Summary
kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.
Abstract
kalbinde, moleküler sinyal çalışmaları genellikle izole miyositlerde yapılmaktadır. Ancak, bu tür iskemi ve aritmi gibi birçok patolojik durum sadece tamamen tüm organ düzeyinde anlaşılabilir. Burada, bozulmamış kalbinde hücresel sinyallerin ölçümünü sağlar yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) spektroskopik tekniğini sunuyoruz. teknik, bir Langendorff perfüze kalp ve flüoresan sinyal kaydetmek için bir optik elyafın bir kombinasyonuna dayanmaktadır. LFFM normal ve patolojik şartlar altında kalbi incelemek için kardiyovasküler fizyoloji alanında çeşitli uygulamalar vardır. Birden fazla kalp değişkenler farklı floresan göstergeler kullanılarak izlenebilir. Bunlar sitozolik [Ca2 +], intra-sarkoplazmik retikulum [Ca2 +] ve membran potansiyelleri bulunmaktadır. eksojen floresan sondalar heyecanlı ve yayılan floresan LFFM Epifloresans tekniğinin üç farklı düzenlemeler ile tespitBu çalışmada sunulan s. Bu teknikler arasında merkezi farklar uyarma ve ikaz ışığı modüle edilir yolda kullanılan ışık kaynağının türü vardır. sürekli dalga LFFM (CLFFM) uyarma sürekli lazer ışığı kullanır iken darbeli LFFM (PLFFM) lazer ışık darbeleri kullanır. Son olarak, ışık yayan diyotlar (LED), bir üçüncü ışık kaynağı olarak kullanıldı. Bu sigara, tutarlı bir düzenleme darbeli LED floresan mikroskobu (PLEDFM) olarak adlandırılır.
Introduction
Kalp damar sisteminin merkezi organıdır. Kalbin kasılma intrasellüler artışa [Ca2 +] tarafından başlatılır. Hücre içi Ca 2 + sürümde elektrik uyarılabilmenin ve değişimler arasındaki ilişki tarihsel enzimatik ayrışmış hücreleri 1, 2 olarak ele alınmıştır. Bununla birlikte, kalp hücreleri, elektriksel olarak, metabolik ve mekanik, 4 3 bağlanmış. Izole zaman miyositler sadece fiziksel Kuplajsız değildir, fakat farklı katmanlardan miyositler ayrışma 5 boyunca karıştırılır. Bundan başka, voltaj kenetleme şartları altında izole edilmiş hücrelerin çalışma ortaya çıkan büyük bir avantaj, 6, 7, 8, bir elektrik sinsityum ALWA olarak kalbin iç doğasına rağmenys dokusunda 3 bulunanların hücreleri ayrışmış nasıl işlevsel olarak farklı sorusunu oluşturmaktadır.
Bu yazıda, sağlam kalbinde yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) tekniklerinin kullanımı ile kardiyak fizyoloji bilgisine elde gelişmeleri açıklar. LFFM gibi sitozolik Ca 2+, içi sarkoplazmik retikulum (SR) Ca 2+ ve membran potansiyeli gibi çoklu fizyolojik değişkenleri ölçmek için floresan göstergeler kullanır. Bu ölçümler ventrikül basıncı 9, 10, Elektrokardiyogram 9, elektrik aksiyon potansiyeli (AP), iyon akımı kayıtları ve kafesli bileşikler 4 flaş fotoliz 11 ile aynı anda ve bağlantılı olarak elde edilebilir. Buna ek olarak, bu ölçümler yakınında yüksek frekanslarda sağlam kalp ilerleme hızı ile elde edilebilirFizyolojik oranlarda r. Çeşitli makaleler rağmen 9, 11, 12, 13, 14 LFFM teknikleri kullanarak grubumuz tarafından yayınlanmıştır, bu teknikle ilgili teknik karmaşıklıklar karinesi kalp ve diğer organlarda ex vivo fizyolojik olayları okuyan büyük miktarlarda kullanımını engellemiştir.
LFFM tekniği (Şekil 1) doku ile temas halinde olan bir çoklu optik fiber kullanılarak elde epifloresans ölçümlerine dayanır. herhangi bir temas floresan görüntüleme tekniği gibi, optik çözünürlük çapı ve lif sayısal açıklık (NA) bağlıdır. lif A NA yüksek ve daha küçük çaplı ölçümlerinin uzaysal çözünürlüğü artacaktır. NAS ve elyaf çapları sırasıyla 0.22 mm 0.66 ve um 1 ila 50 arasında olabilir. İçindeNA katlama bir büyük katı açı gelen fotonları kabul ederek gürültü oranı (S / N) sinyali artıracaktır. Epifloresans cihazı olarak hareket etmek amacıyla, ışık huzmesi bir asferik lens veya Epifloresans amacı ile optik fiber içine odaklanmış nerede lens NA ve fiber maç. Bu eşleştirme uyarma ve fluorofor tarafından yayılan fotonlar geri toplamak için enerji transferini maksimuma çıkarır.
dokuda yüklenen eksojen floresan göstergeleri heyecanlandırmak için, farklı ışık kaynakları ve aydınlatma modları kullanılabilir. Darbeli yerel alan floresan mikroskobu 3, 12 (PLFFM) kullanarak ilk çalışmalarda düşük maliyetli pikosaniye lazer (Şekil 1a, PLFFM) kullanılmıştır. ışık kaynağının Bu tip büyük ölçüde nedeniyle boya kasar olmadan aydınlatma alanı altında florofor moleküllerinin heyecan verici büyük bir fraksiyonun büyük bir avantaja sahiptirkısa nabız 12 süreleri. Buna ek olarak, ultra bakliyat kullanımı boya 12 floresan ömrü değerlendirmesini sağladı. Floresans ömrü Ca2 + bağlanmış boya molekülleri kısmını ölçmek için kullanılabilecek bir özelliktir. Ne yazık ki, Darbeli darbe genliği bakliyat ve varyasyon zamana jittering boyasına ligand tarafından üretilen parlaklıkta meydana gelen değişiklikler büyük olduğu durumlarda, bu deney strateji uygulanmasını sınırlar.
Sürekli dalga (CW) lazeri genellikle LFFM (Şekil 1b, CLFFM) içindeki ana aydınlatma kaynağı olarak kullanılır. Lazer ışını sürekli olarak doku aydınlatmak veya ferroelektrik modüle edilebilir. kirişin ferroelektrik modülasyon ışığın mikrosaniye bakliyat üretimi sağlar. Bu modülasyon dış donanım ile kontrol edilebilir. Bu prosedür sadece dramatik t azaltırO ışık darbeleri zamansal jittering değil, aynı zamanda farklı dalga boylarında ışınları karıştırma sağlar. Kirişlerin karıştırma farklı lazerler çoklayıcı ışınları ile yapılır. Bunun bir sonucu olarak, farklı bir spektral özelliklere sahip olan birden fazla boya, örneğin, fizyolojik değişikliklerin çeşitli ölçümler yapmak için büyük bir heyecan olabilir Rhod-2 sitosolik Ca2 + için MagFluo4-içi SR Ca2 + ve di-8-ANEPPS için için membran potansiyeli.
LFFM ışık kaynağı olarak lazer mevcut çeşitli avantajları olmasına rağmen, ışık kaynaklarının başka tür ışık yayan diyot (LED) gibi kullanılabilir. Bu durumda, uyarım ışığı kaynağı, bir InGaN LED (Şekil 1c, PLEDFM) oluşuyordu. iletim bandı elektronlar değerlik bandında deliklerle recombine zaman LED'ler, fotonlar kendiliğinden yayılır. katı hal lazerleri ile farkı emisyon diğer fotonlar tarafından uyarılan olmadığıdır. Bu eşevrelı olmayan bir kiriş meydana getirir veLED'ler için daha geniş bir spektral emisyon.
yüksek güç LED Farklı türleri kullanılabilir. Di-8-ANEPPS Ca kullanılarak AP kayıtları için 2 + geçici Fluo-4 veya MAG-Fluo-4, 485 nm'de (mavi) ve 20 nm'lik bir yarı genişliği tipik tepe emisyon olan bir LED kullanılan kullanılarak kaydedildi (Şekil 1d). Rhod-2 ile kaydedilmiş Ca 2 + transientler için, LED 540 nm (yeşil) ve 35 nm (Şekil 1d) yarım genişlikte tipik bir tepe emisyonu vardı. LED'ler bir grup dalga boyunda yayar ve bu nedenle onların spektral emisyon daraltmak için filtreleri gerektirir. Buna ek olarak, darbeli ışığı 20 ms'den süresi 1.6 kHz'lik bir hızda oluşturulabilir. LEDLER hızlı bir güç MOSFET alan etkili transistör ile pulse edildi. Farklı göstergeler ile eş zamanlı olarak kayıtlar zaman çoklama LED'ler tarafından yapılabilir. Ne yazık ki, LED'ler tarafından yayılan ışık, bir lazer ışınına göre fiber optik üzerine odaklanmak daha zordur. Böylece, bize büyük dezavantajıLED'ler ing emisyon profilleri, ana eksenden açısal yer değiştirmelere (± 15 °), ve bir yardımcı optik düzeltmek için kullanılması gerekir olmasıdır.
Daha önce tarif edilmiş olan optik konfigürasyonlarda tümünde, uyarım ışık dikroik ayna yardımıyla yansıtılır. kiriş sonra doku üzerinde konumlandırılmış bir modlu fiber optik üzerine bir asferik lens ve mikroskop objektif ile odaklanmıştır. Herhangi bir epifluorışıma düzenlemede olduğu gibi, dikroik ayna da yayılan ışık uyarma ayırmak için hizmet eder. yayılan ışık spektrumu herhangi yansıyan uyarma çıkarmak için geri bariyer filtresi üzerinden geçecek. Son olarak, yayılan ışık, bir fotodetektör (Şekil 1) üzerinde bir hedefi ile odaklanmıştır.
elektrik akımına ışık iletim silikon çığ fotodiyotları ile gerçekleştirilir. Bu diyotlar hızlı tepki ve düşük ışık algılama sağlayan yüksek duyarlılığa sahip.çığ fotodiyotlar tarafından üretilen fotoakım iki şekilde amplifiye edilebilir: a transempedans kuvvetlendirici bir voltaj (Şekil 1 f) içine mevcut dönüştürmek için bir direnç geribesleme elemanı (Şekil 1 E) sahip olan ya da entegratör tarafından. İlk yaklaşımı kullanarak, çıkış voltajı fotoakım ve geri bildirim direnci ile doğru orantılıdır. Pikosaniye lazer darbelerinin direnç tespit tipik bir örneği Şekil 2a, 2b ve 2c'de gösterilmiştir. Paneli 2a transempedans yükselticinin çıkışı göstermektedir ve panel 2b bir yıldız işareti (*) ile belirtilen aralığın bir zaman genişleme gösterir. Bir tepe izleme algoritması floresan yanıtları 12 zirve (kırmızı) ve taban (yeşil) saptamak amacıyla yapılmıştır. Baz floresan ölçümü ortam lig getirdiği çığ fotodiyot karanlık akımı ve etkileşimler hem bilgi sağlarht ve elektromanyetik kavrama. Tepe ve bazların bir temsili Şekil 2c'de gösterilmektedir. Bu rakam, bir dayak parakeet kalbin kalp döngüsü sırasında Ca2 + bağlı boya (Rhod-2) yaydığı floresan göstermektedir.
İkinci yöntemde, birleştiricinin çıkışı gerilim akım ve kapasitif geri besleme bir fonksiyonudur (Şekil 2D, 2E ve 2F). Herhangi bir dış aydınlatma ilk ve darbeli LED'den uygulamalı ışık darbeleri ile ikinci: Şekil 2f iki ardışık entegrasyon döngüleri gösterir. Ayrıntılı bir açıklama Şekiller 2G ve 2 içinde sunulmaktadır. Bu yaklaşım, daha zahmetli olmasına rağmen nedeniyle geri kapasitör termal gürültü olmaması daha büyük bir S / N sağlar. enstrüman ikaz ışığı tüm kontrol ve çoğullama üretir ve headstage entegrasyon ve res komutları bir zamanlama aşamasını kapsamaktadıret dönemleri. Bu, genellikle aynı zamanda bir veri bir on-line regresyon hesaplama tarafından entegre çıkış sinyalinin sayısal farklılaşmasını gerçekleştiren bir dijital sinyal işleme devresi ile gerçekleştirilir. bir dirençli geri kullanılması durumunda, bir A / D toplama kartı kullanılabilir.
Son olarak, LFFM tekniği son derece çok yönlüdür ve birden fazla bölgeye kayıt için adapte edilebilir. ışık yolu bir ışın ayırıcı ekleme bize iki fiber optik içine ışık split sağlar. Her optik fiber tel daha sonra eksojen floresan probları bir, bağımsız bir şekilde, tahrik doku ve kayıt emisyon farklı bölgelere yerleştirilebilir. Bu değişiklik fizyolojik değişkenleri nasıl etkilediğini anatomik bölgesel farklılıklar değerlendirmek için bize izin verir. Şekil 3, bu iki fiber optik transmural elektrikli veya hücre içi ölçmek için kullanılan CW uyarma ışık bölmek üzere kullanıldığı bir ışın ayırıcı göstermektedir [Ca2 +] seviyeleri with minör-invaziv. Transmural sinyaller tek endokardiyumda lif ve ventriküler duvar epicardium katmandaki diğer koyarak kaydedilebilir. Bu nedenle, LFFM tekniği farklı bölgelerde hücresel sinyallerin zaman sürecini ölçmek için yeteneği ve bölgesel değişiklikler patolojik durumlar altında meydana test etmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol ve tüm fareler taşıma UC Merced Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (No 2008-201) tarafından onaylandı. parakeets yapılan deneyler Bilimsel Araştırma Venezüella Enstitüsü (Ivic) bilimsel komisyon tarafından kurulan hayvan kullanımı için genel politikalarına göre 1999 yılında yapılmıştır.
1. Langendorff Kurma Hazırlık
- 140 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0.33 HPO 4, 10 glukoz, 10 HEPES 2 Na mM aşağıdaki çözünen konsantrasyonlarını ihtiva eden Tyrode çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.4'e Tyrode çözeltisi pH'sini ayarlamak ve 0.22 um'lik bir filtreden filtre solüsyonu.
- 60 mL'lik şırıngalara Tyrode çözeltisi ve 11, 12 Şekil 4'te gösterilen kurulumu yatay Langendorff her boru yerleştirin. tüm hava kabarcıklarını yok etmek için emin olun.
- O 2 tanka plastik boru bağlayın.
- 60 ml şırınga içinde Tyrode çözeltisi içine 5 "tüp düşürmek için plastik Tee adaptörü ekleyin.
- Tyrode çözeltisi içine 2 fokurdayacaktır dışarı O yüzden 5 "borusunun ucuna plastik bir hava taşı takın.
- bir kanül olarak kullanılan bir iğne etrafında bir emilemeyen cerrahi sütür yerleştirin. İğne farklı çözümler retro-perfüzyon sağlar, manifold (bakınız Şekil 4) ile birleştirilir. Son olarak, kalbin aort iğne içine kanüle edilecektir.
2. Hayvan Hazırlama ve kalp Diseksiyon
- heparin ile fare tartılır ve enjekte (ex. Fare ağırlığı 20 g, 20 adet veya 200 mL enjekte), boyunları kırılarak ötenazi önce 15 dakika. Uyutmak parakeets göre to hayvan kullanımı için IACUC protokolü kılavuzları ve daha sonra servikal dislokasyon ile devam edin.
NOT: 8 haftalık fareler ya da 20 gr parakeets kullanın. - Euthanization sonra göğüs boşluğunda kalp kaldırmak. Fareler için tarif edildiği gibi aynı şekilde parakeet kalpleri ekstrakte edin.
- etanol ile fare göğüs temizleyin.
- Diseksiyon makas kullanarak, alt karın bölgesinde bir kesi yapmak ve daha sonra boyun doğru tarafı yukarı kesti.
- kesim doku geri çekin ve aşağı pin.
- diyaframı kesti. kalbi zarar görmemesi için diyaframın keserken dikkatli olun.
- akciğerleri ve çevresindeki doku çıkarın.
- sıkarak olmadan kalbini kepçe için cımbız kullanın. mümkün olduğunca uzun süre aorta kesin.
- yaklaşık 1 mL Tyrode çözeltisi ile küçük bir tartın teknede kalbi taşıyın.
- olmayan bir emilebilir cerrahi sütür kullanarak, üzerinden yatay Langendorff aparat üzerine aorta kravatiğne. İki ince cımbız yardımıyla kalp aort bağlayın. Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri bulunan vanayı açarak retro perfüzyon başlayın.
- Kalp 10 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. kan ve boya yüklemeden önce kalbi çevreleyen yağ dokusu temizlemek için bu kez kullanın. cımbız ile kalbin tabanına yakın yağlı doku çekin ve küçük diseksiyon makas kullanarak kesti. Diseksiyon mikroskobu görünümü altında bu yaptığınızdan emin olun.
3. Sitosolik Ca 2 + Ölçümler: Boya Rhod-2AM Hazırlama
- boya, 50 ug içeren boya üreticisi tarafından sağlanan özel paket plastik bir şişeye DMSO içinde% 20 Pluronic 20 uL (iyonik olmayan bir yüzey aktif madde) ekleyin.
- kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
- iyonik olmayan yüzey aktif madde ve berrak bir cam şişe içinde özel bir paket plastik şişeden boya ile karışık DMSO aktarın. Tyrode Solu 1 ml ekleyinşeffaf cam şişeye yon.
- banyo sonikatör 15-20 dakika süreyle sonikasyon.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca peristaltik pompalar kullanılarak boya serpmek.
- Boya odasında boya yerleştirin.
- manifolduna bağlı diğer boru hatları sıkıştırmak için mekanik bir kelepçe kullanın. kelepçe manifoldu üzerine yerleştirilir. Bu 60 ml şırınga bağlı boru içine herhangi bir akışı önlemek olacaktır.
- boya dolaşan başlamak için perfüzyon peristaltik pompa açın. Hemen 60 ml şırınga altında 3 yollu vanasını kapatın.
- kalbine perfüze edilmiş boya sirküle kalp aşağıdaki emme peristaltik pompaya bağlı olan bir küçük boru yerleştirin.
4. İçi SR Ca 2 + Ölçümler: Boya Mag-Fluo4AM Hazırlama
- Rhod-2AM ile aynı şekilde Mag-Fluo4AM hazırlayın. adım adım talimatlar için bölüm 3'e bakınız.
- afteboya yükleme r, retro perfüzyon başlamak için Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri bulunan vanayı açın. manifoldu üzerindeki kelepçeyi çıkarmak için emin olun.
- Yatay odasına Tyrode çözüm ekleyin ve 37 ° C'ye kadar ısıtın.
- 45 dakika Tyrode çözeltisi ile retro-perfuse sitozolik boya kaldırmak için.
5. Membran potansiyeli ölçümü: Boya Di-8-ANEPPS Hazırlama
- boya 5 mg içeren boya şişeye% 99 5 ml etanol ekleyin.
- Kısım Bir tekrarlayıcı pipet kullanarak 500 ayrı 1 ml plastik şişeleri içine 10 uL.
- -20 ° C de hızlı vakum ve mağaza kurutun.
- kurutulmuş boya 10 mikrogram ile plastik şişeye 20% 20 uL pluronik DMSO içinde ekleyin.
- kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
- Plastik şişeden taksimatlı bir silindir (10 mL) Pluronic ve boya ile DMSO içeren karışımı aktarın. nihai VO Tyrode çözeltisi ekleyin5 mL lume.
- banyo sonikatör 20-25 dakika süreyle sonikasyon.
- peristaltik pompalar kullanılarak 30 dakika boyunca kalp içine serpmek. Bölüm 3.5 kademeli talimatlarına bakın.
6. Epikardiyal Sinyalleri Kayıt
- boya yükledikten sonra, manifold üstünde kelepçe kaldırarak Tyrode çözeltisi ile kalbi retro serpmek. Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri olarak bulunan vanasını açın. 10 dakika boyunca retro perfuse Tyrode çözüm kalbi stabilize etmek.
- Tyrode çözeltisi ile yatay oda doldurun ve 37 ° C banyo sıcaklığının getirmek için Peltier ünitesine açın.
- Kalbin yüzeyinde fiber optik yerleştirin.
- 2 ml pipet içindeki fiber optik yerleştirin ve sonra bir micromanipulator pipet takın.
- Biraz LV yüzeyine karşı fiber optik basın Mikromanipülatör kullanın.
- Dışarıdan hea adımlamakBir dalga üreteci tarafından kontrol edilen bir uyarıcı ile rt.
- 1 ms genişliğinde bir kare darbe sağlamak için dalga jeneratörü Program.
- dışarıdan Senkronize edilecek stimülatörü ayarlayın ve dalga jeneratörü harici girişi bağlayın.
- uyarıcısı her çıkışına, sonunda lehimlenmiş bir akupunktur iğnesi ile bir tel bağlayın.
- yaklaşık olarak 3 mm birbirinden kalbin üst hem de akupunktur iğneleri yerleştirin.
- iğneler dokuda yerleştirilir sonra, elektrik çarpmasını önlemek için stimülatörü çıkışını açmak.
- satın alma yazılımında, 10 kHz satın alma frekansını ayarlayın.
7. Endokardial Sinyalleri Kayıt
- boya yükledikten sonra kalbi stabilize etmek için 6.1 ve 6.2 adıma bakın.
- Fiber optik boyutu hakkında keskin bir 23Ga noktası kullanarak, septum yakın LV kalbin yüzeyinde küçük bir delik yapmak. <li> mikromanipülatör kullanarak endokarda ilk fiber optik konumlandırılmasına yardımcı olmak için bir intravitreal cerrahi sklerotomi adaptörünü yerleştirin.
- Dışarıdan kalbi adımlamak. 6.4 adıma bakın.
- satın alma yazılımında, 10 kHz satın alma frekansını ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endokardiyuma ve epikarda AP ve Ca 2 + transientler
ventriküler duvar boyunca sinyalleri karşılaştırmak için, bir fiber optik endokarda konumlandırılmış ve endokard diğer. epicardium gelen biriyle endokarda kaydedilen bir AP morfolojisi karşılaştırılması transmural fonksiyonunu değerlendirmek için en iyi yoldur. ventrikül duvar oldukça heterojen olduğu ve bu nedenle, AP morfolojisi bu iki bölgede çok farklıdır. İyi endokardiyum az olduğu bilinmektedir ben epicardium 17, 18, 19 den. Az ben endokarda 18, 20 faz 1 daha yavaş repolarizasyonu yapar. Şekil 5b, SHendokard ve epikarda gelen AP tipik bir optik kayıt OWS. Bu kayıt yapmak için, fare kalpleri potansiyometrik boya di-8-ANEPPS ile yüklendi ve floresan CLFFM tekniği kullanılarak ölçülmüştür. Özellikle 1. evrede optik kaydedilen AP morfolojisi, epikarda karşılaştırıldığında endokarda için daha yavaş bir zaman süreci (Aksiyon Potansiyeli Süresi (AKB) 30 2.5 ± 8.01 ms) (0,59 ± 3.4 ms) (Şekil 5b) gösterir. Genel olarak, AKB 30, 70 ya da 90 (şekil 5a) de dahil olmak üzere belirli bir oranda tekrar polarize AP geçen süre olarak tanımlanabilir. Bu izler belli bir kalibre edilebilir, normalize ve bu AP floresan sinyalleri olmasına rağmen endokardiyumu ve epicardium fazı 1. sırasında önemli ölçüde farklı olduğunu gördüğünüzde (Şekil 5c) APDS karşılaştıran örtüşen faz 0 olması kaymıştır eş zamanlı olarak, bir ile AP ölçülerek membran potansiyeli3 M KCl 13 ile dolu keskin mikroelektrot.
Potansiyel zar ek olarak, eksojen floresan göstergeler hücre içi [Ca2 +] izlemek için de kullanılabilir. Genellikle, biz çünkü yüksek dinamik aralık ve hatta fizyolojik sıcaklıklarda sitoplazmada kalmak kabiliyetini hücre içi Ca + 2 geçişlerini ölçmek için Rhod-2AM kullanın. Şekil 6b endokardiyumu ve epicardium tabakasında hücre içi Ca 2 + transientler tipik bir kayıt gösterir. Bu sonuçlar, kısmen 15 yayınlanmıştır. Intrasellüler bölgesel farklılıkları karşılaştırmak için [Ca2 +] düzeyleri, Ca 2 + transientler kinetik (Şekil 6a) değerlendirildi. Genel olarak, Ca 2 + geçici kinetik (Şekil 6c) analizi endokarda Ca 2 + transientler özellikleri önemli olduğunu göstermektedirepicardium kaydedilen daha yavaş kinetik derecede.
SR lümen Ca 2 + dinamikleri
Kalbinde, yükselişi ve hücre içi düşüşü [Ca2 +] seviyeleri basıncı, kontraktilite ve aksiyon potansiyeli süresi (AKB) dahil olmak üzere birçok fizyolojik değişkenleri tanımlarken kritik önem taşımaktadır. Bir önceki bölümde sitozolik Ca 2 + transientler ölçmek yeteneğimizi nitelendirdi. Ca 2+ SR salınan hücre içi sitozolik Ca 2+ artışın büyük ölçüde sorumludur. Bu nedenle, hücre içi Ca her artış için 2 + Ca + 2 olduğu SR tükenmesi. Bununla birlikte, sitosolik Ca2 + geçici SR Ca2 + serbest bırakmak için tek başına bağlı değildir, aynı zamanda, plazma hücre zarından içeri doğru gelen Ca 2 + bulunmaktadır. bizim laboratuvar16 floresan boya, Mag-Flu-4 am kullanımı ile SR Ca 2 + içeriği değerlendirmek mümkün olmuştur. Bu boya myoplasm ve SR de-esterifiye olmasına rağmen, miyositler sitozolik fraksiyonu dışarı a'ya olabilir. Bu boya çekme sadece 37 ° C sıcaklığının artırılması ile teşvik edilebilir. Bu sıcaklıkta, sitozolik boya zar proteini gibi ATP-bağlayıcı kaset ile çıkarılır. Neyse ki, bu protein, SR zar içinde mevcut değildir. Bu nedenle, 37 ° C sıcaklığına yükseltilmesinden sonra PLFFM tekniği kullanılarak kaydedildi floresans çok SR olan boya bağlanma Ca + 2 bir sonucudur. Organel ölçüm özgüllük test etmek için, kafein darbe RyR üzerinden Ca + 2 salınmasını uyardığı uygulanmıştır. Sinyal gerçekten SR tükenmesi (Şekil 7) bir sonucu olduğunu gözlemlemek mümkündür. Kafein kaynaklı SR Ca 2 + sürümü (Şekil 7a), Her ikisi Mag-Fluo-4 floresans diyastolik seviyesinde bir azalma husule (92 ±% 0.05 (N = 4, p = 0.012)) ve Ca +2 geçici (51 ±% 0.21 amplitüdünde bir azalma (K = 4, p = 0.003)) 16. Intra SR izleri daha önce kaydedilmiş ve kafein uyarıcı sonra aşağı Şekil 7b-7d temsil edilmektedir. Zaman kafein uyarıcı gelen ilerledikçe, SR tükenmesi genliği küçüktür. Şekil 7e, SR tükenmesi Ca 2 + sinyalin amplitüdünde bir düşüşe yol açar, ancak, aynı zamanda, SR Ca2 + serbest bırakma işlemini yavaşlatır sadece göstermektedir. Şekil 7a floresan iz daha önce 15 yayımlanmıştır.
Darbeli LED: Aksiyon potansiyelleri
Şekil 5, di-8-ANEPPS değişiklikleri rapor göstermiştirmembran potansiyelindeki bu 532 nm'de uyarıldığı ne zaman. Bu uyarım koşulları altında, dalga boyunda neşredilen fluoresans bir azalma daha yüksek 590 nm'den daha vardır. İlginçtir, bu potansiyometrik boya maksimum dalgaboyu heyecanlı yakın (~ 476 nm), düşük dalga boylarında iken membran depolarize için boya vardiya floresans emisyon olduğunda. Sonuç olarak, bu tayf kayması farklı iki dalga boyunun yayılan floresan kaydetmemizi izin verir. Bu spektral özellik Di-8-ANEPPS iki farklı dalga boylarında kaydedilen yayılan floresan, son bilgisayarlı kayıt zarında boya konsantrasyonu bağımsız olacak çünkü genellikle büyük değer olan bir özellik karneye sağlar. Di-8-ANEPPS spektral vardiya tam olarak yararlanmak için, biz bir ışık kaynağı olarak darbeli LED'ler kullanıldı. Biz fluorofor heyecanlandırmak için darbeli mavi ışık kullanılır. Uyarma Di-8-A pik emilim dalga boyuna yakın 485 nm, gerçekleştirildiNEPPS (~ 476 nm). İki farklı emisyon spektroskopik bantlarında Toplama oranı oluşumunu ve S / N artırmak ve mekanik uncoupler blebbistatin kullanılan henüz kalpleri sözleşme çevre ışık ve hareket artefakt gibi ortak mod gürültüsünü reddetmek için yeteneği sağlar. Bu durum, kalbin mekanik aktivitesi ve Ca + 2 geçişlerini kinetiği her ikisi aynı anda ölçülmesi gerekir deney koşulları için önemlidir.
PLEDFM zamanlama diyagramı Şekil 8a'da gösterilmiştir. diyagram fotoalgılama headstage, LED açma-kapama zamanlaması ve analog-dijital dönüşüm entegrasyonu ve reset için kontrol mantığını içerir. AP zaman süresince, yeşil dalga boyu bandında tespit floresans kırmızı şerit tespit flüoresans azalır yoğunluğunda bir artış göstermektedir. 8b gösterir Şekilmembran depolarizasyon tarafından üretilen floresans sinyalinin değişimi farklı yönlerde hareket eder. Bununla birlikte, kalp kasılma tarafından üretilen hareket artefaktı zaman emisyon dalga bağımsız olarak, aynı yönde yönlendirilmiştir. daha önce açıklandığı gibi, (yeşil ve kırmızı) her iki kanalın veri yazılım klimalı oranını hesaplarken önce olmalıdır. Klima ofset ve düzeltmeler kazanç içerir. ofset ve kazanç seviyesi düzeltmeleri seçimi otomatik değildir. Yazılımın kullanıcı oranı önce izlerini şart değişkenleri seçmek zorundadır. Panel 8b sonuçlanan oranı (Şekil 8) miyokard hareketi tarafından tanıtılan eser iptal ettiğini göstermektedir.
AP sırasında di-8-ANEPPS floresan göreceli değişim genellikle çok küçük (~% 8 100 mV başına). Buna, di-8-ANEPPS floresan değişimi Ca2 + bağlanma gösteren tarafından üretilen bir çok daha küçük olanRhod-2 (<% 200) ile g. Bu nedenle, di-8-ANEPPS gürültü oranı sinyal geliştirmek üzere, tekrar kayıt ortalama edilebilir.
Darbeli LED: Eşzamanlı Ca kayıtları 2+ ve membran potansiyeli
Bu deneysel yaklaşımı kullanarak son gol Ca 2 + transientler ve AP eşzamanlı kayıtları performans oluşur. optik fiber ile ışık kaynağı birleştirilmesi, LED'lerin emisyon ile boyanın emilim spektrumu eşleşen e analog ve dijital elektronik devre tasarımı: Birden fazla fizyolojik sinyallerin eşzamanlı kayıtları da dahil olmak üzere sistemin farklı yönlerine ilişkin teknik zorluklar çözme gerektiren zamanlaması ve devri ile on-line verileri analiz etmek için hızlı bir yazılım geliştirme oluşturur.
our çalışması, boyaların seçimi kendi spektral özelliklerine bağlıdır. çeşitli sinyalleri ölçmek için kullanılan Flourophores farklı spektral bantlarında absorbe gerekir. Bu durum, sinyal kaynakları arasında bir ayrım için gereklidir. Farklı bir dalga boyuna sahip olan bir LED doku heyecanlandırmak için kullanılan her zaman, floresan o dalga boyunda emer boya ile ilgili sinyale tekabül algıladı. Bu şekilde, floresans emisyon farklı boyalarla gelen ancak aynı dalga boyu bandı, her biri heyecan hangi zaman ile ayırt edilebilir.
Bununla birlikte, boya spektrumları arasındaki karışma tam önlenemez. Boyaların spektral absorpsiyon özellikleri onların zirve absorpsiyon uzak dalga boylarında ışığı emer hale getiriyor. Deneylerde, çapraz her iki yönden üretildi: (1) Rhod-2 kırmızı channe bir Ca 2 + sinyali ekleyerek, mavi LED ile heyecanlı olmakl AP iz, ve (2) Di-8-ANEPPS Ca 2 + geçici sinyal (Şekil 9f) görünen yeşil LED, heyecan ediliyor. Şekil 9'da gösterildiği gibi, bu çapraz-karışma, on-line düzeltilebilir. izinsiz sinyali, gereken sinyal, küçük bir yüzdesi olan, çünkü prosedür çalışır. Son olarak, boyalar bize AP (Şekil 9d) ayırmak için izin dan floresans cebirsel işlem bu tür kullanarak Ca 2 + transientler (Şekil 9h) oluştururlar. Bu işlem ayrıntılı taslağı Şekil açıklamasında anlatılmıştır. Tüm Darbeli LED deneyler 28 ° C gerçekleştirildi fark etmek önemlidir.
Şekil 1: Yerel Alan Floresan Mikroskobu (LFFM). LFFM Epifloresans düzenleme oluşurdoku ile temas halinde olan bir çoklu fiber optik kullanılmaksızın kalbine perfüze eksojen boyalar yayılan floresan kaydetmek için. LFFM set-up uyarma ışık darbeli bir pico Nd-YAG lazer tarafından sağlanan (a) PLFFM, olmak üzere üç farklı ışık kaynakları kullanabilirsiniz; (B) sürekli dalga lazerler kullanılır ve ışık darbeleri farklı dalga boylarına sahip lazerler çoğullama sağlayan bir ferroelektrik modülatör tarafından oluşturulan CLFFM; ve LED'ler zirve emisyonları (d) 485 nm ve mavi ve yeşil LED'ler için 540 nm ile daha geniş emisyon spektrumları sahip (c) PLEDFM, sırasıyla, elektronik darbeli edilir. lazer kaynağı kullanıldığında, kiriş bir ışın genişletici tarafından flulaştırılmayabilir edilir. Son olarak, dikroik aynalar ve objektif lensler biraz dokuya karşı basıldığında fiber optik en uzak ucuna ışını odaklanır. yayılan ışık geri aynı fiber optik üzerinden geçecek, dikroik ayna, emisalgılanması filtreleri ve fotonlar, bir elektrik akımı dönüştürülür çığ fotodiyot üzerine odaklanmıştır. Mevcut elde edilen çıkış voltajı fotoakım ve geri bildirim direnci ile orantılıdır iki yöntem (E) transempedans yükselteç tarafından amplifiye edilebilir; Çıkış gerilimi akımı ve kapasitif geri besleme işlevi (f) tamamlayıcıdır. Son olarak, sinyal, bir A / D dönüştürücüsü tarafından satın alındı ve bir bilgisayarda görülüyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Rezistif ve kapasitif Dönüşüm. (A) pikosaniye lazer darbelerinin direnç tespit tipik bir örneği gösterilmektedir. Yıldız işareti (b)bir zirve izleme algoritması tepe (kırmızı) ve taban (yeşil) tespit etmek için uygulanan bir zaman genişletilmiş aralığını gösterir. (C) zirveleri ve bazlar kayıtları hesaplanan izlerinin bir temsili 37 ° C ayarlanmış dışarıdan 7 Hz tempolu bir dayak muhabbet kuşu kalbinde Rhod-2 floresan tepkiler ve banyo sıcaklığında gösterilir. h d) kapasitif geri besleme kullanan bir entegratör tarafından dönüştürülmüş fotoakım. Bozulmamış fare kalp Ca 2 + transientler tipik kayıtları iki farklı zaman ölçeklerinde (d ve e) gösterilmiştir. (F) ve LED aydınlatma olmadan üst üste iki döngü entegrasyonu gösterilmiştir. photocurrent geribildirim kapasitör şarj doğrusal olarak sinyal artar integrali. zamana bağlı ayrılmaz (tan (Ɵ)) eğimi p tarafından uyarılan elektron-delik rekombinasyon ek olarak çığ kavşağı etkileyen fotonların sayısı ile doğru orantılıdırhononic etkinlik sırasında çığ diyot herhangi fotonlar algılamaz. Dijital sinyaller headstage entegrasyonunu kontrol ve dönemler paneli g gösterilmiştir sıfırlama. Işıklı (DC) aydınlatıcı olmayan ve LED döneminde (F) sırasında algılanan sinyaller paneli h gösterilmiştir. F ve DC çıkarma floresan gerçek ölçüm fareler kalpleri Ca 2 + transientler dışarıdan 37 ° C (saat) 9 Hz tempolu tespit sağlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: epikardiyumun ve Endokardiyum Ölçümleri için LFFM. CLFFM kurulum epikardiyum An, bu dışsal floresan boyalar yayılan floresan ölçmek için kullanılmıştırd endokard katmanları. Bir ışın ayırıcı eklenmesi epikardiyumun ve endokarda farklı fizyolojik değişkenlerin kayıt kolaylaştırdı. İki fiber optik epikardiyumun ve endokard gelen tespit etmek için bireysel headstages kullanılmıştır. Bir küçük dairesel kesi ventrikül yapılmış ve bir fiber optik endokarda kayıt yoluyla dişli edilmiştir. Bu set-up direnç geri besleme ile bir akım-voltaj dönüştürücü kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Sıcaklık Kontrollü Yatay Odası. bozulmamış kalpleri saatlerce fonksiyonel tutulur Langendorff set-up gösteren bir şemadır. Kalp iğne bağlı olan tüm çözümleri ve boyalar ileaorta dallanma koroner yoluyla kalp içine retro perfüze edilir. odası bir voltmetre bağlanmış bir ısı algılayıcı tarafından okunur banyo sıcaklığını korumak için bir Peltier ünitesinin üzerine yerleştirildiği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Bozulmamış Kalpler Çeper Aksiyon Potansiyeli Ölçümler. (A) Aksiyon potansiyeli süresi (AKB) 30%, 70%, ya da AP repolarizasyon% 90 tamamlamak için gereken süre olarak değerlendirilir. (B) epicardium (siyah) ve endokard (gri), di-8-ANEPPS floresans AP ventriküler duvarın iki katman arasında repolarizasyon morfolojik farklılıklar gösterir. T değerlendirdikten sonra (c)o endokardiyuma ve epikarda 30, 70, ve 90 APD, sonuçlar sadece anlamlı farklılık APD 30 (3 ± 0.6 ms epicardium vs 8 ± 2.5 ms endokarda) meydana gösterdi. Kalpler 6 Hz tempolu ve sıcaklık 37 ° C olarak ayarlanır. Veriler 5 kupa ± SEM. * P <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Çeper Ca 2 + Bozulmamış Kalpler Geçici Ölçümleri. (A) Ca Parametreleri 2+ ölçülen geçici kinetik şunlardır: geçen süre, maksimum ulaşmak için zaman (TP) zirve; bu artış% 90% 10 gitmek için gereken süreyi zaman (RT) yükselmeye; % 10 den çürüme, bozulma süresi (DT)% 90 gitmek için gereken zaman; vesefer geçici, yarı süresi (HD)% 50 tamamlamak için gereken. Gevşeme farklılıkları ile yeşil CW lazer gösterisi epikardiyumun (siyah) ve endokardiyum (gri) Ca 2 + transientler ile uyarma sonrasında Rhod 2 tarafından yayılan (b) Floresans. c) endokard dan 2 + transientler Ca RT, TP, HD önemli ölçüde daha yavaş kinetik vardı ve epikarda kaydedilen dışındaki DT. Kalpler 6 Hz tempolu ve sıcaklık 37 ° C olarak ayarlanır. Veriler 5 kupa ± SEM. * P <0.05. Mattiazzi ve ark Modifiye. 15. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: Bozulmamış Kalpler içi SR Ca 2+ Ölçümleri.(A) Mag-Fluo-4 boyası yayılan flüoresans içi SR Ca2 + konsantrasyonu bir düşüş göstererek zaman bırakır. (B) Ca SR Ca 2+ salınımı tarafından uyarılan 2+ tükenmesi belirten Mag-Fluo 4 floresan azalma genişletilmiş görünüm. (C) 2+ 20 mM kafein ile kalpleri perfüze modifiye serbest Ca temsil Mag-Fluo 4 floresan gelen geçici genlik azalması bir genişletilmiş görünüm. Kafein uzun bir uygulama, Mag-Flu-4 floresan ve Ca 2 + transientler [aşağı 92 ±% 0.05 (n = 4, p = 0.012) ve genlik diyastolik düzeyde hem de bir azalma sonra (d) 51 ±% 0.21 (N = 4, p = 0.003) için başlangıç değerleri, sırasıyla] görülmektedir. daha fazla zaman kafein ilerledikçe, daha küçük SR tükenmesi genliği olduğunu. (E) bd normalleştirilmiş izleri SR tükenmesi sadece teşvik etmediğini göstermektedirs Ca 2 + sinyal azalır ama aynı zamanda aşağı SR Ca 2 + ikmal yavaşlatır. Kalpler 4 Hz tempolu ve sıcaklık 37 ° C olarak ayarlanır. Floresan iz Kornyeyev ark değil. 16. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8: Darbeli LED bozulmamış kalplerinde AP oranlı metrik ölçümleri. (A) entegrasyonu ve headstage sıfırlama dahil olmak üzere zamanlama diyagramı, açma-kapama LED ve gerçek bir kaydın zamanlarında gösterilmiştir. Iki kanal farklı dinlenme değerlerine sahip ve her AP dinlenme değeri öncesinde kadar kollarını hareket ettirerek düzeltilir ofset (b) İzler. Her kanalın kazanç da alacak şekilde ayarlayın olduğuTed. çok büyük bir hareket eser iki depolarizasyonlarından arasında her iki kanalda göründüğünü unutmayın. Yazılım ratiometrically sinyalleri işler sonra, sonuç fark eserler (mavi) olmadan bir AP olduğunu. Kalpler 3 Hz tempolu ve sıcaklık 28 ° C olarak ayarlanır. Gösterilen tüm kayıtlar 10 izleri bir ortalamasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 9: Eşzamanlı Ca 2+ Geçici ve Pulse LED bozulmamış Hearts AP Ölçümleri. Sinyallerin çapraz konuşma bulaşma kaydederken hem Ca 2 + AP on-line düzeltilebilir. Potansiyometrik boya, di-8-ANEPPS, 20 us ile heyecanlı mavi LED bakliyat (a). Sinyaller ler vardırplit, bant geçiren kırmızı ve yeşil filtreler ile filtrelenmiş. Bu sinyaller, kırmızı (b) ve yeşil kanal (C) olarak gösterilen iki farklı çığ fotodiyotları tarafından tespit edilir. Kırmızı ve yeşil hem sinyaller, bir aşağı doğru sapma olarak görünür bir fark hareket artifakı sunmak olduğunu gözlemlemek mümkündür. Kırmızı ve yeşil Her iki sinyal, offseted ve güçlendirilir. Durumunu sinyallerin önceden arasındaki oranı hesaplamak için kullanılır ve sonuç d gösterilmiştir. Hareketli eserler iptal edilir sinyallerini (d) arasındaki oran olarak gözlemlemek mümkündür. Panel e yeşil yayan LED Ca 2 + göstergesi Rhod-2 heyecanlandırmak için kullanılan kontrol mantık bakliyat dizisini göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak elde flüoresan sinyal f gösterilmiştir. F iz çoğunlukla Ca 2 + bağlanma gösteren floresan sinyalinde bir artış göstermesine rağmenRhod-2 g, bunun nedeni bu boya yeşil ışık heyecan di-8-ANEPPS bir flüoresan tespit sinyaline iz negatif sapmayı gözlemlemek mümkündür. Bu sorun g gösterilen potansiyometrik sinyal çıkarılarak düzeltilebilir. Çıkarma sonucu paneli h Ca gösterilmiştir 2+ AP kirlenme elde edilir serbest işaret etmektedir. Kalpler 3 Hz tempolu ve sıcaklık 28 ° C olarak ayarlanır. Gösterilen tüm kayıtlar 10 izleri bir ortalamasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, kardiyak miyositlere ex vivo fonksiyonu değerlendirmek için yerel alan floresan tekniklerini anlatan merkezli. Bir bağlanmış bir ortamda, bu hücrelerin bir çalışma, sadece daha fizyolojik değil, aynı zamanda, organ düzeyinde patolojileri değerlendirmek için son derece uygundur. Eksitasyon-kasılma kaplin (ECC) altında yatan hücresel olaylar hücre içi Ca 2 + dinamiklerini izlemek moleküler probların kullanımı ile tüm organ düzeyinde (Rhod 2 sitozolik Ca 2+, Mag-Fluo4 SR Ca 2 +) değerlendirilebilir ve elektriksel aktivite (di-8-ANEPPS). Burada, hem heyecanlandıracak ve optik fiberler kullanılarak floresan göstergelerden emisyon toplamak üç LFFM Epifloresans teknikleri sundu. Onlar kullanılan ışık kaynağı ve ışık modülasyon türüne göre farklılık gösterir. LEDFM ayrıca PLEDFM de darbeli olabilir LED'ler kullanır iken PLFFM, ışık, CLFFM sürekli lazer ışığı kullanır bakliyat bir lazer kullanılmaktadır. Bütün bunlarBir set olarak Şekil 1 'de sunulmuştur, ancak üç epifloresans düzenlemelerin sadece biri ile imal edilebilir. Buna ek olarak, tespit ışığı farklı şekillerde işlenebilir. Örneğin, Şekil 2, fotoakım entegre veya doğrudan bir akım--voltaj dönüştürücü vasıtasıyla bir gerilime dönüştürülür de olabilir; burada iki farklı durumu göstermektedir. Şekil 3 görüldüğü gibi, genel olarak, LFFM yaklaşımı, aynı anda birden fazla anatomik bölgelerden ölçmek için kullanılabilir.
sağlam bir organ düzeyinde kardiyak özelliklerini değerlendirmek için burada sunulan yöntem hücreleri arasındaki bağlantı dokusunun davranışını tanımlayan kritik olduğu sorunları incelemek için daha uygundur. Farklı AP üretebilir kalbin içsel heterojen özel doku dayalı, 22 21, 13 dalga formlarını hangi ce denrf kaynaklanır. Bu nedenle, tüm organ çalışmaları farklı anatomik yapıların hücrenin yerel fizyolojik fonksiyonunu değerlendirmek için fırsat sağlar. Ayrıca, biz kıvılcım ve dalgalar gibi hücre içi olaylar sağlam organı 15 daha ayrışmış hücrelerde farklı kinetik sahip olduğunu gördük.
Langendorff kurulum (Şekil 4), in vivo daha yakın bir durumda kalbi korumada önemlidir. Ayrıca, çeşitli fizyolojik değişkenlerin ölçümü izin birden fazla ilaç ve çeşitli floresan moleküler probların retroperfusion sağlar. Farklı bir ışık kaynağı, kullanılan eksojen flüoresan millerini değişen fiber optik boyutunu artırarak, ya da seçme dramatik tekniğin uygulanmasını değiştirebilir. Ayrıca, yatay odasının altındaki peltier birimi çeşitli sıcaklıklarda Ca 2+ dinamiklerinin çalışma kolaylaştırabilir. aksesuarlar ekleyerekBir ışın dağıtıcı sağlam kalbinde farklı bölgelerden kaydetmek için kullanılan fiber optik sayısını artırabilir gibi LFFM için. Bu bölgesel farklılıklar patolojik senaryolarda ortaya olmadığını test etmek çok kullanışlı bir uyarlamasıdır. Şekil 3 endokardı gösterir ve epicardium aynı anda değerlendirilen. Ayrıca, farklı agonistleri ile kalbi perfüze bize ventriküler duvar boyunca farklı bölgelerde nasıl düzenlendiği anlamak sağlar. Elektrik sinyal (Şekil 5) ve Ca 2 + kinetik (Şekil 6) heterojenliklerdir epikardiyumun ve endokarda de mukayese edilebilir. Buna ek olarak, farklı uyarma dalga boyunda ve emisyon filtreleriyle birden boyalar kullanılabilir. Örneğin, Mag-Fluo-4 ile, SR lümenindeki Ca 2 + seviyeleri (Şekil 7) kaydedilebilir. fiber optik değişen boyutlarda da lar floresan kayıt izin vererek bu yöntemin kapasitesini uzatabilirsinizger bölgesi.
Bu çalışma aynı zamanda kenara pahalı lazerler, LED'ler eden tekniğinde bir uyarım ışığı kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Şekil 8, bir ışık kaynağının bu ucuz türü ratiometrically AP ölçmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Şekil 8'de gösterilen rasyometrik ölçümü hareketinden kaynaklanan de dahil olmak üzere deney yapay bir son kayıt üretiminde avantajlıdır. Son olarak, hatta Ca 2 + geçici ve AP optik çoklayıcı farklı dalga boylarında ve aynı emisyon spektrumları ile kullanarak boyalarla aynı anda, kaydedilebilir. Şekil 9'da özetlenen sinyallerin işlenmesi boyaların emisyon spektrumları örtüşme tarafından üretilen iç lekeleri çıkarma önemlidir. Ca 2 + transientler ve AP, aynı anda, ancak iki bağımsız çıkış sinyallerini kayıt ECC ve Ca 2 + indüklediği Ca okuyan faydalıdır 2+
LFFM sağlam dokuların hücre fizyolojisinin birden çok uygulama ile bir tekniktir. Bununla birlikte, tek bir önemli bir sınırlama kaydedilen floresans optik fiber doku ile temas halinde olan, yerel bölge alttaki flüoresan lambaları emisyon ortalama olmasıdır. İki fiber optik ile bile, LFFM ölçülen sinyallerin bir alt hücresel dağılımını sağlamamaktadır. Optik haritalama gibi AP, Ca 2 + transientler yayılımı olarak uzay ve zaman içinde değişiklik fizyolojik değişkenleri izlemek için daha iyi bir tekniktir ve alternansı 23, 24, 25. LFFM da konfokal mikroskopi ve diğer optik haritalama teknikleri gibi, yapıların görüntüleme sağlayamaz. Bununla birlikte, fiber optik kullanımı r pratik yaparendokardium veya konfokal mikroskop ile sağlam bir kalbindeki ulaşılması zor ya da imkansız olan başka bölgelerinde yerel floresan sinyalleri ayıt.
bozulmamış kalpleri elde edilen fizyolojik değişkenler arasındaki ve izole miyosit deneyler karşılaştırma zordur. izole edilmiş kalp miyositleri kullanarak en büyük avantajı, bağlantı klemp koşullar altında hücrelerin biyofiziksel özelliklerini değerlendirmek için eşsiz bir fırsattır. Bunun aksine, LFFM daha doğal bir ortamda fizyolojik ve patolojik olgusunun çalışma sağlar. Örneğin, bozulmamış kalpleri biz izole hücrelerde ulaşılamaz olan transmural fizyolojik olarak farkları 15, AP ve Ca kalp hızı bağımlılığı 2+ aralıkları 13 değerlendirebilir. Buna ek olarak, sağlam kalp 9, 10 fonksiyonu üzerindeki İşemi etkilerini incelemek için. Tüm kalp exdeneylerinizi da bize diğer hücre türleri ve miyositlere 11 arasındaki etkileşimi değerlendirmek için izin verir.
LFFM hücreleri fizyolojik kaplin sahip olduğu bozulmamış kalp seviyesinde hücresel sinyallerin görselleştirme sağlar. Hücreler, bozulmamış organ ise hala LFFM hücre içi aktivite çalışma sağlar. Ca 2 + dinamikleri ve elektriksel aktivite: floresan boyalar ve epilüminesans ile birlikte, LFFM iki kilit kardiyak özelliklerini izleyebilirsiniz.
Son olarak, burada sunulan yöntem ECC çalışmada birden çok uygulama olabilir. Bu tür aritmi 16 ve iskemi 9, 15 gibi patolojik durumlarda nasıl etkilendiği supramoleküler sinyaller ortaya bir araçtır. Bu teknik sadece sağlam bir organ düzeyinde anlaşılabilir çünkü bu patolojilerin incelemek için bir zorunluluktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz sunulan çalışmanın kritik tartışma için Dr. Alicia Mattiazzi teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe yoluyla (R01 HL-084487) ALE için desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
