Biology

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

Published: March 8, 2017 doi: 10.3791/55202

Yuriana Aguilar-Sanchez*¹, Diego Fainstein*^2,3, Rafael Mejia-Alvarez⁴, Ariel L. Escobar⁵

¹School of Natural Sciences, University of California, Merced, ²Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, ³Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, ⁴Department of Physiology, Midwestern University, ⁵School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

Summary

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

Abstract

בלב, מחקרי איתות מולקולריים בדרך כלל מבוצעים מיוציטים מבודדים. עם זאת, במצבים פתולוגיים רבים כגון איסכמיה והפרעות קצב ניתן רק מובנים לחלוטין ברמת האיבר השלמה. כאן, אנו מציגים טכניקה ספקטרוסקופיות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי (LFFM) המאפשר מדידת אותות סלולריים בלב שלם. הטכניקה מבוססת על שילוב של לב perfused Langendorff וסיבים אופטיים להקליט אותות ניאון. יש LFFM יישומים שונים בתחום הפיזיולוגיה הלב וכלי הדם ללמוד את הלב בתנאים נורמליים ופתולוגיים. משתנה לב מרובה ניתן לנטר באמצעות אינדיקטורים ניאון שונים. אלה כוללים cytosolic [Ca ^{2 +],} הרטיקולום תוך sarcoplasmic [Ca ^{2 +]} ופוטנציאלים הממברנה. בדיקות ניאון אקסוגניים נרגשות הקרינה הנפלטת מזוהית עם שלושה הסדרים שונים של טכניקת LFFM epifluorescenceהם מובאים במאמר זה. ההבדלים המרכזיים בין הטכניקות האלה הם הסוג של מקור אור המשמש עירור ובדרך אור העירור היא מווסתת. LFFM פעם (PLFFM) משתמש פעימות ליזר אור בעוד LFFM גל מתמשך (CLFFM) משתמש באור הליזר רציף עבור עירור. לבסוף, דיודות פולטות אור (LEDs) שימשו כמקור האור השלישי. סדר אי-קוהרנטי זה נקרא מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED פעם (PLEDFM).

Introduction

הלב הוא האיבר המרכזי של מערכת הלב וכלי הדם. ההתכווצות של הלב היא שיזמה גידול תאי [Ca ^{2 +].} הקשר בין רגישויות חשמל שינויים במהדורה תאית Ca ^{2 +} נחקרת הסטורית בתאים ניתקים enzymatically ^{^1,} ^2. עם זאת, תאי לב הם חשמליים, מבחינת מטבולית מכאנית מצמידים ^{^3,} ^4. כאשר מבודד, myocytes הם לא רק פיזי זוגיים, אבל מיוציטים משכבות שונות מעורבבים במהלך דיסוציאציה ^5. יתר על כן, למרות היתרונות העצומים שהתפתחו מהמחקר של תאים מבודדים בתנאים מהדקים מתח, ^{^6,} ^{^7,} ⁸ ערך מהותו של הלב בתור alwa syncytium חשמלys מציב את השאלה: כיצד מבחינה תפקודית שונים תאים ניתקו מן הנוכחים בתוך הרקמה ^3.

בכתב היד הזה, אנו מתארים את ההתקדמות שהושגה ידיעת הפיסיולוגיה של לב על ידי השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי (LFFM) טכניקות בלב השלם. LFFM משתמשת אינדיקטורים ניאון כדי למדוד משתנים פיזיולוגיים רבים כגון Ca cytosolic ^2+, הרטיקולום sarcoplasmic התוך (SR) Ca ^{2 +} פוטנציאל הממברנה. מדידות אלו ניתן לקבל בו זמנית בשיתוף עם חדרית לחץ ^{^9,} ^10, אק"ג ^9, פוטנציאל פעולת חשמל (APS), קלטות זרם יוניות ו photolysis פלאש של תרכובות בכלוב ^{^4,} ^11. בנוסף, מדידות אלה ניתן להשיג על ידי צעדה בלב שלם בתדרים גבוהים יותר קרובr ל פיזיולוגיים. למרות כמה מאמרים ^{^9,} ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ¹⁴ פורסמו על ידי הקבוצה שלנו באמצעות טכניקות LFFM, חזק מורכבות טכנית הקשורים הטכניקה הזו מנעה השימוש המסיבי שלה לחקר תופעות פיסיולוגיות vivo לשעבר בלב ובאיברים אחרים.

טכניקת LFFM (איור 1) מבוססת על מדידות epifluorescence שהושגו באמצעות סיב אופטי multimode במגע עם הרקמות. כמו כל טכניקת דימות פלואורסצנטי קשר, ברזולוציה האופטית תלויה בקוטר ואת הצמצם המספרי (NA) של הסיבים. 'גבוה NA וקטנה בקוטר של הסיבים יגדיל את הרזולוציה המרחבית של המדידות. NAS ובקטרי סיבים יכולים לנוע בין 0.22 ל 0.66 מ 50 מיקרומטר 1 מ"מ, בהתאמה. במקמט את NA ישפר את יחס האות לרעש (S / N) על ידי קבלת פוטונים המגיעים מזווית מוצקה גדולה. כדי לפעול כהתקן epifluorescence, קרן האור ממוקדת לתוך הסיב האופטי עם עדשה אספריים או אובייקטיבי epifluorescence שבו NA של העדשה ואת משחק הסיבים. התאמה זה ממקסם את העברת האנרגיה עבור עירור לאיסוף חזרה הפוטונים הנפלטים על ידי fluorophore.

כדי להלהיב את האינדיקטורים פלורסנט אקסוגניים טעונים בתוך הרקמה, מקורות אור שונים מצבי תאורה יכולים להיות מנוצלים. המחקרים החלוציים שלנו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי פעם ^{^3,} ¹² (PLFFM) העסיקו ליזר picosecond בעלות נמוכה (איור 1 א, PLFFM). סוג זה של מקור אור יש יתרון ענק של מרגש חלק גדול של מולקולות fluorophore מתחת לאזור תאורה ללא משמעותית הלבנת לצבוע בשללדופק קצר משכי ^12. בנוסף, השימוש של פולסים אולטרה אפשר ההערכה של חי הקרינה של הצבע ^12. אורך חיי הקרינה הוא נכס שיכול לשמש כדי לכמת את החלק היחסי של מולקולות צבע חייבות Ca ^{2 +.} למרבה הצער, jittering הזמני של פולסים ווריאציות משרעת מן הדופק אל הדופק להגביל את היישום של האסטרטגיה ניסיוני זה אך ורק למקרים בהם שינוי הקרינה המיוצר על ידי ליגנד מחייב לצבוע גדול.

לייזרי גל מתמשכים (CW) משמשים בדרך כלל כמקור התאורה העיקרי LFFM (1b, CLFFM). קרן הלייזר יכול להאיר את רקמת ברציפות או יכול להיות מווסתת ferroelectrically. אפנון ferroelectric של הקרנות מאפשר הדור של פולסים המיקרו של אור. ניתן לשלוט אפנון זה על ידי חומרה חיצונית. נוהל זה לא רק מפחיתה באופן דרמטי tהוא jittering הזמני של להבזקי האור אלא גם מאפשר ערבוב קורות באורכי גל שונים. הערבוב של קורות נעשה על ידי ריבוב קרני לייזרים שונים. כתוצאה מכך, צבעים מרובים בעלי תכונות ספקטרליות שונות יכול להיות נרגש לבצע מדידות של מגוון משתנים פיזיולוגיים, למשל, רוד-2 עבור cytosolic Ca ^{2 +,} MagFluo4 עבור Ca התוך-SR ^{2 +} ו di-8-ANEPPS עבור פוטנציאל הממברנה.

למרות לייזרים הנוכחי יתרונות שונים כמקור אור LFFM, סוגים אחרים של מקורות אור ניתן להשתמש כולל דיודות פולטות אור (LEDs). במקרה זה, מקור אור עירור כלל LED InGaN (איור 1 ג ', PLEDFM). נוריות, פוטונים נפלטים באופן ספונטני כאשר אלקטרונים בפס ההולכה להשתלב מחדש עם חורים פס הערכיות. ההבדל עם לייזרים של מצב מוצק הוא כי הפליטה אינה מגורה על ידי פוטונים אחרים. התוצאה היא קרן בלתי קוהרנטיתפליטת ספקטרליים רחבה יותר עבור נוריות.

ניתן להשתמש בסוגים שונים של נוריות חשמל גבוהות. עבור הקלטות AP באמצעות Di-8-ANEPPS ועבור Ca ^{2 +} הארעיים להקליט באמצעות Fluo-4 או מג-Fluo-4, השתמשנו LED בעל פליטת שיא טיפוסי בבית 485 ננומטר (כחול) ברוחב חצי של 20 ננומטר (איור 1D). עבור ^{2 +} ארעי Ca מוקלט עם רוד-2, הנורית הייתה פליטת שיא אופיינית ב 540 ננומטר (ירוק) ברוחב חצי 35 ננומטר (איור 1 ד). נוריות פולטות באורך גל להקה ולכן דורשות במסננים כדי לצמצם פליטת ספקטרליים שלהם. בנוסף, אור פעמו יכול להיווצר בשיעור של 1.6 kHz עם משך 20 מיקרו-שניות. נוריות היו פעמו עם טרנזיסטור אפקט שדה MOSFET כוח מהר. ניתן לבצע הקלטות סימולטני עם אינדיקטורים שונים על ידי ריבוב זמן הנוריות. למרבה הצער, האור הנפלט על ידי נוריות הוא יותר קשה להתמקד על גבי סיבים אופטיים לעומת קרן לייזר. לפיכך, החיסרון העיקרי מאיתנוing נוריות הוא כי פרופילי הפליטה שלהם יש התקות זוויתי (± 15 °) מהציר הראשי, וכן אופטי עזרו חייב לשמש כדי לתקן את זה.

בכל התצורות האופטיות שתוארו לעיל, אור העירור משתקף בעזרת מראה dichroic. אלומת האור ממוקד בהמשך על ידי עדשה אספריים לבין מטרה מיקרוסקופ על גבי סיבים אופטיים multimode כי היא ממוצבת על הרקמה. כמו בכל הסדר epifluorescence, המראה dichroic משמש גם כדי להפריד בין עירור מן האור הנפלט. ספקטרום האור הנפלט נוסע בחזרה דרך פילטר מחסום כדי להסיר כל עירור משתקף. לבסוף, האור הנפלט מתמקד עם מטרה על גבי photodetector (איור 1).

התמר מאור הזרם חשמלי מבוצעת על ידי פוטודיודות מפולת סיליקון. יש דיודות אלה תגובה מהירה ורגישות גבוהה המאפשרת זיהוי באור נמוך. הפוטונים המיוצרים על ידי פוטודיודות המפולת יכולים להיות מוגברים בשתי דרכים: מגבר transimpedance שיש אלמנט משוב resistive (1e איור) או על ידי אינטגרטור להמיר זרם אל (1F איור) מתח. השימוש בגישה הראשונה, מתח המוצא הוא יחסי הפוטונים ואת נגד המשוב. דוגמה טיפוסית של זיהוי התנגדות של פעימות לייזר picosecond מוצג דמויות 2a, 2b ו 2c. 2a הלוח ממחיש את הפלט של מגבר transimpedance ו -2 לוח מציג התרחבות זמן של המרווח המסומנים בכוכבית (*). אלגוריתם מעקב שיא יושם כדי לזהות את השיא (אדום) ובסיס (ירוק) עבור התגובות פלורסנט ^12. מדידת קרינת הבסיס מספקת מידע הן של הזרם האפל של photodiode המפולת ואת הפרעות שהנהיג lig הסביבהht צימוד אלקטרומגנטי. ייצוג של פסגות ובסיסים מוצג איור 2 ג. נתון זה ממחיש את הקרינה הנפלטת לצבוע (Rhod-2) כבול Ca ²⁺ במהלך מחזור הלב של לב תוכי מכות.

בשיטה השנייה, מתח המוצא של האינטגרטור היא פונקציה של המשוב הנוכחי קיבולי (איורים 2, 2e, ו 2f). איור 2f מציג שני מחזורי אינטגרציה רצופים: ראשון ללא וחיצונית שנייה עם להבזקי אור שימושיים מתוך LED פעם. תיאור מפורט מוצג 2G דמויות 2h. גישה זו, אם כי מייגע יותר, מספקת S גדול / N בשל היעדר רעש תרמי קבל המשוב. המכשיר כולל שלב עיתוי שיוצר כל המלאה ריבוב של אור העירור ופקודות שילוב headstage מילet תקופות. זה מבוצע בדרך כלל עם מעגל עיבוד אות דיגיטלי כי גם מבצע בידול דיגיטלי של אות המוצא המשולבת באמצעות חישוב רגרסיה on-line של הנתונים. במקרה של שימוש משוב resistive, בכל ועדת רכישת A / D ניתן להשתמש.

לבסוף, טכניקת LFFM שלנו היא תכליתיות מאוד יכולה להיות מותאמת כדי להקליט יותר באזור אחד. הוספת מפצל אלומת נתיב האור מאפשרת לנו לפצל את האור לשתי סיבים אופטיים. כל סיב אופטי ניתן למקם ואילך באזורים שונים של רקמות, באופן עצמאי, לרגש פליטת שיא מן בדיקות ניאון אקסוגניים. שינוי זה מאפשר לנו להעריך כיצד הבדלים אזוריים אנטומיים להשפיע משתנים פיזיולוגיים. איור 3 מראה ספליטר הקורה להיות מועסק לפצל את אור עירור CW כך שני סיבים אופטיים משמשים למדידה או תאיים חשמל transmural [Ca ^{2 +]} שנינות רמותh-הפולשנות קטין. אותות transmural ניתן להקליט על ידי הנחת סיב אחד על endocardium והשני על השכבה epicardium של קיר החדר. לכן, טכניקת LFFM יש את היכולת למדוד את מהלך הזמן של אותות סלולריים באזורים שונים וניתן להשתמש בו כדי לבדוק אם שינויים אזוריים להתרחש תחת מצבים פתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה וכל הטיפול בעכברים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי UC מרסד ועדת שימוש (מס '2008-201). ניסויים עם תוכים נערכו בשנת 1999 בהתאם למדיניות כללית לשימוש בעלי חיים שהוקם על ידי הוועדה המדעית של מכון ונצואלה למחקר מדעי (Ivic).

1. Langendorff הגדרת הכנה

הכן פתרון Tyrode המכיל ריכוזי המומס הבאים מ"מ: 140 NaCl, KCl 5.4, 2 ₂ CaCl, 1 ₂ MgCl, 0.33 Na ₂ ₄ HPO, 10 גלוקוז, 10 HEPES. התאם את ה- pH של התמיסה Tyrode 7.4 עם NaOH ולסנן הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
טען את פתרון Tyrode לתוך 60 מזרקי המ"ל וכל הצינורות של Langendorff האופק הגדרת ^{^11,} ¹² באיור 4. ודא לחסל את כל בועות האוויר.
2 באמצעות "אבן אוויר" פלסטיק שקוע כפי שמודגם באיור 4.
1. חיבור צינורות פלסטיק טנק O _2.
2. הוספת מתאם טי פלסטיק להנמיך צינור 5 "לתוך התמיסה Tyrode בתוך המזרק 60 מ"ל.
3. צרף אבן אוויר פלסטיק עד הסוף של הצינור 5 "כך O ₂ בועת רצון אל פתרון Tyrode.
מניח תפר כירורגים לא נספג סביב מחט משמש צינורית. המחט היא מצמידה את הסעפת (ראה איור 4) המאפשרת זלוף רטרו עם פתרונות שונים. לבסוף, אבי העורקים של הלב יהיה cannulated לתוך המחט.

2. הכנת בעלי חיים ולב Dissection

לשקול ולהזריק את העכבר עם הפרין (לשעבר. עכבר של g 20 משקל, להזריק עם 20 יחידות או 200 μL) 15 דקות לפני והרדמת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם. להרדים תוכים פי to המדריכים השימוש בבעלי חיים של פרוטוקול IACUC שלך ולאחר מכן להמשיך עם נקע בצוואר הרחם.
הערה: השתמש עכברים בן 8 שבועות או 20 תוכים גרם.
הסר את הלב מחלל בית החזה לאחר euthanization. חלץ לבבות תוכיים בדיוק באותו אופן כפי שתואר עבור עכברים.
1. נקה את חזה העכבר עם אתנול.
2. בעזרת מספריים לנתיחה, עושים חתך בבטן התחתונה ולאחר מכן לחתוך את הצדדים לכיוון הצוואר.
3. משוך לאחור את הרקמה לגזור בזיהוי מדויק.
4. חותכים את הסרעפת. היזהר בעת חיתוך הסרעפת כדי למנוע נזק ללב.
5. הסר את הריאות ואת הרקמה שמסביב.
6. להשתמש בפינצטה כדי לגרוף את הלב בלי ללחוץ אותה. חותכים את אבי העורקים זמן רב ככל האפשר.
הובלת הלב על סירה לשקול קטנה עם כ 1 מ"ל פתרון Tyrode.
באמצעות תפר כירורגים שאינם נספג, לקשור את אב העורקים על מנגנון Langendorff האופקי באמצעותמַחַט. לקשור את אבי העורקים בלב בעזרת שני פינצטה בסדר. בגין-זלוף רטרו על ידי פתיחת שסתום הממוקם בסדרה עם 60 מזרקים מ"ל המכיל פתרון Tyrode.
אפשר בלב לייצב במשך 10 דקות. השתמש הפעם לנקות דם ורקמת שומן סביב הלב לפני טעינת לצבוע. משוך את רקמת השומן סמוך לבסיס של הלב עם פינצטה לחתוך באמצעות מספריים לנתיחה קטנים. הקפד לעשות זאת תחת לאור מיקרוסקופ לנתח.

3. Cytosolic Ca ^{2 +} מידות: הכנת דיי Rhod-02:00

הוסף 20 μL של 20% pluronic (פעיל שטח בלתי יוני) ב DMSO בקבוקון פלסטיק ארוזים מיוחד שספק יצרן לצבוע המכיל 50 מיקרוגרם של הצבע.
מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
מעבירים את DMSO מעורבת עם פעילי שטח בלתי יוניים לצבוע מבקבוקון פלסטיק ארוזים מיוחד לתוך בקבוקון זכוכית שקופה. הוסף 1 מ"ל של solu Tyrodetion כדי בקבוקון זכוכית שקופה.
Sonicate במשך 15-20 דקות בתוך sonicator אמבטיה.
Perfuse לצבוע באמצעות משאבות פריסטלטיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
1. מניח את הצבע בתא צבען.
2. השתמש מהדק מכאני לדחוס את כל קווי צינורות אחרים המחוברים הסעפת. המהדק ממוקם מעל הסעפת. זה ימנע כל backflow לתוך הצינורות המחוברים 60 מזרקי המ"ל.
3. הפעל את משאבת peristaltic זלוף להתחיל במחזור לצבוע. מיד לסגור את שסתום 3 כיווני מתחת ל -60 מ"ל במזרק.
4. מקם צינורית קטנה המחובר למשאבת peristaltic יניקה ליד הלב כדי recirculate לצבוע כי כבר perfused לתוך הלב.

4. Intra-SR Ca ^{2 +} מידות: הכנת דיי מאג-Fluo4AM

כן Mag-Fluo4AM באותו אופן כמו רוד-02:00. ראה גם סעיף 3 לקבלת הוראות צעד חכם.
After טעינת צבע, לפתוח את שסתום הממוקם בסדרה עם 60 מזרקים מ"ל המכיל פתרון Tyrode להתחיל זלוף רטרו. הקפד להסיר את המהדק מעל הסעפת.
הוסף פתרון Tyrode לתא האופקי ולחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
-Perfuse רטרו עם פתרון Tyrode במשך 45 דקות כדי להסיר את צבען cytosolic.

5. מדידות פוטנציאל הממברנה: הכנת דיי Di-8-ANEPPS

הוסף 5 מ"ל של אתנול 99% כדי בקבוקון צבע המכיל 5 מ"ג של צבע.
Aliquot 10 μL לתוך 500 1 פרט בקבוקוני פלסטיק מיליליטר בעזרת פיפטה מהדר.
לייבש בריק במהירות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
הוסף 20 μL של 20% pluronic ב DMSO בקבוקון פלסטיק עם 10 מיקרוגרם של צבע מיובש.
מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
מעבירים את תערובת המכילה DMSO עם pluronic וצבע מבקבוקון פלסטיק גליל סיימה (10 מ"ל). הוסף פתרון Tyrode על VO סופיlume של 5 מ"ל.
Sonicate במשך 20-25 דקות בתוך sonicator אמבטיה.
Perfuse ללב למשך 30 דקות באמצעות משאבות פריסטלטיות. עיין בהוראות בשלבים בסעיף 3.5.

6. הקלטת איתותי Epicardial

לאחר טעינת הצבע, רטרו-perfuse את הלב עם פתרון Tyrode על ידי הסרת המהדק מעל הסעפת. פתח את השסתום ממוקם בסדרה עם 60 המזרק מ"ל המכיל פתרון Tyrode. פתרון רטרו-Perfuse Tyrode במשך 10 דקות כדי לייצב את הלב.
ממלא את החדר האופקי עם פתרון Tyrode ולהדליק את יחידת פלטייה כדי להביא את טמפרטורת האמבט עד 37 ° C.
מקם את סיב אופטי על פני השטח של הלב.
1. מניחים את סיב אופטי בתוך פיפטה 2 מ"ל ולאחר מכן צרף את פיפטה micromanipulator.
2. השתמש micromanipulator ללחוץ על סיבים אופטיים מעט מול פני השטח של LV.
מבחינה חיצונית לפסוע heaרט עם ממריץ בשליטה מחוללת גל.
1. לתכנת את מחולל הגל לספק דופק מרובע ברוחב של 1 ms.
2. הגדר את הממריץ להיות מסונכרנים חיצוני וחבר את הכניסה החיצונית אל מחולל הגל.
3. לכל פלט של הממריץ, לחבר חוט עם מחט דיקור המולחם בסוף.
4. מניחים שתי מחטי דיקור ב הקודקוד של הלב כ בנפרד 3 מ"מ אחד מהשני.
5. רק לאחר המחטים מוקם בתוך הרקמה, להפעיל את הפלט של הממריץ על מנת למנוע התחשמלות.
ב תוכנת הרכישה, להתאים תדירות רכישה עד 10 קילוהרץ.

7. הקלטת איתותי Endocardial

עיין צעד 6.1 ו -6.2 לייצב את הלב לאחר טעינת הצבע.
באמצעות נקודת 23Ga חדה בערך בגודל של סיבים אופטיים, לעשות חור קטן על פני השטח של הלב LV ליד מחצה.
מבחינה חיצונית קצב הלב. עיין לשלב 6.4.
בשנת תוכנת רכישה, להתאים תדירות רכישה עד 10 קילוהרץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AP ו Ca ^{2 +} ארעי ב endocardium ו epicardium

על מנת להשוות אותות ברחבי קיר החדר, סיב אופטי אחד ממוקם ב endocardium ואת האחרים epicardium. השוואת המורפולוגיה של AP שנרשם בגין endocardium עם אחד מן epicardium היא הדרך הטובה ביותר להעריך את תפקוד transmural. הקיר חדרית מאוד הטרוגנית ולכן, את המורפולוגיה של נקודות גישה שונה מאוד בשני אזורים אלה. עובדה ידועה היא כי endocardium יש לי פחות _כדי מאשר epicardium ^{^17,} ^{^18,} ^19. אני פחות _כדי הופך את repolarization של שלב 1 איטי יותר endocardium ^{^18,} ^20. Sh 5b איורows הקלטה אופטית אופיינית של AP מן endocardium ואת epicardium. כדי לבצע הקלטות אלה, לבבות עכברים הועמסו עם di-8-ANEPPS לצבוע פוטנציומטרית הקרינה נמדדה באמצעות טכניקה CLFFM. מורפולוגיה של AP רשמה אופטית, במיוחד בשלב 1, מציגה כמובן זמן איטי עבור endocardium (משך פוטנציאל פעולה (APD) 30 הוא 8.01 ms ± 2.5) בהשוואה epicardium (3.4 ms ± 0.59) (איור 5 ב '). באופן כללי, APD ניתן לתאר את משך הזמן שלוקח את נקודת הגישה repolarize אחוז מסוים כולל 30, 70 או 90 (איור 5 א). עקבות אלה כבר מנורמלות והעבר יש שלב חופף 0. בהשוואת APDs (5c איור), אנו רואים כי endocardium ו epicardium שונים באופן משמעותי במהלך השלב 1. למרות נקודות גישה אלה הם אותות קרינה, הם יכולים להיות מכוילים מסוימים פוטנציאל הממברנה על ידי מדידת AP זמנית עםmicroelectrode חדה מלאה 3 מ KCl ^13.

בנוסף קרום הפוטנציאל, אינדיקטורים ניאון אקסוגניים יכול לשמש כדי לפקח תאיים [Ca ^{2 +].} בדרך כלל, אנו משתמשים Rhod-02:00 למדוד ארעיים תאי Ca ^{2 +} בגלל הטווח הדינמי הגבוה ויכולתה להישאר cytosol גם בטמפרטורות פיסיולוגיות. 6b האיור מראה הקלטה טיפוסית של הארעיים התאיים Ca ^{2 +} בשכבת endocardium ו epicardium. תוצאות אלו פורסמו ¹⁵ חלקית. על מנת להשוות הבדלים אזוריים התאי [Ca ^{2 +]} רמות, קינטיקה של הארעיים ²⁺ Ca הוערכו (איור 6 א). בסך הכל, הניתוח של קינטיקה Ca ^{2 +} החולפת (איור 6 ג) מראה כי ארעי Ca ^{2 +} מ endocardium היה מובהקcantly קינטיקה איטי מאלו שנרשמו מן epicardium.

Ca ^{2 +} הדינמיקה לומן SR

בלב, עלייתו ונפילתו של תאיים [Ca ^{2 +]} רמות הן קריטיות בהגדרת משתנים פיזיולוגיים רבים, כולל לחץ, התכווצות, ומשך פוטנציאל פעולה (APD). הפרק הקודם תיאר את יכולתנו למדוד את הארעיים Ca ²⁺ cytosolic. Ca ^{2 +} שוחרר מן SR הוא אחראי במידה רבה את עליית Ca ²⁺ cytosolic התאית. לפיכך, עבור כל עליית Ca התאי ²⁺ קיים Ca ²⁺ דלדול של SR. עם זאת, הארעיים Ca ²⁺ cytosolic אינם נובעים אך ורק כדי SR Ca ^{2 +} שחרור, אלא גם כוללים Ca ²⁺ הנכנסים לתא דרך הממברנה הפלזמה. המעבדה שלנו¹⁶ הצליח להעריך את תוכן SR Ca ^{2 +} על ידי שימוש צבע פלואורסצנטי, מג-Fluo-04:00. למרות צבע זה הוא דה-אסטרי ב myoplasm ואת SR, את מיוציטים יכול extrude מתוך השבר cytosolic. שחל לצבוע זה יכול להיות מקודם פשוט על ידי הגדלת הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה זו, לצבוע cytosolic הוסר על ידי קלטת מחייב ATP כמו חלבון הממברנה. למרבה המזל, חלבון זה אינו קיים בקרום SR. לכן, לאחר הגדלת הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס, הקרינה רשמה באמצעות טכניקת PLFFM היא בעיקר תוצאה של Ca ^{2 +} מחייב לצבוע בתוך SR. על מנת לבחון את הספציפיות של מדידת אברון, דופק קפאין יושם כדי לעורר שחרור Ca ^{2 +} דרך RyR. אפשר להבחין כי האות היא אכן תוצאה של דלדול SR (איור 7). הקפאין המושרה Ca SR ^{2 +} שחרור (איור 7 א) לייצר שני, ירידה ברמת הדיאסטולי של הקרינה Mag-Fluo-4 (92 ± 0.05% (N = 4, p = 0.012)) וירידה משרעת של הארעיים Ca ^{2 +} (51 ± 0.21% (N = 4, P = 0.003)) ^16. עקבות SR Intra שנרשם לפני ואחרי גירוי קפאין מיוצגים כלפי מטה-7d 7b איור. ככל שהזמן מתקדם מן הגירוי קפאין, משרעת של דלדול SR הוא קטן. 7E איור ממחיש כי דלדול SR לא רק גורם לירידה המשרעת של האות Ca ^{2 +} אבל גם מאט את תהליך שחרור Ca ^{2 +} SR. עקב הקרינה באיור א 7 כבר פורסם בעבר ^15.

פעם LED: פוטנציאל פעולה

באיור 5 הראינו כי Di-8-ANEPPS יכול לדווח על שינוייםבפוטנציאל הממברנה כאשר הוא נרגש ב 532 ננומטר. תחת תנאי עירור זה, יש ירידה של הקרינה הנפלטת באורכי גל גבוה יותר מאשר 590 ננומטר. מעניין, כאשר צבע פוטנציומטרית זה קרוב מתרגש גל עירור המקסימלית שלה (~ 476 ננומטר), פליטת הקרינה של משמרות לצבוע לאורכי גל נמוך כאשר קרום depolarizes. כתוצאה מכך, משמרת רפאים זה מאפשר לנו להקליט את הקרינה הנפלטת בשני אורכי גל שונים. רכוש ספקטרלי זה של Di-8-ANEPPS מאפשר קיצוב של הקרינה הנפלטת רשמה בשני אורכי גל שונים, תכונה שבדרך כלל בעל ערך רב משום הקלטה ממוחשבת הסופית תהיה עצמאית של ריכוז לצבוע בקרום. על מנת לנצל את מלוא היתרונות של משמרת רפאים Di-8-ANEPPS, השתמשנו נוריות פעמו כמקור אור. השתמשנו אור הכחול פעם כדי להלהיב את fluorophore. העירור בוצע ב 485 ננומטר, קרוב גל קליטת השיא של Di-8-ANEPPS (~ 476 ננומטר). רכישה בשתי להקות ספקטרוסקופיות פליטה שונות מאפשרת היווצרות יחס ואת היכולת להגדיל S / N ולדחות רעש מצב נפוץ כמו אור סביבתי חפץ תנועה ובהתקשרות לבבות שבו blebbistatin uncoupler המכאני שלא נעשה בה שימוש. מצב זה הוא מאוד חשוב עבור תנאי הניסוי שבו הן את הפעילות המכנית של הלב ואת קינטיקה של הארעיים Ca ^{2 +} צריך למדוד בו זמנית.

תרשים עיתוי PLEDFM מודגם 8a איור. התרשים כולל את לוגיקת הבקרה של אינטגרציה איפוס של headstage photodetection, התזמון ב- off של ה- LED ואת המרה אנלוגי-לדיגיטלי. במהלך הזמן של AP, הקרינה זוהתה בלהקת הגל הירוקה מראה עלייה בעוצמת בעוד הקרינה זוהתה הלהקה האדומה פוחתת. איור 8b מראהשהשינוי של אות קרינה המיוצרת על ידי שלילת קוטביות הממברנה נע בכיוונים שונים. עם זאת, חפץ תנועה היוצר על ידי התכווצות הלב תמיד מכוון באותו הכיוון, עצמאי של אורך גל הפליטה. כפי שהוסבר קודם לכן, נתונים של שני הערוצים (ירוקים ואדום) חייבים להיות ממוזג תוכנה לפני חישוב היחס. ההתניה כוללת לקזז ולהשיג תיקונים. הבחירה של תיקונים ברמה לקזז ולהשיג אינה אוטומטית. המשתמש של התוכנה יש לבחור את המשתנים להתנות את העקבות לפני היחס. היחס וכתוצאה מכך 8b פנל (איור 8) עולה כי החפץ הציג ידי תנועת שריר הלב בטל.

השינוי היחסי של קרינת di-8-ANEPPS במהלך AP הוא בדרך כלל קטן מאוד (~ 8% ל -100 mV). זה שינוי קרינת di-8-ANEPPS הוא קטן בהרבה מזו המיוצרת על ידי bindin Ca ²⁺g כדי Rhod-2 (<200%). לפיכך, על מנת להגדיל את יחס אות לרעש של di-8-ANEPPS, ניתן בממוצע הקלטות מרובות.

פעם LED: קלטות סימולטני של Ca ^{2 +} פוטנציאל הממברנה

המטרה האחרונה באמצעות גישה ניסויית זו מורכבת בביצוע הקלטות בו זמנית של Ca ^{2 +} הארעיים ואת APS. קלטות סימולטני של אותות פיסיולוגיים רבים דורשות לפתור קשיים טכניים הקשורים להיבטים שונים של המערכת כולל: צימוד מקור האור עם הסיבים האופטיים, התאמת ספקטרום הספיגה של הצבע עם הפליטה של הנוריות, בעיצוב האנלוגי מעגלים אלקטרוניים דיגיטליים ליצור את עיתוי רכישה וכן פיתוח תוכנה מהירה לנתח נתוני on-line.

ב our מחקר, בחירת צבעים תלויה המאפיינים ספקטרליים שלהם. Flourophores המשמש למדידת אותות מגוונים חייב לספוג בלהקות ספקטרליים שונות. מצב זה הוא הכרחי על מנת להבחין בין מקורות אות. בכל פעם כי LED בעל אורך גל שונה משמש כדי לעורר את הרקמה, הקרינה זוהתה תואמת את האות קשור עם הצבע שקולט באורך הגל הזה. בדרך זו, פליטת קרינה מגיעה צבעים שונים, אבל בסופו של הלהקה באורך הגל הזהה, ניתן להבחין על ידי הזמן שבו כל אחד הוא נרגש.

עם זאת, crosstalk בין ספקטרום צבע לא ניתן להימנע לחלוטין. הסיבה לכך היא כי מאפייני קליטת הרפאים של הצבעים להפוך אותם לקלוט אור עם אורכי גל רחוק קליטת השיא שלהם. בניסויים שלנו, crosstalk הופק בשני אופנים: (1) Rhod-2 לריגוש על ידי ה- LED הכחול, הוספת אות Ca ²⁺ אל channe האדוםl עקבות AP, ו (2) Di-8-ANEPPS להתרגש הנורית הירוקה, אשר מופיעה על (9F האיור) Ca ^{2 +} האות חולפת. Crosstalk ניתן לתקן זאת על-קו, כפי שמודגם באיור 9. הנוהל עובד כי האות המפריעה הוא אחוז קטן של האות כי צריכה להימדד. לבסוף, באמצעות סוג זה של עיבוד אלגברי של fluorecence מן צובעת אפשרה לנו להפריד AP (איור 9 ד) טופס Ca ^{2 +} הארעיים (9h איור). מתווה מפורטת של עיבוד זה מתואר במקרא הדמות. חשוב לשים לב כי כל ניסויי LED פעם בוצעו 28 ° C.

איור 1: מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומי (LFFM). LFFM מורכב הסדר epifluorescenceבאמצעות סיבים אופטיים multimode כי הוא במגע עם רקמות להקליט את הקרינה הנפלטת צבעי אקסוגניים perfused לתוך הלב. את הגדרת LFFM יכולה להשתמש בשלושה מקורות אור שונים כולל (א) PLFFM, שבו אור העירור מסופק על ידי ליזר פעם פיקו Nd-Yag; (ב) CLFFM, שבו לייזרים גל מתמשך משמשים וקטניות אור מופקים על ידי אפנן ferroelectric המאפשר ריבוב של לייזרים עם אורכי גל שונים; ו- (ג) PLEDFM, שבו נוריות שיש ספקטרום פליטה רחב עם פליטת שיא של (ד) 485 ננומטר ו 540 ננומטר עבור נוריות כחולות וירוקות, בהתאמה, הם פעמו אלקטרוני. כאשר מקורות ליזר משמשים, שהקרן defocused ידי הרחבה קורית. לבסוף, מראה dichroic ועדשות אובייקטיביות למקד את הקרן על קצה הדיסטלי של הסיבים האופטיים אשר נלחץ מעט מול הרקמות. האור הנפלט נוסע בחזרה דרך אותו הסיב האופטי, מראה dichroic, EMIמסנני ssion, והיא ממוקד על גבי photodiode מפולת שם פוטוני מומרי זרם חשמלי. הזרם יכול להיות מוגבר על ידי שתי שיטות (ה) מגבר transimpedance, שבו מתח המוצא המתקבל הוא פרופורציונלי פוטוני ואת נגד המשוב; (ו) אינטגרטור, שבו מתח המוצא הוא פונקציה של המשוב הנוכחי קיבולים. לבסוף, את האות היא נרכשה על ידי ממיר A / D וראתה במחשב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: Resistive וגיור קיבולי. (א) דוגמה טיפוסית של זיהוי התנגדות של פעימות לייזר picosecond מוצג. הכוכבית (ב)מראה מרווח מורחב זמן, שבו אלגוריתם מעקב שיא יושם כדי לזהות את השיא (אדום) והבסיס (הירוק). (ג) ייצוג של עקבות מחושבות מן הפסגות והקלטות בסיסים מוצג לתגובות פלורסנט Rhod-2 בתוך לב פועם תוכי בקצב החיצוני ב -7 הרץ וטמפרטורת אמבטיה המוגדרת 37 ° C. ד ח) פוטוני מרה על ידי אינטגרטור באמצעות משוב קיבולים. הקלטות אופייניות של הארעיים לב עכבר השלם Ca ²⁺ מוצגות שני סולמות זמן שונים (D ו- E). (ו) השילוב של שני מחזורים רצופים עם ובלי תאורת LED מוצג. אינטגרל של עליות אות ליניארי כמו הפוטונים גובה קבל המשוב. השיפוע של זמן התלוי נפרד (שיזוף (Ɵ)) הוא יחסי למספר הפוטונים המשפיעים על צומת מפולת בנוסף רקומבינציה אלקטרון-חור המושרה על ידי pפעילות hononic כאשר דיודת מפולת אינו מזהה כל פוטונים. האותות הדיגיטליים שליטת אינטגרצית headstage ולאפס תקופות מוצגות גרם פנל. האיתותים המזוהות במהלך שאינו תאורה (DC) ו LED תקופת התאורה (F) מוצגות h לוח. חיסור של F ו- DC מספק את המדידה בפועל של fluorescently זוהה Ca ^{2 +} הארעיים מלבבות עכברים בקצב חיצוני בשעה 9 הרץ על 37 מעלות צלזיוס (ח). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: LFFM עבור Epicardium ומדידות Endocardium. את הגדרת CLFFM שמשה למדידת הקרינה הנפלטת צבעי ניאון אקסוגניים נוכחים epicardiumשכבות endocardium ד. תוספת של קרן splitter הקל ההקלטה של משתנים פיזיולוגיים שונים epicardium ו endocardium. שני סיבים אופטיים שמשו עם headstages האישי שלהם כדי לזהות מן epicardium ו endocardium. חתך עגול קטן נעשה החדר וכן סיבים אופטיים היה מושחל דרך להקליט מן endocardium. הגדרה זו השתמשה ממיר נוכחי ל-מתח עם משוב resistive. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: לשכה אופקית עם בקרת טמפרטורה. תרשים המציג את הגדרת Langendorff שבו לבבות שלמים נשמרים תפקודיים במשך שעות. הלב קשור מחט שדרכו כל פתרונות וצבעיםרטרו-perfused הם ללב דרך התקפי לב מתפצלים אבי העורקים. התא ממוקם מעל יחידת פלטייה כדי לשמור על הטמפרטורה של האמבטיה, אשר נקראת על-ידי חיישן טמפרטורה מחובר מד מתח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: מדידות פוטנציאל פעולת transmural ב לבבות שלמים. (א) משך פוטנציאל פעולה (APD) נבחן כמו הזמן שנדרש כדי להשלים 30%, 70%, או 90% של repolarization AP. (ב) Di-8-ANEPPS הקרינה מן epicardium (שחור) endocardium (אפור) להראות AP הבדלים מורפולוגיים repolarization בין שתי שכבות של קיר החדר. (ג) לאחר הערכת tהוא APD 30, 70, ו -90 ב endocardium ו epicardium, התוצאות הראו רק הבדלים מהותיים APD 30 (8 ± 2.5 ms endocardium vs epicardium 3 ± 0.6 ms). לבבות היו בקצב בשעה 6 הרץ וטמפרטורה מוגדר 37 ° C. נתונים הם ממוצעים ± SEM של 5 לבבות. * P <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: transmural Ca ^{2 +} מדידות חלוף ב לבבות שלמים. (א) פרמטרים של Ca ^{2 +} קינטיקה חולפת נמדדים הם: הזמן שלוקח להגיע לשיא, זמן שיא (TP); הזמן שלוקח ללכת מ -10% ל 90% של העלייה, זמן עליה (RT); הזמן שלוקח ללכת מ -10% ל -90% של ריקבון, זמן הדעיכה (DT); והזמן שנדרש כדי להשלים 50% של החולף, משך חצי (HD). (ב) קרינה נפלטת Rhod 2 לאחר עירור עם epicardium מופע ליזר CW ירוק (שחור) endocardium (אפור) ארעית Ca ^{2 +} עם הבדלי הרפיה. ג) Ca ^{2 +} הארעיים מן endocardium היה קינטיקה איטית יותר באופן מובהק RT, TP, HD, ו DT מאלו שנרשמו מן epicardium. לבבות היו בקצב בשעה 6 הרץ וטמפרטורה מוגדר 37 ° C. נתונים הם ממוצעים ± SEM של 5 לבבות. * P <0.05. שונה מן Mattiazzi et al. ^15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7: Intra SR ^{2 +} מדידות Ca ב לבבות שלמים.(א) הקרינה הנפלטת מ צבען Mag-Fluo-4 טיפות לאורך זמן, המשקף ירידה בריכוזיות SR Ca ^{2 +} התוך. (ב) התצוגה המורחבת של ירידת קרינת Mag-Fluo 4 מציין Ca ^{2 +} הדלדול מושרה על ידי Ca ^{2 +} שחרור מן SR. (ג) תצוגה מורחבת של ירידה משרעת חולף מן הקרינה Mag-Fluo 4 המייצג Ca ^{2 +} שחרור שונה על ידי המרוססת לבבות עם 20 קפאין מ"מ. (ד) לאחר יישום ארוך של קפאין, ירידה היא ברמת הדיאסטולי של קרינת Mag-Fluo-4 ו משרעת של Ca ^{2 +} ארעי [עד 92 ± 0.05% (N = 4, P = 0.012) ו 51 ± 0.21% (N = 4, p = 0.003) של הערכים ההתחלתיים, בהתאמה], הוא ציין. ככל שיותר שהזמן מתקדם מהקפאין, קטן הוא משרעת של דלדול SR. (ה) עקבות מנורמלות bd מראה כי דלדול SR לא רק לגרוםהים פוחת של אות Ca ^{2 +} אבל גם מאט חידוש Ca ²⁺ SR. לבבות היו בקצב ב 4 הרץ וטמפרטורה מוגדרת 37 ° C. עקבות קרינה היא מ- ואח Kornyeyev. ^16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8: מדידות ratiometric של נקודות גישה לבבות שלמים עם פעמו LED. (א) תרשים העיתוי כולל אינטגרצית איפוס של headstage, ב- off פעמים של ה- LED וכן הקלטה בפועל מודגם. (ב) רשמים משתי יש הערוצים ערכי המנוחה שונים הקיזוז תוקן על ידי הזזת הידיות עד לכל נקודת הגישה קדמה ערך מנוחה. רווח של כל ערוץ הוא גם adjusטד. שימו לב חפץ תנועה גדול מאוד מופיע בשני הערוצים בין שני depolarizations. לאחר שהתוכנה מעבדת את האותות ratiometrically, והתוצאה היא AP ללא שינויים ברזולוציה מורגשת (הכחול). לבבות היו בקצב של 3 הרץ וטמפרטורה מוגדרת 28 ° C. כל הרשומות המוצגות הן ממוצעות של 10 עקבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9: סימולטני Ca ^{2 +} ארעי ומדידות AP בלב שלם עם פעמיו LED. זיהום ההצטלבות של אותות בעת הקלטת שניהם Ca ^{2 +} ו AP ניתן לתקן על-קו. לצבוע פוטנציומטרית, di-8-ANEPPS, הוא נרגש עם 20 מיקרו-שניות פולסים LED כחול (א). אותות שלPlit, מסונן עם אדום bandpass ומסננים ירוקים. אותות אלה מזוהים על ידי שתי פוטודיודות מפולת שונות המצוינות כמו אדום (ב) ובערוץ ירוק (ג). אפשר להבחין כי שני האותות, אדומים וירוקים, להציג חפץ תנועה מורגש שמופיע בתור סטייה כלפי מטה. אותות שני, אדומים וירוקים, הם offseted ולאחר מכן מוגבר. האותות מותנה משמשים לחישוב היחס בינם לבין התוצאה מוצגת ד. אפשר לצפות כי היחס בין שני האותות (ד) והממצאים הנעים מבוטלים. דואר לוח מדגים את הרצף של פולסים היגיון שולטים LED פולטת ירוקה המשמשת כדי להלהיב את מחוון Ca ²⁺ Rhod-2. אותות פלורסנט שהושגו באמצעות הליך זה מוצגים f. למרות קורט f בעיקר מראה על עליית אות הקרינה בשל bindin Ca ²⁺g כדי Rhod-2, אפשר גם להתבונן סטיה שלילית עקבות עקב קליטת אות שידור fluorescently מ- Di-8-ANEPPS כאשר צבע זה הוא נרגש עם אור ירוק. בעיה זו ניתן לתקן על ידי הפחתת האות פוטנציומטרית שמוצגת גרם. התוצאה של החיסור מוצגת h לוח שבו Ca ^{2 +} לאותת חינם של זיהום AP מתקבל. לבבות היו בקצב של 3 הרץ וטמפרטורה מוגדרת 28 ° C. כל הרשומות המוצגות הן ממוצעות של 10 עקבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה הוא מרוכז בתיאור טכניקות קרינה בשדה מקומית יש להעריך את הפונקציה של myocytes לב vivo לשעבר. המחקר של תאים אלה בסביבת מצמידים הוא לא רק יותר פיסיולוגי, אך הוא גם מאוד מתאים לבחון פתולוגיות איבר-רמה. האירועים הסלולר הבסיסיים צימוד עירור-התכווצות (ECC) ניתן להעריך ברמת האיבר השלמה עם שימוש בדיקות מולקולריות המנטרים ²⁺ דינמיקת Ca תאית (Rhod 2 cytosolic Ca ^{2 +,} מג-Fluo4 SR Ca ^{2 +)} ו פעילות חשמלית (di-8-ANEPPS). כאן, הצגנו שלוש טכניקות LFFM epifluorescence ששני לרגש ולאסוף הפליטה מ אינדיקטורים ניאון באמצעות סיבים אופטיים. הם להשתנות בהתאם למקור האור המשמש ואת סוג אפנון אור. PLFFM נעשה שימוש בלייזר כי להבזקי האור, CLFFM משתמשת באור לייזר רציפה, בעוד LEDFM משתמש נוריות כי ניתן גם שפעמה PLEDFM. כל אלומוצגים באיור 1 כמו קבוצה אחת, אבל ניתן לבנות עם רק אחד משלושה הסדרי epifluorescence. בנוסף, לאור זוהה ניתן לעבד בדרכים שונות. לדוגמה, איור 2 מדגים שני מצבים שונים שבהם פוטוני יכול להיות משולב או להמיר ישירות למתח באמצעות ממיר הנוכחי ל-מתח. באופן כללי, הגישה LFFM ניתן להשתמש כדי למדוד בו זמנית מספר רב של אתרי אנטומי, ראה בגין איור 3.

השיטה המוצגת כאן להערכת נכסי לב ברמת האיבר השלמה היא יותר נאותה ללמוד בעיות שבו הצימוד בין התאים הוא קריטי בהגדרת ההתנהגות של הרקמה. ההטרוגניות הפנימית של הלב יכול לייצר AP השונה גל ^{^13,} ^{^21,} ²² מבוססת על הרקמות הספציפיות שממנו ceLLS מקורן. לכן, מחקרי איבר שלמים לספק את ההזדמנות להעריך את התפקוד הפיזיולוגי המקומי של התא במבנים אנטומיים שונים. יתר על כן, ראינו כי אירועים תאיים כמו ניצוצות יש גלי קינטיקה שונה בתאים ניתקים מאשר האיבר השלם ^15.

Langendorff ההגדרה (איור 4) היא קריטית בשמירה על הלב במצב כי הוא קרוב יותר in vivo. בנוסף, היא מאפשרת retroperfusion של תרופות מרובות בדיקות מולקולריות ניאון שונים המאפשרים מדידה של מספר משתנים פיזיולוגיים. שינוי בדיקות ניאון אקסוגניים בשימוש, כגון הגדלה של סיבים אופטיים, או בחירת מקור אור שונים יכולים לשנות את היישום של הטכניקה באופן דרמטי. בנוסף, יחידת פלטייה מתחת לתא האופקי יכולה להקל על המחקר של דינמיקת ²⁺ Ca בטמפרטורות שונות. הוספת אביזריםכדי LFFM כגון beamsplitter יכול להגדיל את מספר סיבים אופטיים המשמשים להקליט מאזורים שונים בלב שלם. זוהי הסתגלות מאוד שימושית כדי לבדוק אם הבדלים אזוריים להתרחש בתרחישים פתולוגי. איור 3 מציג את endocardium ו epicardium המוערך בו זמנית. יתר על כן, המרוססת בלב עם אגוניסטים שונים מאפשר לנו להבין כיצד האזורים השונים ברחבי קיר החדר מוסדרים. את האיתות החשמלית (איור 5) ו Ca ^{2 +} קינטית (איור 6) heterogeneities ניתן להשוות את epicardium ו endocardium. בנוסף, צבעים מרובים עם אורכי גל עירור שונים ומסנן פליטה ניתן להשתמש. לדוגמה, באמצעות מג-Fluo-4, רמות Ca ²⁺ לומן של SR ניתן להקליט (איור 7). שינוי גודל של סיבים אופטיים יכולים גם להרחיב את הקיבולת של שיטה זו בכך שהוא מאפשר הקלטה פלורסנט מתוך Larבאזור ger.

גם מאמר זה מראה כי מלבד לייזרים יקרים, ניתן להשתמש נוריות כמקור אור עירור בטכניקה שלנו. איור 8 מראה כי סוג זה לא יקר של מקור האור יכול לשמש כדי ratiometrically למדוד APS. מדידת ratiometric שמוצגת באיור 8 יש יתרון בייצור הקלטה סופית ללא שינויים ברזולוציה ניסיונית כולל אלה הנגרמים על ידי תנועה. לבסוף, גם את Ca ^{2 +} חולף ו AP ניתן להקליט אופטי, בו זמנית, על ידי אורכי גל שונים ריבוב וצבעים באמצעות באותו ספקטרום הפליטה. העיבוד של אותות המתואר באיור 9 הוא קריטי בהסרת הזיהום פנימי המיוצר על ידי החפיפה בספקטרום הפליטה של הצבעים. הקלטת Ca ^{2 +} ארעיות ואת APS, בעת ובעונה אחת, אבל כמו שני אותות מוצא עצמאיים מועילה בלימוד ECC ו Ca ^{2 +} Ca ^{2 +} -induced

LFFM היא טכניקה עם יישומים מרובים פיזיולוגיה הסלולר של רקמות שלמות. עם זאת, מגבלה עיקרית אחת היא כי הקרינה היא רשמה ממוצעת של הפליטה מ אינדיקטורים ניאון הבסיסיים באזור המקומי שבו הסיב האופטי הוא במגע עם הרקמות. גם כאשר באמצעות שני סיבים אופטיים, LFFM אינו מספק פריסה המרחבית subcellular של האותות הנמדדים. מיפוי אופטי הוא טכניקה טובה יותר לניטור משתנה פיזיולוגים המשנים במרחב ובזמן כמו ההתפשטות של הארעיים AP, Ca ^{2 +,} ו alternans ^{^23,} ^{^24,} ^25. LFFM הוא גם מסוגל לספק הדמיה של מבנים, כמו מיקרוסקופיה confocal וטכניקות מיפוי אופטי אחרות. עם זאת, השימוש בו של סיבים אופטיים עושה את זה מעשי recording אותות הקרינה מקומיים מן endocardium או אזורים אחרים שקשה או בלתי אפשרי גישה לב שלם עם מיקרוסקופ confocal.

ההשוואה בין משתנה פיזיולוגים המתקבלים לבבות שלמים מניסויי myocyte מבודדים הוא מאתגר. היתרון הגדול של שימוש myocytes לב מבודד הוא ההזדמנות הייחודית להעריך מאפייני biophysical של התאים בתנאי מהדק תיקון. לעומת זאת, LFFM מאפשר הלימוד של תופעה פיזיולוגית ופתולוגיים בסביבת יליד יותר. לדוגמא, בלבבות שלמים אנחנו יכולים להעריך את הבדלי transmural ^15, תלות קצב לב של AP ו Ca ^{2 +} ב פיסיולוגי נע ¹³ כי הם בלתי ניתנים להשגה בתאים מבודדים. בנוסף, אנו יכולים לחקור את ההשפעות של עלבון איסכמי על הפונקציה של שלם הלב ^{^9,} ^10. לשעבר בלב שלםperiments גם מאפשר לנו להעריך את האינטראקציה בין תאים מסוגים אחרים מיוציטים ^11.

LFFM מאפשר ההדמיה של אותות סלולריים ברמת הלב השלמה שבו יש תאים צימוד פיסיולוגי. LFFM מאפשר הלימוד של פעילות תאית בעוד תאים הם עדיין האיבר ללא פגע. בשילוב עם צבעי ניאון ו epiluminescence, LFFM יכול לפקח שתי תכונות לב מפתח: Ca ^{2 +} דינמיקת פעילות חשמלית.

לבסוף, השיטה המוצגת כאן יכולה להיות יישומים מרובים בחקר ECC. זהו כלים, אשר חושף כיצד מולקולרי אותות מושפעים במצבים פתולוגיים כגון הפרעות קצב ¹⁶ ו איסכמיה ^{^9,} ^15. טכניקה זו היא חובה ללמוד פתולוגיות אלה שכן הם יכולים להיות מובנים רק ברמת האיבר השלמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אלישיה Mattiazzi לדיון ביקורתי של העבודה הציגה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NIH (R01 HL-084,487) כדי ALE.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2 μm nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4' x 6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C