Summary
En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.
Abstract
En el corazón, los estudios moleculares de señalización se realizan generalmente en miocitos aislados. Sin embargo, muchas situaciones patológicas tales como la isquemia y las arritmias sólo pueden comprenderse por completo en todo el nivel de órganos. A continuación, presentamos la técnica de espectroscopia de fluorescencia local de microscopía de campo (LFFM) que permite la medición de señales celulares en el corazón intacto. La técnica se basa en una combinación de un corazón perfundido Langendorff y fibras ópticas para registrar señales fluorescentes. LFFM tiene varias aplicaciones en el campo de la fisiología cardiovascular para estudiar el corazón bajo condiciones normales y patológicas. las variables cardiacas múltiples pueden ser controlados utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estos incluyen citosólico [Ca 2 +], el retículo sarcoplásmico intra-[Ca2 +] y los potenciales de membrana. Las sondas fluorescentes se excitan exógenos y la fluorescencia emitida detectaron con tres modalidades diferentes de la técnica LFFM epifluorescencias presentado en este documento. Las diferencias centrales entre estas técnicas son el tipo de fuente de luz utilizada para la excitación y en el camino se modula la luz de excitación. El LFFM pulsado (PLFFM) utiliza pulsos de luz láser de onda continua, mientras que LFFM (CLFFM) utiliza luz láser para la excitación continua. Por último, diodos emisores de luz (LEDs) se utilizaron como fuente de luz tercera. Esta disposición no coherente se llama pulsada microscopía de fluorescencia LED (PLEDFM).
Introduction
El corazón es el órgano central del sistema cardiovascular. La contracción del corazón se inicia por un aumento de intracelular [Ca 2 +]. La relación entre la excitabilidad eléctrica y los cambios en la liberación de Ca2 + intracelular ha sido históricamente estudiado en células disociadas enzimáticamente 1, 2. Sin embargo, las células cardiacas son eléctricamente, metabólicamente y mecánicamente acoplados 3, 4. Cuando aislada, los miocitos no son sólo físicamente desacoplado, pero miocitos de las diferentes capas se mezclan durante la disociación 5. Por otra parte, a pesar de las enormes ventajas que han surgido a partir del estudio de las células aisladas en condiciones de tensión de la abrazadera, 6, 7, 8 la naturaleza intrínseca del corazón como un sincitio eléctrica always plantea la cuestión de cómo funcionalmente diferentes son células disociadas de los presentes en el tejido 3.
En este manuscrito, se describen los avances obtenidos en el conocimiento de la fisiología cardiaca mediante el uso de técnicas de microscopía de campo local de la fluorescencia (LFFM) en el corazón intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiples variables fisiológicas tales como Ca2 + citosólico, intra retículo sarcoplásmico (SR) Ca2 + y el potencial de membrana. Estas mediciones se pueden obtener de forma simultánea y en conjunción con la presión ventricular 9, 10, electrocardiogramas 9, los potenciales de acción eléctricos (APs), grabaciones de corriente iónica y la fotólisis de destello de compuestos enjaulados 4, 11. Además, estas mediciones pueden obtenerse por estimular el corazón intacto a frecuencias más altas cercar a las tasas fisiológicas. Aunque varios artículos 9, 11, 12, 13, 14 han sido publicados por nuestro grupo utilizando técnicas LFFM, la presunción de complejidades técnicas asociadas con esta técnica ha impedido su uso masivo en el estudio de los fenómenos fisiológicos ex vivo en el corazón y otros órganos.
La técnica LFFM (Figura 1) se basa en mediciones de epifluorescencia obtenidos utilizando una fibra óptica multimodo en contacto con el tejido. Como cualquier técnica de imagen de contacto de fluorescencia, la resolución óptica depende del diámetro y la apertura numérica (NA) de la fibra. Un diámetro mayor NA y más pequeño de la fibra aumenta la resolución espacial de las mediciones. AN y diámetros de fibra pueden variar desde 0,22 hasta 0,66 y de 50 micras a 1 mm, respectivamente. Enarrugar la AN mejorar la relación señal a ruido (S / N) mediante la aceptación de los fotones que llegan desde un ángulo sólido más grande. Con el fin de actuar como un dispositivo de epifluorescencia, el haz de luz se enfoca en la fibra óptica con una lente asférica o un objetivo de epifluorescencia en el que el NA de la lente y el partido de la fibra. Esta coincidencia maximiza la transferencia de energía para la excitación y para recoger de nuevo los fotones emitidos por el fluoróforo.
Con el fin de excitar los indicadores fluorescentes exógenos cargados en el tejido, diferentes fuentes de luz y modos de iluminación pueden ser utilizados. Nuestros estudios pioneros de impulsos utilizando el campo local de la microscopía de fluorescencia 3, 12 (PLFFM) emplean un láser de bajo costo de picosegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fuente de luz tiene la enorme ventaja de excitar una gran fracción de moléculas de fluoróforo en el marco del área de iluminación y sin blanquear sustancialmente el tinte debidoal impulso corto duraciones 12. Además, el uso de pulsos ultracortos permitió la evaluación de la vida de la fluorescencia del colorante 12. El tiempo de vida de fluorescencia es una propiedad que se puede usar para cuantificar la fracción de moléculas de colorante unidas a Ca2 +. Desafortunadamente, el jittering temporal de los impulsos y las variaciones de amplitud de pulso a pulso limitar la aplicación de esta estrategia experimental para los casos en que el cambio en la fluorescencia producida por la unión al colorante ligando es grande.
Wave (CW) láseres continuos se utilizan generalmente como la fuente de iluminación principal en LFFM (Figura 1b, CLFFM). El rayo láser puede iluminar de forma continua el tejido o puede ser modulada ferroelectrically. La modulación ferroeléctrico del haz permite la generación de pulsos de microsegundos de la luz. Esta modulación puede ser controlado por hardware externo. Este procedimiento no sólo reduce drásticamente tque jittering temporal de impulsos de luz, sino también permite que los haces de diferentes longitudes de onda de mezclado. La mezcla de vigas se realiza mediante multiplexación rayos de diferentes láseres. Como consecuencia de ello, múltiples colorantes que tienen diferentes propiedades espectrales pueden ser excitados para llevar a cabo las mediciones de una variedad de variables fisiológicas, por ejemplo, Rhod-2 para citosólica de Ca2 +, MagFluo4 para Ca-intra SR 2+ y di-8-ANEPPS para Potencial de membrana.
Aunque los láseres presentan varias ventajas como la fuente de luz en LFFM, otros tipos de fuentes de luz se pueden utilizar incluyendo diodos emisores de luz (LEDs). En este caso, la fuente de luz de excitación consiste en un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). En LEDs, los fotones son emitidos espontáneamente cuando los electrones de la banda de conducción se recombinan con los agujeros en la banda de valencia. La diferencia con los láseres de estado sólido es que la emisión no es estimulada por otros fotones. Esto resulta en un haz no coherente yuna emisión espectral más amplio para LEDs.
Diferentes tipos de LED de alta potencia pueden ser utilizados. Para grabaciones AP utilizando Di-8-ANEPPS y para el Ca 2 + transitorios registraron usando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, se utilizó un LED que tiene un pico de emisión típica en 485 nm (azul) y una anchura media de 20 nm (Figura 1d). Para Ca 2 + transitorios grabados con Rhod-2, el LED tenía un pico de emisión típico a 540 nm (verde) y una anchura media de 35 nm (Figura 1d). LED emiten una longitud de onda en banda y por lo tanto requieren filtros para limitar su emisión espectral. Además, la luz pulsada se puede generar a una velocidad de 1,6 kHz, con una duración de 20 mu s. Los LED se pulsaron con una rápida MOSFET de potencia del transistor de efecto de campo. grabaciones simultáneas con diferentes indicadores pueden ser realizadas por el tiempo de multiplexado de los LEDs. Desafortunadamente, la luz emitida por los LEDs es más difícil de enfocar en una fibra óptica en comparación con un haz láser. Por lo tanto, el principal inconveniente de nosotrosing LEDs es que sus perfiles de emisión tienen desplazamientos angulares (± 15 °) con respecto al eje principal, y una óptica auxiliar se deben utilizar para corregirlo.
En todas las configuraciones ópticas descrito anteriormente, la luz de excitación se refleja con la ayuda de un espejo dicroico. El haz se enfoca posteriormente por una lente asférica y un objetivo de microscopio sobre una fibra óptica multimodo que se coloca sobre el tejido. Como en cualquier disposición de epifluorescencia, el espejo dicroico también sirve para separar la excitación de la luz emitida. El espectro de la luz emitida viaja de nuevo a través de un filtro de barrera para eliminar cualquier excitación reflejada. Por último, la luz emitida es enfocada con un objetivo en un fotodetector (Figura 1).
La transducción de la luz a la corriente eléctrica se realiza mediante fotodiodos de avalancha de silicio. Estos diodos tienen una respuesta rápida y una alta sensibilidad que permite la detección de poca luz. losfotocorriente producida por los fotodiodos de avalancha puede ser amplificada en dos formas: un amplificador de transimpedancia que tiene un elemento de realimentación resistiva (Figura 1e) o por un integrador para convertir la corriente en una tensión (Figura 1f). Usando el primer enfoque, la tensión de salida es proporcional a la fotocorriente y la resistencia de realimentación. Un ejemplo típico de la detección de resistencia de pulsos de láser de picosegundos se muestra en las Figuras 2a, 2b y 2c. Panel 2a ilustra la salida del amplificador de transimpedancia y el panel 2b muestra una expansión en el tiempo del intervalo indicado con un asterisco (*). Un algoritmo de rastreo de picos se llevó a cabo para detectar el pico (rojo) y la base (verde) para las respuestas fluorescentes 12. La medición de la fluorescencia de base proporciona información tanto de la corriente oscura del fotodiodo de avalancha y las interferencias introducido por lig ambienteht y acoplamiento electromagnético. Una representación de picos y bases se muestra en la Figura 2c. Esta figura ilustra la fluorescencia emitida por el tinte (Rhod-2) unido a Ca 2+ durante el ciclo cardíaco de un corazón que late periquito.
En el segundo método, la tensión de salida del integrador es una función de la realimentación de corriente y capacitiva (figuras 2d, 2e, y 2f). Figura 2f muestra dos ciclos consecutivos de integración: el primero sin la iluminación interior y la segunda con pulsos de luz aplicada desde un LED pulsada. Una descripción detallada se presenta en las Figuras 2G y 2H. Este enfoque, aunque más laborioso, proporciona una mayor S / N debido a la ausencia de ruido térmico en el condensador de realimentación. El instrumento incluye una etapa de temporización que genera todo el control y la multiplexación de la luz de excitación y los comandos de la integración cabezal de la platina y reset períodos. Esto se realiza por lo general con un circuito de procesamiento de señal digital que también realiza una diferenciación digital de la señal de salida integrado mediante el cálculo de una regresión en línea de los datos. En el caso de utilizar una realimentación resistiva, cualquier tarjeta de adquisición de A / D se puede utilizar.
Finalmente, nuestra técnica LFFM es muy versátil y puede adaptarse para grabar desde más de una región. La adición de un divisor de haz en el camino de la luz nos permite dividir la luz en dos fibras ópticas. Cada fibra óptica entonces se puede colocar en diferentes regiones de un tejido que, independientemente, excitar y emisión registro de las sondas fluorescentes exógenos. Esta modificación nos permite evaluar la forma anatómica diferencias regionales influyen en las variables fisiológicas. La Figura 3 muestra un divisor de haz que se emplea para dividir la luz de excitación CW tal que dos fibras ópticas se utilizan para medir transmural intracelular eléctrico o [Ca2 +] niveles ingenioh menor invasividad. señales transmurales se pueden grabar mediante la colocación de una fibra en el endocardio y el otro en la capa de epicardio de la pared ventricular. Por lo tanto, la técnica LFFM tiene la capacidad de medir la evolución temporal de señales celulares en diferentes regiones y se puede utilizar para probar si los cambios regionales se producen en situaciones patológicas.
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Protocol
Este protocolo y todo el manejo de los ratones fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Merced (N ° 2008-201). Los experimentos se llevaron a cabo con periquitos en 1999 de acuerdo con las políticas generales para el uso de animales establecida por la comisión científica del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).
1. Preparación de Langendorff Configurar
- Preparar la solución de Tyrode que contiene las siguientes concentraciones de soluto en mM: NaCl 140, KCl 5,4, 2 CaCl2, MgCl2 1, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucosa, 10 HEPES. Ajustar el pH de la solución de Tyrode a 7,4 con NaOH y filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 micras.
- Cargar la solución Tyrode en las jeringas 60 ml y todos los tubos de la Langendorff horizontal configuración 11, 12 se ilustra en la Figura 4. Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire.
- Conectar un tubo de plástico a un tanque de O2.
- Añadir un adaptador de soporte de plástico para bajar un "tubo 5 en la solución de Tyrode en la jeringa de 60 ml.
- Adjuntar un difusor de aire de plástico para el extremo del tubo de 5 ", de modo O 2 voluntad burbuja a cabo en la solución de Tyrode.
- Colocar una sutura quirúrgica no absorbible alrededor de una aguja usada como una cánula. La aguja está acoplado al colector (véase la figura 4) que permite retro-perfusión con soluciones diferentes. Por último, la aorta del corazón se canuló en la aguja.
2. Preparación de los animales y disección del corazón
- Pesar e inyectar el ratón con heparina (ex. Ratón de peso 20 g, inyectar con 20 unidades o 200 mu l) 15 min antes de la eutanasia por dislocación cervical. Anestesiar periquitos de acuerdo to las guías de uso de los animales de su protocolo de IACUC y luego proceder con la dislocación cervical.
NOTA: Use las 8 semanas de edad ratones o 20 g periquitos. - Retire el corazón de la cavidad torácica después de la eutanasia. Extraer los corazones parakeet exactamente de la misma manera como se describe para los ratones.
- Limpiar el pecho del ratón con etanol.
- Con unas tijeras de disección, hacer una incisión en la parte inferior del abdomen y luego se corta por los lados hacia el cuello.
- Tire hacia atrás el tejido cortado y el pin hacia abajo.
- Cortar el diafragma. Tenga cuidado al cortar el diafragma para evitar daños en el corazón.
- Retire los pulmones y el tejido circundante.
- Use pinzas para sacar el corazón sin apretar. Cortar la aorta el mayor tiempo posible.
- Transportar el corazón en un pequeño barco sopesar con aproximadamente 1 ml de solución de Tyrode.
- El uso de una sutura quirúrgica no absorbible, atar la aorta sobre el aparato de Langendorff horizontal a través de unaaguja. Ate la aorta del corazón con la ayuda de dos pinzas finas. Comience retro-perfusión mediante la apertura de la válvula situada en serie con las jeringas de 60 ml que contenían solución Tyrode.
- Deje que el corazón se estabilice durante 10 min. Utilizar este tiempo para limpiar la sangre y el tejido graso que rodea el corazón antes de cargar el colorante. Tire del tejido graso, cerca de la base del corazón con unas pinzas y cortar el uso de pequeñas tijeras de disección. Asegúrese de hacer esto bajo el punto de vista de un microscopio de disección.
3. citosólica de Ca 2 + Medidas: Preparación del tinte Rhod-2AM
- Añadir 20 l de la Pluronic 20% (un tensioactivo no iónico) en DMSO a un vial de plástico empaquetado especial proporcionado por el fabricante de colorante que contiene 50 g del colorante.
- Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo, evitando las burbujas.
- Transferir el DMSO se mezcla con el tensioactivo no iónico y el colorante del vial de plástico empaquetado especial en un vial de vidrio transparente. Añadir 1 ml de Tyrode Solución al vial de vidrio transparente.
- Someter a ultrasonidos durante 15-20 minutos en un baño de ultrasonido.
- Perfundir el colorante usando bombas peristálticas durante 30 min a temperatura ambiente.
- Coloque el colorante en la cámara de tinte.
- Usar una abrazadera mecánica para comprimir todas las otras líneas de tubos conectados al colector. La abrazadera se coloca sobre el colector. Esto evitará cualquier reflujo en el tubo conectado a los 60 jeringas ml.
- Encienda la bomba peristáltica de perfusión para comenzar a hacer circular el tinte. cerrar inmediatamente la válvula de 3 vías por debajo de la jeringa de 60 ml.
- Coloque un pequeño tubo que está conectado a la bomba peristáltica de succión al lado del corazón para recircular el colorante que se ha perfundido en el corazón.
4. Intra-SR Ca2 + Medidas: Preparación del tinte Mag-Fluo4AM
- Preparar Mag-Fluo4AM de la misma manera como Rhod-2AM. Consulte la sección 3 para obtener instrucciones graduales.
- After de cargar el colorante, abrir la válvula situada en serie con las jeringas de 60 ml que contenían solución Tyrode para comenzar retro-perfusión. Asegúrese de retirar la pinza por encima del colector.
- Añadir solución de Tyrode a la cámara horizontal y calentar a 37 ° C.
- Retro-perfuse con solución Tyrode durante 45 minutos para eliminar el tinte citosólica.
5. Membrana medidas de potencial: Preparación del tinte Di-8-ANEPPS
- Añadir 5 ml de etanol al 99% al vial de tinte que contiene 5 mg del colorante.
- Alícuota de 10 l en 500 viales de 1 ml de plástico individuales utilizando una pipeta repetidora.
- Desecar en un vacío de velocidad y se almacena a -20 ° C.
- Añadir 20 l de 20% de Pluronic en DMSO a un vial de plástico con 10 g del colorante desecado.
- Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo, evitando las burbujas.
- Transferir la mezcla que contiene DMSO con pluronic y el tinte del vial de plástico a un cilindro graduado (10 ml). Añadir solución de Tyrode a un vo últimolume de 5 ml.
- Someter a ultrasonidos durante 20-25 minutos en un baño de ultrasonido.
- Perfundir en el corazón durante 30 minutos usando bombas peristálticas. Consulte las instrucciones paso a paso en la Sección 3.5.
6. Grabación de señales de epicárdicos
- Después de cargar el colorante, retro-perfundir el corazón con una solución de Tyrode mediante la eliminación de la pinza por encima del colector. Abrir la válvula situada en serie con la jeringa 60 ml que contenía solución de Tyrode. solución Tyrode Retro-perfuse durante 10 minutos para estabilizar el corazón.
- Llenar la cámara horizontal con solución de Tyrode y encienda la unidad Peltier para llevar la temperatura del baño a 37 ° C.
- Coloque la fibra óptica en la superficie del corazón.
- Coloque la fibra óptica dentro de una pipeta de 2 ml y luego coloque la pipeta a un micromanipulador.
- Utilice el micromanipulador para presionar ligeramente la fibra óptica contra la superficie de la LV.
- Externamente el ritmo de la HEART con un estimulador controlado por un generador de ondas.
- Programar el generador de ondas para proporcionar un impulso cuadrado con una anchura de 1 ms.
- Ajuste el estimulador para ser sincronizado externamente y conectar la entrada externa al generador de ondas.
- Para cada salida del estimulador, conectar un cable con una aguja de acupuntura soldada en el extremo.
- Coloque ambas agujas de acupuntura en el vértice del corazón aproximadamente 3 mm uno de otro.
- Sólo después de que las agujas se colocan en el tejido, activar la salida del estimulador para evitar descargas eléctricas.
- En el software de adquisición, ajustar la frecuencia de adquisición a 10 kHz.
7. Grabación de señales de endocárdico
- Consulte el paso 6.1 y 6.2 para estabilizar el corazón después de cargar el colorante.
- El uso de un punto de 23Ga agudo sobre el tamaño de la fibra óptica, hacer un pequeño agujero en la superficie del corazón en el ventrículo izquierdo cerca del tabique. <li> coloca un adaptador cirugía sclerotomy intravítrea para ayudar en la colocación de la primera fibra óptica en el endocardio usando un micromanipulador.
- Externamente el ritmo del corazón. Consulte el paso 6.4.
- En el software de adquisición, ajustar la frecuencia de adquisición a 10 kHz.
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Representative Results
AP y Ca 2 + transitorios en el endocardio y el epicardio
Con el fin de comparar las señales a través de la pared ventricular, una fibra óptica está posicionado en el endocardio y el otro en el epicardio. La comparación de la morfología de un AP grabado desde el endocardio con uno desde el epicardio es la mejor manera de evaluar la función transmural. La pared ventricular es muy heterogénea y por lo tanto, la morfología de los puntos de acceso son muy diferentes en estas dos regiones. Es bien conocido que el endocardio tiene menos I a que el epicardio 17, 18, 19. Cuanto menos que hace la repolarización de la fase 1 más lento en el endocardio 18, 20. Figura 5b shOWS una grabación óptico típico de la AP desde el endocardio y el epicardio. Para realizar estas grabaciones, corazones ratones fueron cargadas con el colorante potenciométrico di-8-ANEPPS y la fluorescencia se midió usando la técnica CLFFM. La morfología de la AP ópticamente grabada, sobre todo en la fase 1, se muestra un curso más lento tiempo para el endocardio (Acción Duración Potencial (APD) 30 es 8.01 ms ± 2,5) en comparación con el epicardio (3,4 ms ± 0,59) (Figura 5b). En general, la APD puede ser descrito como el tiempo que tarda el AP para repolarizar un cierto porcentaje incluyendo 30, 70 o 90 (Figura 5a). Estas trazas se han normalizado y desplazado a tener fase superposición 0. Al comparar los APDs (Figura 5c), vemos que el endocardio y el epicardio son significativamente diferentes durante la fase 1. Aunque estos puntos de acceso son señales de fluorescencia, pueden ser calibrados a un específica potencial de membrana, midiendo simultáneamente el AP con unamicroelectrodos aguda lleno de 3 M KCl 13.
Además de potencial de membrana, los indicadores fluorescentes exógenos se pueden utilizar para supervisar intracelular [Ca 2 +]. Por lo general, usamos Rhod-2AM para medir intracelular de Ca 2 + transitorios debido a su alto rango dinámico y su capacidad de permanecer en el citosol, incluso a temperaturas fisiológicas. La figura 6b muestra una grabación típica de los intracelular de Ca 2 + transitorios en la capa endocardio y el epicardio. Estos resultados se han publicado parcialmente 15. Con el fin de comparar las diferencias regionales en el nivel intracelular [Ca 2 +], la cinética de los Ca 2 + transitorios fueron evaluados (Figura 6a). En general, el análisis de los transitorios de Ca2 + cinética (Figura 6c) muestra que el Ca 2 + transitorios desde el endocardio tenían significativamente cinética más lenta que las realizadas desde el epicardio.
Ca 2+ dinámica en el lumen del SR
En el corazón, el ascenso y la caída de intracelular [Ca 2 +] niveles son críticos en la definición de muchas variables fisiológicas incluyendo la presión, la contractilidad y la duración de la acción potencial (APD). La sección anterior describe nuestra capacidad para medir los citosólica de Ca 2 + transitorios. El Ca 2+ liberado del SR es en gran parte responsable del aumento de la intracelulares citosólicos de Ca 2+. Por lo tanto, por cada aumento en el Ca intracelular 2+ hay un Ca 2+ el agotamiento de la SR. Sin embargo, citosólica de Ca 2 + transitorios no se deben únicamente a SR liberación de Ca2 +, pero también incluyen Ca2 + que entra en la célula a través de la membrana plasmática. nuestro laboratorio16 ha sido capaz de evaluar el contenido de SR Ca 2+ por el uso de un colorante fluorescente, Mag-Fluo-4 a.m.. A pesar de este colorante se esterifica-des en el sarcoplasma y la SR, los miocitos pueden extruir a cabo la fracción citosólica. Esta extrusión de colorante puede ser promovida por el simple aumento de la temperatura a 37 ° C. A esta temperatura, el colorante citosólica se elimina por un casete de unión a ATP similar a la proteína de membrana. Afortunadamente, esta proteína no está presente en la membrana SR. Por lo tanto, después de aumentar la temperatura a 37 ° C, la fluorescencia registrado utilizando la técnica de PLFFM es principalmente un resultado de la Ca 2 + vinculante para el tinte dentro de la SR. Con el fin de probar la especificidad de la medición orgánulo, se aplicó un impulso de cafeína para estimular la liberación de Ca2 + a través de RyR. Es posible observar que la señal es de hecho un resultado de la disminución SR (Figura 7). La cafeína inducida por SR Ca 2 + liberación (Figura 7a) Producir tanto, una disminución en el nivel diastólico de Mag-Fluo-4 de fluorescencia (92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012)) y una disminución en la amplitud de Ca 2 + transitorios (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Rastros SR intra registraron antes y después del estímulo de cafeína están representados en la figura descendente 7b-7d. Como el tiempo progresa desde el estímulo cafeína, amplitud de la depleción de SR es menor. Figura 7e ilustra que el agotamiento de SR no sólo induce una disminución de la amplitud de la señal de Ca2 +, sino también se ralentiza el proceso de liberación SR Ca 2 +. La traza de fluorescencia en la Figura 7a se ha publicado previamente 15.
Pulsada LED: Los potenciales de acción
En la Figura 5 se demostró que Di-8-ANEPPS puede informar de los cambiosen el potencial de membrana cuando se excita a 532 nm. Bajo esta condición de excitación, hay una disminución de la fluorescencia emitida a longitudes de onda superiores a 590 nm. Curiosamente, cuando este colorante potenciométrico es excitado cerca de su máxima longitud de onda de excitación (~ 476 nm), la emisión de fluorescencia de los cambios de tinte a las longitudes de onda más bajo cuando el despolariza la membrana. En consecuencia, este cambio espectral nos permite registrar la fluorescencia emitida en dos longitudes de onda diferentes. Esta propiedad espectral de Di-8-ANEPPS permite el racionamiento de la fluorescencia emitida grabado en dos longitudes de onda diferentes, una característica que es por lo general de gran valor porque la grabación computarizada final será independiente de la concentración de colorante en la membrana. Con el fin de aprovechar al máximo el desplazamiento espectral Di-8-ANEPPS, utilizamos LED de impulsos como fuente de luz. Se utilizó la luz azul emitida en impulsos para excitar el fluoróforo. La excitación se realizó a 485 nm, cerca de la longitud de onda de absorción máxima de Di-8-APNPA (~ 476 nm). Adquisición de dos bandas espectroscópicas de emisión diferentes y permite la formación relación de la capacidad de aumentar S / N y rechazar el ruido de modo común como la luz ambiental y un artefacto de movimiento en la contratación de corazones en los que no se ha utilizado la blebbistatin desacoplador mecánico. Esta situación es muy importante para las condiciones experimentales en los que tanto la actividad mecánica del corazón y la cinética de Ca 2 + transitorios deben ser medidos de forma simultánea.
El diagrama de temporización de la PLEDFM se ilustra en la figura 8a. El diagrama incluye la lógica de control para la integración y puesta a cero del cabezal de la platina de fotodetección, el tiempo de encendido y apagado del LED y la conversión de analógico a digital. Durante el curso de tiempo de un punto de acceso, la fluorescencia detectada en la banda de longitud de onda verde muestra un aumento en la intensidad mientras que la fluorescencia detectada en la banda roja disminuye. La Figura 8B muestraque el cambio de la señal de fluorescencia producida por la despolarización de la membrana se mueve en diferentes direcciones. Sin embargo, el artefacto de movimiento producido por la contracción del corazón está siempre orientado en la misma dirección, independientemente de la longitud de onda de emisión. Como se ha explicado antes, los datos de ambos canales (verde y rojo) deben ser software acondicionado antes de calcular la relación. El acondicionamiento incluye correcciones de offset y ganancia. La selección de las correcciones del nivel de offset y ganancia no es automática. El usuario del software tiene que seleccionar las variables para acondicionar las trazas antes de la relación. La relación resultante en el panel de 8b (Figura 8), muestra que el artefacto introducido por el movimiento de miocardio ha cancelado.
El cambio relativo de fluorescencia di-8-ANEPPS durante un AP es generalmente muy pequeño (~ 8% por cada 100 mV). Este di-8-ANEPPS cambio de fluorescencia es mucho menor que la producida por la bindin Ca 2+g a Rhod-2 (<200%). Por lo tanto, con el fin de aumentar la relación señal a ruido de di-8-ANEPPS, múltiples grabaciones pueden ser promediados.
Pulsada LED: registros simultáneos de Ca 2+ y el potencial de membrana
El último gol uso de este enfoque experimental consiste en la realización de grabaciones simultáneas de Ca 2 + transitorios y los puntos de acceso. grabaciones simultánea de múltiples señales fisiológicas requieren resolver las dificultades técnicas relacionadas con diferentes aspectos del sistema, incluyendo: el acoplamiento de la fuente de luz con la fibra óptica, que coincida con el espectro de absorción del colorante con la emisión de los LED, el diseño de la analógica y un circuito electrónico digital para generar la sincronización y la adquisición, así como el desarrollo de software rápido para analizar los datos en línea.
Yo sér estudio, la selección de los colorantes depende de sus características espectrales. Flourophores utilizados para medir diversas señales deben absorber en diferentes bandas espectrales. Esta condición es esencial distinguir entre fuentes de señal. Cada vez que un LED que tiene una longitud de onda diferente se utiliza para excitar el tejido, la fluorescencia detectada corresponde a la señal relacionada con el colorante que absorbe en esa longitud de onda. De esta manera, la emisión de fluorescencia procedente de diferentes tintes, pero en la misma banda de longitud de onda, se pueden distinguir por la hora en la que cada uno es excitado.
Sin embargo, la diafonía entre los espectros de colorantes no puede ser totalmente evitada. Esto se debe a las características de absorción espectral de los colorantes hacen absorben luz con longitudes de onda lejos de su pico de absorción. En nuestros experimentos, la diafonía se produce en dos formas: (1) Rhod-2 está excitado por el LED azul, la adición de una señal de Ca2 + a la Channe rojal traza AP, y (2) Di-8-ANEPPS ser excitado por el LED verde, que aparece en el Ca 2 + señal transitoria (Figura 9f). Esta diafonía se puede corregir en línea, como se ilustra en la Figura 9. El procedimiento funciona debido a que la señal de intrusión es un pequeño porcentaje de la señal que debe ser medido. Por último, el uso de este tipo de procesamiento algebraica del fluorecence de los colorantes nos permitieron separar AP (Figura 9d) forman Ca 2 + transitorios (Figura 9H). Una descripción detallada de este proceso se describe en la leyenda de la figura. Es importante darse cuenta de que todos los experimentos de LED pulsada se realizaron un 28 ° C.
Figura 1: El campo local microscopía de fluorescencia (LFFM). El LFFM consiste en un arreglo de epifluorescenciael uso de una fibra óptica multimodo que está en contacto con el tejido para registrar la fluorescencia emitida a partir de colorantes exógenos perfundidos en el corazón. El LFFM configuración puede usar tres fuentes de luz diferentes, incluyendo (a) PLFFM, donde la luz de excitación es proporcionada por un pico de pulsos láser Nd-YAG; (B) CLFFM, cuando se usan láseres de onda continua y los pulsos de luz son generados por un modulador ferroeléctrico que permite la multiplexación de láseres con longitudes de onda diferentes; y (c) PLEDFM, donde los LEDs tienen espectros de emisión más amplias con picos de emisiones de (D) 485 nm y 540 nm para los LED azul y verde, respectivamente, son pulsadas por vía electrónica. Cuando se utilizan fuentes de láser, el haz se desenfocado por un expansor de haz. Finalmente, espejos dicroicos y lentes objetivo enfocar el haz sobre el extremo distal de la fibra óptica del que está ligeramente presionado contra el tejido. La luz emitida se desplaza hacia atrás a través de la misma fibra óptica, espejo dicroico, emifiltros de fisión, y se enfoca sobre un fotodiodo de avalancha donde los fotones se convierten en una corriente eléctrica. La corriente puede ser amplificado por dos métodos (e) amplificador de transimpedancia, donde la tensión de salida resultante es proporcional a la fotocorriente y de la resistencia de realimentación; (F) integrador, en el que el voltaje de salida es una función de la realimentación de corriente y capacitiva. Finalmente, la señal es adquirida por un convertidor A / D y ver en un ordenador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: resistiva y capacitiva de conversión. (A) Se muestra un ejemplo típico de la detección de resistencia de los pulsos láser de picosegundos. El asterisco (b)muestra un intervalo de tiempo ampliado, donde un algoritmo de seguimiento de pico se llevó a cabo para detectar el pico (rojo) y la base (verde). (C) Una representación de las huellas calculadas a partir de los picos y las grabaciones de las bases se muestra para Rhod-2 respuestas fluorescentes en un corazón latiendo periquito ritmo externamente a las 7 Hz y la temperatura del baño fijados a 37 ° C. d a h) La fotocorriente convertido por un integrador utilizando una retroalimentación capacitiva. Grabaciones típicos de corazón intacto ratón Ca 2 + transitorios se muestran en dos escalas de tiempo diferentes (D y E). (F) Se muestra la integración de los dos ciclos consecutivos con y sin iluminación por LED. La integral de la señal aumenta linealmente a medida que la fotocorriente carga el condensador de realimentación. La pendiente de la dependiente del tiempo integral (tan (ɵ)) es proporcional al número de fotones que afectan la unión avalancha además de la recombinación electrón-hueco inducida por la pactividad hononic cuando el diodo de avalancha no detecta ningún fotones. Las señales digitales para controlar la integración cabezal de la platina y RESET períodos se indica en el grupo g. Las señales detectadas durante el período de no iluminar (CC) y el LED que ilumina (F) se muestran en el panel h. La resta de F y DC proporciona la medición real de la fluorescencia detectada Ca 2 + transitorios de ratones corazones de ritmo externamente a 9 Hz a 37 ° C (h). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: LFFM de epicardio y endocardio mediciones. El CLFFM configuración se utilizó para medir la fluorescencia emitida a partir de colorantes fluorescentes exógenas presentes en el epicardio unacapas endocardio d. La adición de un divisor de haz facilitó la grabación de diferentes variables fisiológicas en el epicardio y endocardio. Dos fibras ópticas se utilizan con sus cabezales individuales para detectar desde el epicardio y el endocardio. Una pequeña incisión circular se hizo en el ventrículo y una fibra óptica se ha enhebrado a través grabar desde el endocardio. Esta configuración utiliza un convertidor de corriente a voltaje con una retroalimentación resistiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cámara horizontal con control de temperatura. Un diagrama que muestra la puesta a punto de Langendorff donde los corazones se mantienen intactas funcional durante horas. El corazón está ligado a una aguja a través del cual todas las soluciones y colorantesse retro-perfundido en el corazón a través de las coronarias de ramificación de la aorta. La cámara se coloca por encima de una unidad de peltier para mantener la temperatura del baño, que es leído por un sensor de temperatura conectado a un voltímetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Acción transmural medidas de potencial en los corazones intactos. (A) Acción duración potencial (APD) se evalúa como el tiempo que tarda en completar 30%, 70%, o 90% de la repolarización AP. (B) Di-8-ANEPPS fluorescencia desde el epicardio (negro) y endocardio (gris) mostrar AP diferencias morfológicas en la repolarización entre las dos capas de la pared ventricular. (C) Después de evaluar tque APD 30, 70, y 90 en el endocardio y el epicardio, los resultados mostraron diferencias significativas sólo se produjeron en 30 DPA (8 ± 2,5 ms endocardio vs 3 ± 0,6 ms epicardio). Los corazones se estimula a 6 Hz y temperatura fijada en 37 ° C. Los datos son la media ± SEM de 5 corazones. * P <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: transmural Ca2 + Medidas transitorias en los corazones intactos. (A) Los parámetros de la cinética de Ca2 + transitorios medidos son: el tiempo que tarda en alcanzar la máxima, tiempo hasta el pico (TP); el tiempo que tarda en pasar de 10% a 90% de la subida, tiempo de subida (RT); el tiempo que tarda en pasar de 10% a 90% de la desintegración, el tiempo de desintegración (DT); y eltiempo que tarda en completar 50% del transitorio, media duración (HD). (B) La fluorescencia emitida por Rhod 2 después de la excitación con un láser verde CW espectáculo epicardio (negro) y el endocardio (gris) Ca 2 + transitorios con las diferencias en la relajación. c) Ca 2 + transitorios desde el endocardio tenía una cinética significativamente más lentas en RT, TP, HD, y DT a los registrados desde el epicardio. Los corazones se estimula a 6 Hz y temperatura fijada en 37 ° C. Los datos son la media ± SEM de 5 corazones. * P <0,05. Modificado de Mattiazzi et al. 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Las mediciones Intra Ca 2+ SR en los corazones intactos.(A) La fluorescencia emitida por el colorante Mag-Fluo-4 gotas en el tiempo, lo que refleja una disminución de la concentración de SR intra Ca 2 +. (B) La vista ampliada de la disminución de la Mag-Fluo 4 de fluorescencia que indica el agotamiento de Ca2 + inducida por Ca 2 + liberación de la SR. (C) una vista ampliada de la disminución de la amplitud transitoria de Mag-Fluo 4 de fluorescencia que representa Ca2 + liberación modificada por la perfusión de corazones con cafeína 20 mM. (D) Después de un largo aplicación de cafeína, una disminución tanto en el nivel diastólico de Mag-Fluo-4 de fluorescencia y en la amplitud de Ca 2 + transitorios [a 92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012) y se observa 51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003) de los valores iniciales, respectivamente],. Como más tiempo avanza de la cafeína, menor es la amplitud de la depleción de SR. (E) las trazas normalizadas en bd muestra que el agotamiento SR no sólo inducens disminuye la señal de Ca2 +, pero también ralentiza SR Ca 2+ reposición. Los corazones se estimula a 4 Hz y temperatura fijada en 37 ° C. Rastro de fluorescencia es de Kornyeyev et al. 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Mediciones Ratiometric de puntos de acceso en el corazón intacto con LED pulsada. (A) El diagrama de temporización que incluye la integración y la puesta a cero del cabezal de la platina, se ilustra on-off momentos del LED y una grabación real. (B) Las huellas de los dos canales tienen diferentes valores de reposo y el desplazamiento es corregido al mover las palancas hasta que cada punto de acceso está precedido por un valor de reposo. Ganancia de cada canal es también adjusted. Tenga en cuenta que una gran artefacto de movimiento aparece en ambos canales entre las dos despolarizaciones. Después de que el software procesa las señales ratiometrically, el resultado es un punto de acceso sin artefactos perceptibles (azul). Los corazones se estimula a 3 Hz y temperatura fijada en 28 ° C. Todos los registros mostrados son una media de 10 restos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: simultáneas Ca 2 + transitorios y Medidas de AP en los corazones intacto con LED pulsada. La contaminación de la diafonía de las señales cuando se graban tanto Ca2 + y AP puede ser corregida en línea. El tinte potenciométrica, di-8-ANEPPS, se excita con 20 pulsos mu s LED azules (a). Las señales son split, se filtró con rojo de paso de banda y los filtros verdes. Estas señales son detectadas por dos fotodiodos de avalancha diferentes indicados como el rojo (b) y el canal verde (c). Es posible observar que ambas señales, rojo y verde, presentan un artefacto de movimiento notable que aparece como una desviación hacia abajo. Ambas señales, rojo y verde, están Feria neutra y luego se amplifican. Las señales de acondicionado se utilizan para calcular la relación entre ellos y el resultado se muestra en d. Es posible observar que en la relación entre ambas señales (d) los artefactos móviles se cancelan. Panel e ilustra la secuencia de pulsos lógicos que controlan un LED que emite color verde utilizado para excitar el indicador de Ca 2+ Rhod-2. Señales fluorescentes obtenidos mediante este procedimiento se muestran en la f. Aunque la traza en f muestra principalmente un aumento en la señal de fluorescencia debido a la bindin Ca 2+ga Rhod-2, también es posible observar una desviación negativa en la traza debido a una señal detectada por fluorescencia de Di-8-ANEPPS cuando este colorante se excita con luz verde. Este problema se puede corregir restando la señal potenciométrica se muestra en g. El resultado de la resta se muestra en el panel h en una Ca 2 + la señal de forma que se obtiene una contaminación AP. Los corazones se estimula a 3 Hz y temperatura fijada en 28 ° C. Todos los registros mostrados son una media de 10 restos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este documento se centra en la descripción de las técnicas de fluorescencia de campo de la zona para evaluar la función de los miocitos cardíacos ex vivo. El estudio de estas células en un medio ambiente junto no sólo es más fisiológica, pero también es muy adecuado para evaluar patologías a nivel de órganos. Los eventos celulares que subyacen acoplamiento excitación-contracción (ECC) se pueden evaluar en todo el nivel de órganos con el uso de sondas moleculares que controlan la dinámica de Ca2 + intracelular (Rhod 2 citosólica de Ca2 +, Mag-Fluo4 SR Ca2 +) y actividad eléctrica (di-8-ANEPPS). Aquí, hemos presentado tres técnicas LFFM epifluorescencia que tanto excitar y recopilar la emisión de indicadores fluorescentes que utilizan fibras ópticas. Ellos difieren en función de la fuente de luz utilizada y el tipo de modulación de la luz. El PLFFM utiliza un láser de pulsos de luz que, CLFFM utiliza luz láser continuo, mientras que LEDFM utiliza LEDs que también se puede pulsar en el PLEDFM. Todos estosse presentan en la Figura 1 como un conjunto, sino que puede ser construido con sólo una de las tres disposiciones de epifluorescencia. Además, la luz detectada se puede procesar de diferentes maneras. Por ejemplo, la Figura 2 ilustra dos situaciones diferentes en las que la fotocorriente puede ser o bien integrado o directamente convertida a un voltaje por medio de un convertidor de corriente a voltaje. En general, el enfoque LFFM se puede utilizar para medir simultáneamente varios sitios anatómicos, como se ve por la figura 3.
El método que aquí se presenta para la evaluación de propiedades cardiacas en el nivel del órgano intacto es más adecuado para estudiar los problemas en los que el acoplamiento entre las células es crítico en la definición del comportamiento del tejido. La heterogeneidad intrínseca del corazón pueden producir diferentes formas de onda AP 13, 21, 22 basado en el tejido específico del que ceLLS se originan. Por lo tanto, los estudios de órganos enteros proporcionan la oportunidad de evaluar la función fisiológica local de la célula en diferentes estructuras anatómicas. Por otra parte, hemos visto que los eventos intracelulares como las chispas y las ondas tienen diferentes cinéticas en células disociadas que en el órgano intacto 15.
La puesta a punto de Langendorff (Figura 4) es crítico para mantener el corazón en una situación que está más cerca in vivo. Además, permite la retroperfusión de múltiples drogas y diversas sondas moleculares fluorescentes que permiten la medición de varias variables fisiológicas. Cambio de las sondas fluorescentes exógenas utilizadas, aumentando el tamaño de la fibra óptica, o la elección de una fuente de luz diferente puede alterar drásticamente la aplicación de la técnica. Además, la unidad Peltier por debajo de la cámara horizontal puede facilitar el estudio de la dinámica de Ca 2 + a diversas temperaturas. La incorporación de accesoriosa LFFM tales como un divisor de haz puede aumentar el número de fibras ópticas que se utilizan para grabar de diferentes regiones en el corazón intacto. Esta es una adaptación muy útil para probar si las diferencias regionales se producen en escenarios patológicos. Figura 3 muestra el endocardio y el epicardio siendo evaluada simultáneamente. Por otra parte, la perfusión del corazón con diferentes agonistas nos permite entender cómo se regulan las diferentes regiones de la pared ventricular. La señalización eléctrica (Figura 5) y Ca 2+ cinética (Figura 6) heterogeneidades se puede comparar en el epicardio y el endocardio. Además, múltiples colorantes con diferentes longitudes de onda de excitación y filtros de emisión se pueden utilizar. Por ejemplo, mediante el uso de Mag-Fluo-4, Ca 2+ niveles en el lumen de la SR se pueden grabar (Figura 7). Variando el tamaño de la fibra óptica también puede ampliar la capacidad de este método, permitiendo la grabación de un fluorescente larger región.
Este documento también muestra que, aparte de los láseres caros, los LED se pueden utilizar como una fuente de luz de excitación en nuestra técnica. La Figura 8 muestra que este tipo de bajo costo de la fuente de luz se puede utilizar para medir ratiometrically APs. La medición radiométrica muestra en la Figura 8 es ventajoso en la producción de una grabación final sin artefactos experimentales, incluyendo los causados por el movimiento. Por último, incluso el transitorio de Ca 2 + y AP pueden ser grabados ópticamente, de forma simultánea, por longitudes de onda diferentes y de multiplexado utilizando colorantes con el mismo espectro de emisión. El procesamiento de las señales se indica en la Figura 9 es crítico en la eliminación de la contaminación interna producido por la superposición de los espectros de emisión de los colorantes. Grabación de Ca 2 + transitorios y los puntos de acceso, de forma simultánea, sino como dos señales de salida independientes es beneficioso en el estudio de ECC y Ca2 + inducida por Ca 2+
LFFM es una técnica con múltiples aplicaciones en la fisiología celular de los tejidos intactos. Sin embargo, una limitación importante es que la fluorescencia registrada es un promedio de la emisión de los indicadores fluorescentes subyacentes en la región local, donde la fibra óptica está en contacto con el tejido. Incluso cuando se utilizan dos fibras ópticas, LFFM no proporciona una distribución espacial subcelular de las señales medidas. Mapeo óptico es una mejor técnica para el seguimiento de las variables fisiológicas que cambian en el espacio y el tiempo, como la propagación de las AP, Ca 2 + transitorios, y la alternancia 23, 24, 25. LFFM también es incapaz de proporcionar imágenes de las estructuras, como la microscopía confocal y otras técnicas de mapeo óptico. Sin embargo, su uso de la fibra óptica hace que sea práctico en el rrabación señales de fluorescencia de la zona desde el endocardio o de otras regiones que son difíciles o imposibles de acceder en un corazón intacto con un microscopio confocal.
La comparación entre las variables fisiológicas obtenidas de corazones intactos y de aislados experimentos de miocitos es un reto. La mayor ventaja de la utilización de los miocitos cardíacos aislados es una oportunidad única para evaluar las propiedades biofísicas de las células en condiciones de patch clamp. Por el contrario, LFFM permite el estudio de fenómenos fisiológicos y patológicos en un entorno más nativo. Por ejemplo, en los corazones intactos podemos evaluar las diferencias transmurales 15, la frecuencia cardíaca de dependencia de AP y Ca 2+ en fisiológica rangos de 13 que son inalcanzables en las células aisladas. Además, podemos estudiar los efectos de una lesión isquémica en la función del corazón intacto 9, 10. Todo el corazón exexperimentos también nos permiten evaluar la interacción entre otros tipos de células y miocitos 11.
LFFM permite la visualización de señales celulares a nivel del corazón intacto en el que las células tienen acoplamiento fisiológico. LFFM permite el estudio de la actividad intracelular mientras que las células están todavía en el órgano intacto. En combinación con tintes fluorescentes y de luz incidente, LFFM puede controlar dos propiedades cardiacas clave: Ca 2+ dinámica y la actividad eléctrica.
Por último, el método presentado aquí puede tener múltiples aplicaciones en el estudio de ECC. Es una herramienta que revela cómo las señales supramolecular se ven afectados en situaciones patológicas tales como arritmias e isquemia 16 9, 15. Esta técnica es una necesidad para el estudio de estas patologías, ya que sólo pueden entenderse a nivel de órganos intactos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Alicia Mattiazzi para la discusión crítica de los trabajos presentados. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (R01 HL-084487) para ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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