をカットします。
- 約1 mLのタイロード溶液で小さな計量ボートに乗って心を運びます。
- 非吸収性縫合糸を使用して、経由して水平ランゲンドルフ装置上に大動脈を結びます針。 2細かいピンセットの助けを借りて、心臓大動脈を結びます。タイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に位置バルブを開くことにより、レトロ灌流を開始します。
- 心臓を10分間安定化させます。血液や染料をロードする前に心臓を取り囲む脂肪組織をきれいにするために、この時間を使用します。ピンセットで心の底部近くの脂肪組織を引き、小さな解剖ハサミを用いて切断。解剖顕微鏡の視野の下にこれを行うにしてください。
3.細胞質ゾルのCa 2+測定：染料Rhod-2AMの準備
- 染料の50μgのを含む染料メーカーが提供する特別なパッケージ化されたプラスチックバイアルにDMSO中の20％のプルロニック（非イオン性界面活性剤）の20μLを追加します。
- 泡を避け、ピペッティングにより混和します。
- 透明なガラスバイアルに特別にパッケージプラスチックバイアルから非イオン性界面活性剤と混合し、DMSOおよび色素を転送します。タイロードソリューの1 mLを加え透明なガラスバイアルにる。
- バス超音波処理器で15〜20分間超音波処理。
- 室温で30分間、蠕動ポンプを使用して染料を灌流。
- 染料チャンバ内で染料を置きます。
- マニホールドに接続された他の全てのチューブラインを圧縮する機械的クランプを使用してください。クランプは、マニホールドの上方に配置されています。これは、60 mLのシリンジに接続チューブ内に任意の逆流を防止します。
- 染料を循環開始する灌流蠕動ポンプをオンにします。すぐに60 mLシリンジ、以下の3ウェイバルブを閉じます。
- 位置心臓内に灌流された染料を再循環するために、心臓の隣に吸引蠕動ポンプに接続されている小さなチューブ。
4.イントラ-SRのCa 2+測定：染料マグ-Fluo4AMの準備
- Rhod-2AMと同様にマグFluo4AMを準備します。段階的な手順については、セクション3を参照してください。
- AFTE染料をロードR、レトロ灌流を開始するタイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に配置さ弁を開きます。マニホールドの上にクランプを削除してください。
- 水平室にタイロード溶液を加え、37℃まで温めます。
- 細胞質ゾル色素を除去するために45分間のタイロード液でレトロ灌流。
5.膜電位測定：色素ジ8-ANEPPSの準備
- 染料5mgを含有する染料バイアルに99％エタノールを5mLを加えます。
- リピーターピペットを用いて、500個々の1mLのプラスチックバイアルにアリコート10μLを。
- -20℃で高速真空や店舗で乾燥します。
- 乾燥染料10μgのプラスチックバイアルにDMSO中の20％のプルロニックの20μLを追加します。
- 泡を避け、ピペッティングにより混和します。
- プラスチックバイアルからメスシリンダー（10ミリリットル）にプルロニックおよび染料でDMSOを含むミックスを転送します。最終Voにタイロード液を追加5ミリリットルのLUME。
- バス超音波処理器で20〜25分間超音波処理。
- 蠕動ポンプを用いて30分間心に灌流します。 3.5節で段階的な手順を参照してください。
6。心外膜の信号を記録
- 色素をロードした後、マニホールドの上にクランプを除去することにより、タイロード溶液で心をレトロ灌流。タイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に位置バルブを開きます。心を安定させるために10分間レトロ散らすタイロード溶液。
- タイロード溶液で水平室を記入し、37℃に浴温度をもたらすためにペルチェユニットの電源をオンにします。
- 心臓の表面に光ファイバを配置します。
- 2 mLのピペット内部に光ファイバを配置し、マイクロマニピュレーターにピペットを取り付けます。
- 少しLVの表面に対して光ファイバを押すようにマイクロマニピュレーターを使用してください。
- 外部ょんのペース波動発生器によって制御される刺激で室温。
- プログラム1ミリ秒の幅矩形パルスを提供するために、波発生器。
- 外部で同期をとるための刺激を設定し、波発生器への外部入力に接続します。
- 刺激の各出力に、最後に半田付け鍼灸針で線を接続します。
- 約3mm離間心尖の両方で鍼を置きます。
- 針が組織内に配置された後にのみ、感電を防止するために、刺激の出力をオンにします。
- 取得ソフトウェアでは、10 kHzに取得頻度を調整します。
7 。心内膜信号を記録
- 色素をロードした後、心臓を安定させるために6.1および6.2のステップを参照してください。
- 光ファイバのサイズに関する鋭い23Gaポイントを使用して、中隔に近いLVに心臓の表面に小さな穴を作ります。 <LI>マイクロマニピュレーターを用いて、心内膜に第一の光ファイバの位置決めを支援するために硝子体内手術強膜切開アダプタを置きます。
- 外部から心臓のペース。 6.4ステップを参照してください。
- 取得ソフトウェアでは、10 kHzに取得頻度を調整します。
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Representative Results
心内膜および心外膜における APおよびCa 2+ 過渡現象
心室壁を横切って信号を比較するためには、光ファイバは、心外膜での心内膜及び他方に配置されています。心外膜からのものと心内膜から記録されたAPの形態を比較すると、貫機能を評価するための最良の方法です。心室壁は非常に不均質であり、したがって、APの形態は、これらの二つの領域で非常に異なっています。よく心内膜があまりI の心外膜17、18、19以上を有することが知られています。あまり私は心内膜18、20におけるフェーズ1の再分極が遅くなります 。 図5bの SH心内膜および心外膜からのAPの典型的な光記録をOWS。これらの記録を実行するために、マウスの心臓は、電位差染料ジ-8-ANEPPS蛍光を充填したCLFFM技術を用いて測定しました。特にフェーズ1で光学的に記録APの形態は、心外膜と比較して心内膜のための遅い時間経過（活動電位持続時間（APD）30は2.5±8.01ミリ秒である）（0.59±3.4ミリ秒）（ 図5b）を示しています。一般的に、APDは、30、70または90（ 図5a）を含む特定の割合を再分極するAPにかかる時間として説明することができます。これらのトレースは、正規化されているとのAPD（ 図5c）を比較すると、我々はこれらのAPは蛍光シグナルであるが、心内膜及び心外膜は、フェーズ1の間に有意差があることがわかり、位相0を重ね持つようにシフトしている、彼らは特定に校正することができますそれと同時にAPを測定することにより、膜電位鋭い微小電極は、3 MのKCl 13で満たされました。
潜在的な膜に加えて、外因性蛍光指示薬は、細胞内の[Ca 2+] iをモニターするために使用することができます。一般的に、我々は、その高いダイナミックレンジ、さらには生理的温度で、サイトゾルに滞在する能力の細胞内Ca 2+過渡電流を測定するためにRhod-2AMを使用します。 図6bは、心内膜と心外膜層内の細胞内Ca 2+過渡現象の典型的な記録を示しています。これらの結果は、部分的に15を発表されています。細胞内での地域差を比較するためにの[Ca 2+]のレベルは、 の Ca 2+過渡現象の動態は、（図6a）を評価しました。全体として、 の Ca 2+過渡動力学（ 図6c）の分析は、心内膜からの Ca 2+トランジェントがsignifiを有したことを示します心外膜から記録されたものよりも遅い速度論をcantly。
SR内腔におけるCa 2+動態
心臓では、細胞内の立ち上がりと立ち下がりは、の[Ca 2+]のレベルは、圧力、収縮、および活動電位持続時間（APD）を含む多くの生理学的変数を定義する上で重要です。前のセクションでは、細胞質ゾルのCa 2+過渡電流を測定する当社の能力を説明しました。 Ca 2+ SRから放出され、細胞内細胞質ゾルのCa 2+の上昇に大きく関与です。このように、細胞内Ca内のすべての上昇のための Ca 2+が存在する2+ SRの枯渇。しかし、細胞質ゾルのCa 2+トランジェントは、SRのCa 2+放出にのみによるものではないが、また、原形質膜を介して細胞に入ってくるの Ca 2+含まれます。私たちの研究室16は、蛍光色素、マグのFluo-4AMを使用することにより、SR の Ca 2+含有量を評価することができました。この色素は筋形質とSRに脱エステル化されていますが、筋細胞は、細胞質画分を押し出すことができます。この染料の押し出しは、単に37℃に温度を上げることによって促進することができます。この温度では、サイトゾル染料は、膜タンパク質のようなATP結合カセットによって除去されます。幸いなことに、このタンパク質は、SR膜には存在しません。したがって、37℃に温度を上昇した後、PLFFM技術を使用して記録された蛍光はほとんどSR内の色素に結合するの Ca 2+の結果です。オルガネラの測定の特異性を試験するために、カフェインパルスのRyRを介しての Ca 2+放出を刺激するために適用しました。信号が実際SR枯渇（ 図7）の結果であることを観察することができます。カフェイン誘発されるSRのCa 2+放出（ 図7a）の両方、マグ-のFluo-4蛍光（92±0.05％（N = 4、P = 0.012））及びCa 2+トランジェント（51±0.21％（振幅の減少の拡張期レベルの低下を生じさせるN = 4、P = 0.003））16。イントラSRトレースは前に記録し、カフェインの刺激の後下方図7b-7Dに表されています。時間はカフェインの刺激から進行するにつれて、SR枯渇の振幅が小さくなります。 図7Eは、SRの枯渇は、Ca 2+シグナルの振幅の減少を誘発するだけでなく、SRのCa 2+放出のプロセスを遅くするだけでなく。 図7aの蛍光トレースは、以前に15を公開されています。
パルスLED：活動電位
図5において、我々は、ジ- 8 - ANEPPSが変更を報告できることを示しました膜電位では、532nmで励起していたとき。この励起条件下で、590ナノメートルよりも高い波長で放射された蛍光の減少があります。興味深いことに、この電位差染料は、最大励起波長の励起近く（〜476ナノメートル）、より低い波長とき、膜脱分極に染料移行の蛍光発光がある場合。したがって、このスペクトルシフトは、二つの異なる波長で放出された蛍光を記録するために私達を許可します。ジ - 8 - ANEPPSのこの分光特性は、二つの異なる波長で記録された放射された蛍光の配給、最終的に計算記録が膜に色素濃度とは無関係になりますので、通常は非常に価値のある機能を可能にします。ジ8-ANEPPSスペクトルシフトを最大限に活用するために、光源としてパルス状のLEDを使用しました。私たちは、フルオロフォアを励起するためにパルス状の青色光を使用します。励起はディ-8-Aのピーク吸収波長に近い485nmの、で行いましたNEPPS（〜476 nm）を。二つの異なる発光分光帯域の取得は、比率の形成およびS / Nを向上させ、機械的脱共役のブレビスタチンが使用されていない契約の心の中に環境光とモーションアーチファクトのようなコモンモードノイズを除去する能力を可能にします。この状況は、心臓の機械的活動およびCa 2+トランジェントの速度の両方を同時に測定する必要がある実験条件のために非常に重要です。
PLEDFMのタイミング図は、 図8aに示されています。図は、光検出ヘッドステージ、LEDのオン・オフタイミング及びアナログ - デジタル変換の統合およびリセットするための制御ロジックを含みます。 APの時間経過の間に、緑色の波長帯域で検出された蛍光は、赤色帯域で検出された蛍光が減少する強度の増加を示しています。ショー図8bこと膜脱分極によって生成される蛍光シグナルの変化は、異なる方向に移動します。しかし、心臓の収縮によって生成されるモーションアーチファクトは、常に発光波長とは無関係に、同じ方向に向いています。前に説明したように、両方のチャネル（緑と赤）のデータは、比率を計算する前にソフトウェア付きでなければなりません。コンディショニングは、オフセットと修正を得ることを含みます。オフセットとゲインレベル補正の選択は自動ではありません。ソフトウェアのユーザは、比の前トレースを調整するための変数を選択しなければなりません。パネル部8b（ 図8）で得られた比率は、心筋の動きによって導入されたアーティファクトがキャンセルされたことを示しています。
AP中のジ - 8 - ANEPPS蛍光の相対的な変化は、通常は非常に小さい（〜8パーセント100mVのあたり）。このジ- 8 - ANEPPS蛍光変化は、Ca 2+バインディンによって製造されたものよりもはるかに小さいですRhod-2グラム（<200％）。したがって、ジ - 8 - ANEPPSの信号対雑音比を高めるために、複数の記録を平均化することができます。
パルスは、LED：同時のCa 2+ 記録 及び膜電位を
この実験的なアプローチを使用して、最後の目標は、Ca 2+過渡現象とAPの同時録画を実行することにあります。光ファイバで光源を結合する、LEDの発光に色素の吸収スペクトルに一致する、アナログおよびデジタル電子回路の設計：複数の生理学的信号の同時録画は、以下を含む、システムのさまざまな側面に関連する技術的な問題を解決する必要タイミングと取得だけでなく、オンラインでデータを分析するための高速ソフトウェアの開発を生成します。
OU内R研究、染料の選択は、それらのスペクトル特性に依存していました。多様な信号を測定するために使用されるフルオロフォアは、異なるスペクトル帯域で吸収しなければなりません。この状態は、信号源とを区別することが不可欠です。異なる波長を有するLEDは、組織を励起するために使用されるたびに、検出された蛍光は、その波長で吸収色素と関連した信号に相当します。このように異なる色素からの蛍光発光が、同じ波長帯域で、それぞれが励起される時間によって区別することができます。
それにもかかわらず、染料のスペクトルとの間のクロストークを完全に回避することができません。染料の分光吸収特性は、それらがはるかにそのピーク吸収の波長の光を吸収するためです。我々の実験では、クロストークは、両方の方法で製造した：（1）Rhod-2は、赤色channeへの Ca 2+シグナルを追加、青色LEDによって励起されリットルのAPトレース、および（2）ジ-8-ANEPPSは、Ca 2+過渡信号（ 図9F）に表示される緑色のLEDによって励起されています。 図9に示すように、このクロストークは、オンラインで補正することができます。侵入信号を測定する必要がある信号の小さな割合であるため、手順が動作します。最後に、染料からfluorecenceの代数処理のこのタイプを使用すると、私たちはAP（ 図9D）を分離させた Ca 2+過渡現象（ 図9H）を形成します。この処理の詳細な概要は、図の凡例に記載されています。すべてのパルスLEDの実験は28℃で行ったことに気づくことが重要です。
図1： ローカルフィールド蛍光顕微鏡（LFFM）。 LFFMは、落射蛍光装置で構成されてい組織と接触しているマルチモード光ファイバを使用して心臓内灌流、外来性色素から発せられる蛍光を記録します。 LFFMセットアップは、励起光をパルスピコNd-YAGレーザーにより提供される（a）に PLFFM、を含む三つの異なる光源を使用することができます。 （b）は、連続波レーザーが使用され、光パルスは、異なる波長のレーザの多重化を可能にする強誘電体変調器によって生成されるCLFFM、。そして（c）LEDは（d）にそれぞれ485 nmおよび青と緑のLEDの540nmでのピーク排出量と広い発光スペクトルを持つPLEDFMは、電子的にパルス化されています。レーザ源が使用されるとき、ビームは、ビームエキスパンダによってデフォーカスされます。最後に、ダイクロイックミラーと対物レンズはわずかに組織に押圧される光ファイバの遠位端部上にビームの焦点を合わせます。放出された光は、同じ光ファイバ、ダイクロイックミラー、電磁波を介して戻って移動しますssionフィルタ、光子を電流に変換するアバランシェフォトダイオード上に集束されます。電流は、結果として得られる出力電圧は、光電流と帰還抵抗に比例する二つの方法（e）のトランスインピーダンス増幅器によって増幅することができます。出力電圧は電流と容量性フィードバックの関数であり、（f）の積分器。最後に、信号は、A / D変換器により取得し、コンピュータ上で表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 抵抗性及び容量変換。 （a）は、ピコ秒レーザパルスの抵抗検出の典型的な例が示されています。アスタリスク（b）はピーク追跡アルゴリズムは、ピーク（赤）及び塩基（緑）を検出するために実施された時間拡張間隔を示します。 （c）のピークおよび塩基記録から計算された痕跡の表現は37℃に設定し、外部から7 Hzでペース鼓動しているインコの中心部にあるRhod-2蛍光応答および浴温度のために示されています。 hまでd）の容量帰還を使用して、積分器によって変換された光電流。無傷のマウス心臓のCa 2+過渡電流の典型的な記録は、二つの異なる時間スケール（DおよびE）に示されています。 （f）は、LED照明付きとなしの2連続サイクルの統合が示されています。光電流は、帰還コンデンサを充電直線として信号増加の積分。時間依存積分（タン（Ɵ））の傾きは、pによって誘導された電子と正孔の再結合に加えて、なだれ接合に衝突する光子の数に比例しますアバランシェダイオードは、任意の光子を検出しませんhononic活動。ヘッドステージの統合を制御するデジタル信号と期間をリセットパネルグラムに示されています。期間（F）を照明非照射（DC）の間に検出された信号と、LEDは、パネルHに示されています。 FおよびDCの減算は、蛍光外部から37°C（H）で9 Hzでペースマウスの心臓からのCa 2+過渡電流を検出し、実際の測定値を提供します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 心外膜と心内膜測定のためのLFFM。 CLFFMセットアップは、心外膜のANに存在する外因性の蛍光色素から発せられる蛍光を測定するために使用しました。D心内膜層。ビームスプリッタの添加は、心外膜及び心内膜における異なる生理学的変数の記録を容易にしました。二つの光ファイバは、心外膜と心内膜から検出するために、個々のヘッドステージで使用されました。小さな円形の切開が心室に作られたと光ファイバーは、心内膜から録音するに通しました。このセットアップは、帰還抵抗と電流 - 電圧変換器を使用します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 温度制御と水平商工会議所。無傷の心は時間のための機能を維持しているランゲンドルフセットアップを示す図です。心を介してすべてのソリューションや染料針に接続されてい大動脈から分岐冠状動脈を介して心臓にレトロ灌流します。チャンバは、電圧計に接続された温度センサによって読み取られる浴の温度を維持するためにペルチェユニットの上方に配置されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 無傷の心の中に貫活動電位測定。 （a）は、活動電位持続時間（APD）は、30％、70％、またはAP再分極の90％を完了するのにかかる時間として評価されます。 （b）は、心外膜（ブラック）と心内膜（灰色）からのジ-8-ANEPPS蛍光は、心室壁の2つの層の間の再分極におけるAPの形態学的差異を示します。 Tを評価した後、（C）彼は心内膜と心外膜で30、70、および90 APD、結果は有意差がAPD 30（3±0.6ミリ秒の心外膜対8±2.5ミリ秒の心内膜）で発生したを示しました。ハーツは6 Hzでペースし、温度を37℃に設定してください。データは、5心の平均±SEMです。 * P <0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 無傷の心の中に 貫のCa 2+ 過渡測定。 （a）は、カルシウムのパラメータ2+過渡的動態測定は、以下のとおりです。それは（TP）をピークまでの最大時間に到達するのに要する時間。それは上昇の10％から90％に移動するのにかかる時間は、時間（RT）の上昇します。それは10％から減衰、減衰時間（DT）の90％に行くのにかかる時間。そしてその時間は、それは一時的、半期間（HD）の50％を完了するのにかかります。 （b）の蛍光は、緑色CWレーザーショー心外膜（黒）とリラクゼーションの違いと心内膜（灰色）のCa 2+過渡電流で励起した後、Rhod 2によって放出されました。 c）の心内膜からのCa 2+トランジェントは心外膜から記録されたものよりRT、TP、HD、およびDTで有意に遅い速度論を持っていました。ハーツは6 Hzでペースし、温度を37℃に設定してください。データは、5心の平均±SEMです。 * P <0.05。 Mattiazzi らから変更。 15。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7： 無傷の心の中にイントラSRのCa 2+測定。（a）は、マグ-のFluo-4色素から発せられる蛍光は、イントラSR Ca 2+濃度の減少を反映して、時間の経過とともに低下します。 （b）は SRからのCa 2+放出によって誘発された Ca 2+枯渇を示すマグのFluo 4蛍光の減少の拡大図を。 （c）は 20 mMのカフェインと心臓を灌流することによって修正されたのCa 2+放出を表すマグのFluo 4の蛍光からの過渡振幅の減少の拡大図を。カフェインの長い適用した後、（d）に 、マグのFluo-4の蛍光の拡張期レベルの両方でおよびCa 2+過渡現象の振幅の減少[±92から0.05パーセントダウン（N = 4、P = 0.012）とそれぞれ初期値の51±0.21％が（N = 4、P = 0.003）]、観察されました。より多くの時間はカフェインから進むにつれて、より小さなSR枯渇の振幅です。 （e）の BDでの正規化されたトレースは、SRの枯渇だけでなく誘導することを示していますSは、Ca 2+シグナルの減少だけでなく、ダウンSRのCa 2+補充が遅くなります。ハーツは4 Hzでペースし、温度を37℃に設定してください。蛍光トレースはKornyeyev らからです。 16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8： パルスLEDと無傷の心の中でのAPのレシオメトリック測定。 （a）は、ヘッドステージの統合およびリセットなどのタイミング図は、LEDと実際の記録のオン・オフ時間が示されています。 （B）は、2つのチャネルからのトレースは異なる休止値を有し、オフセットは、各APが静止値が先行するまで、レバーを動かすことによって補正されます。各チャネルの利得もadjusですテッド。非常に大きなモーションアーチファクトは、2つの脱分極の間の両方のチャンネルに表示されることに注意してください。ソフトウェアはレシオメトリック信号を処理した後、結果が顕著なアーティファクト（青）のないAPです。ハーツは3 Hzでペースし、温度を28℃に設定してください。示されているすべてのレコードは10トレースの平均値です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9： パルスLEDと無傷の心の中に同時のCa 2+過渡状態とAP測定。 Ca 2+とAPの両方を記録する際の信号のクロストーク汚染がオンラインで補正することができます。電位差色素、ジ- 8 - ANEPPSは、20マイクロ秒で励起される青色LEDパルス（A）。信号がsですplit、バンドパス、赤と緑のフィルターで濾過しました。これらの信号は、（b）は、赤と緑のチャンネル（C）のように示される二つの異なるアバランシェフォトダイオードによって検出されます。赤と緑の両方の信号が、下方への撓みとして表示され目立つ動きアーチファクトを提示することを観察することができます。赤色と緑色の両方の信号は、offsetedその後増幅されます。コンディショニング信号は、それらの間の比を計算するために使用され、結果をdに示されています。両方の信号（D）との比で移動アーチファクトがキャンセルされていることを観察することができます。パネルEは 、緑色発光LEDは、Ca 2+指示薬Rhod-2を励起するために使用される制御論理パルスのシーケンスを示します。この手順を使用して得られた蛍光シグナルをfに示されています。 Fでのトレースは、主に起因した Ca 2+バインディンに蛍光シグナルの増加を示しているがRhod-2のGこの色素は緑色光で励起されるとき、ジ8-ANEPPSから起因する蛍光検出信号にトレースで負の偏差を観測することも可能です。この問題は、Gに示す電位差信号を減算することによって補正することができます。減算の結果は、パネルHのCaに示されている2+ AP汚染のない信号が得られます。ハーツは3 Hzでペースし、温度を28℃に設定してください。示されているすべてのレコードは10トレースの平均値です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、心筋細胞のex vivoでの機能を評価するために、ローカルフィールドの蛍光技術を説明するのに集中しています。接続された環境でのこれらの細胞の研究だけではなく、より生理的であるだけでなく、臓器レベルの病理を評価するための非常に適切です。興奮収縮連関（ECC）を基礎となる細胞事象は、細胞内Ca 2+動態（Rhod 2細胞質ゾルのCa 2+、マグFLUO4 SRのCa 2+）を監視分子プローブを用いた全臓器レベルで評価することができ、電気的活動（ジ-8- ANEPPS）。ここでは、双方が励起し、光ファイバを用いた蛍光指示薬からの発光を収集する3 LFFMエピ蛍光技術を提示しています。これらは、使用する光源と光変調のタイプに基づいて異なります。 PLFFMは、光パルスレーザーを使用していますLEDFMもPLEDFMでパルス化することができますLEDを使用しながらCLFFMは、連続レーザ光を使用しています。これらのすべて一組として、図1に示されているが、3つ落射蛍光アレンジメントのいずれか一方のみで構成することができます。また、検出された光は、異なる方法で処理することができます。例えば、 図2は、光電流を電流-電圧変換器によって電圧に変換され、統合または直接のいずれかであることができる2つの異なる状況を示します。 図3に見られるように、一般に、LFFMアプローチは、同時に複数の解剖学的部位を測定するために使用することができます。
無傷の器官レベルでの心臓の特性を評価するためにここに提示された方法は、細胞間の結合が組織の振る舞いを定義する上で重要である、問題を勉強するより適切です。別のAPを生成することができ、心臓の固有の不均一性は、特定の組織に基づいて、22 21、13波形いるCEからLLS発信。したがって、全体の臓器の研究は、異なる解剖学的構造における細胞の局所生理学的機能を評価する機会を提供します。さらに、我々は火花と波のような細胞内事象が無傷の臓器15よりも解離細胞で異なる動態を持っていることを見てきました。
ランゲンドルフセットアップ（ 図4）は、in vivoのに近い状況に心を維持する上で重要です。さらに、それはいくつかの生理学的変数の測定を可能にする複数の薬剤と各種蛍光分子プローブの逆行潅流を可能にします。異なる光源を用いる外因性蛍光プローブを変更する光ファイバのサイズを大きくする、または選択すると、劇的な技術の適用を変更することができます。また、水平室以下ペルチェユニットは、種々の温度での Ca 2+動態の研究を容易にすることができます。アクセサリーを追加しますビームスプリッタは、無傷の心の中の異なる領域から記録するために使用される光ファイバの数を増加させることができるようなLFFMします。これは地域差が病的な状況で発生するかどうかをテストするために非常に便利な適応です。 図3は、心内膜及び心外膜を同時に評価されている示しています。さらに、異なるアゴニストで心臓を灌流すると、私たちは心室壁上の異なる領域が規制されているかを理解することができます。電気信号（ 図5）およびCa 2+動態（ 図6）不均質性は心外膜と心内膜に比較することができます。また、異なる励起波長および発光フィルターを有する複数の染料を使用することができます。例えば、マグ-のFluo-4を使用することにより、SRのルーメン内のCa 2+レベル（ 図7）を記録することができます。光ファイバのサイズを変化させることもLARからの蛍光の記録を可能にすることによって、この方法の能力を拡張することができGER地域。
この論文は、また別に高価なレーザから、LEDは、我々の技術では、励起光源として使用することができることを示しています。 図8は、光源のこの安価なタイプはレシオメトリックAPを測定するために使用できることを示しています。 図8に示されているレシオメトリック測定は、運動によって引き起こされるものを含む実験的なアーチファクトなしに、最終的な記録の生産に有利です。最後に、偶数の Ca 2+過渡及びAPは、光学的に多重化する異なる波長によって、同時に、記録された同一の発光スペクトルを有する染料を使用することができます。 図9に概説される信号の処理は、色素の発光スペクトルの重なりによって生成される内部の汚染を除去するのに重要です。 Ca 2+過渡現象とAP、同時に、しかし、2本の独立した出力信号を記録するECCおよびCa 2+誘導性のCaを研究する上で有益である2+
LFFMは、無傷の組織の細胞生理学における複数のアプリケーションと技術です。しかし、1主な制限は、記録された蛍光は、光ファイバが組織と接触している局所領域内根本的な蛍光指示薬からの発光の平均であるということです。 2光ファイバを使用した場合でも、LFFMは、測定された信号の細胞内空間分布を提供していません。光学マッピングは、AP、のCa 2+トランジェントの伝播として空間と時間的に変化生理的変数を監視するための優れた技術であり、交互23、24、25。 LFFMはまた、共焦点顕微鏡および他の光学マッピング技術のように、構造のイメージングを提供することができません。それにもかかわらず、光ファイバの使用は、rにおけるそれは実用的になり共焦点顕微鏡を用いて、無傷の中心部にアクセスすることが困難または不可能である心内膜または他の地域から地元の蛍光シグナルをecording。
無傷の心臓から得た生理的変数の間および単離された筋細胞の実験からの比較は困難です。孤立した心筋細胞を使用することの最大の利点は、パッチクランプ条件下で細胞の生物物理学的特性を評価するためのユニークな機会です。これとは対照的に、LFFMは、より多くのネイティブ環境での生理学的および病理学的現象の研究を可能にします。例えば、無傷の心の中に私たちは貫差15を評価することができ、生理的にAPおよびCa 2+の心拍数依存性は、単離された細胞中で達成不可能である13の範囲です 。また、我々は、無傷の心臓9、10の機能に虚血発作の影響を研究することができます。心臓全体の元perimentsはまた、私たちは他の細胞型と筋細胞11の間の相互作用を評価することを可能にします。
LFFMは、細胞が生理学的なカップリングを持っている無傷の心臓レベルで細胞シグナルの可視化を可能にします。細胞は無傷の器官である間LFFMは、細胞内活性の研究を可能にします。 Ca 2+動態および電気的活性：蛍光色素とepiluminescenceとの組み合わせで、LFFMは、次の2つの主要な心臓の特性を監視することができます。
最後に、ここで紹介する方法は、ECCの研究で複数のアプリケーションを持つことができます。これは、超分子信号は、このような不整脈16および虚血9、15のような病理学的な状況でどのような影響を受けるかを明らかにするツールです。この技術は、それらが唯一の完全な臓器レベルで理解することができるので、これらの病態を研究するための絶対必要です。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、提示の仕事の重要な議論のための博士アリシアMattiazziに感謝します。この作品は、ALEにNIH（R01 HL-084487）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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