Summary
No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.
Abstract
No coração, os estudos de sinalização molecular são geralmente realizadas em miócitos isolados. No entanto, muitas situações patológicas, tais como isquemia e arritmias só pode ser totalmente entendido a todo o nível do órgão. Aqui, apresentamos a técnica de espectroscopia de fluorescência microscopia de campo local (LFFM) que permite a medição de sinais celulares no coração intacto. A técnica baseia-se numa combinação de um coração perfundido de Langendorff e fibras ópticas para gravar sinais fluorescentes. LFFM tem várias aplicações no campo da fisiologia cardiovascular para estudar o coração em condições normais e patológicas. Várias variáveis cardíacas pode ser monitorizada utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estes incluem citosólica [Ca2 +], retículo sarcoplasmático intra-[Ca 2+] e potenciais de membrana. As sondas fluorescentes exógenos são animado e a fluorescência emitida detectada com três arranjos diferentes de técnica LFFM epifluorescências apresentada neste artigo. As diferenças central entre estas técnicas são o tipo de fonte de luz utilizada para excitação e sobre a forma como a luz de excitação é modulada. O LFFM pulsada (PLFFM) usa pulsos de luz laser, enquanto onda contínua LFFM (CLFFM) usa luz laser contínuo para a excitação. Finalmente, diodos emissores de luz (LEDs) foram usadas como uma fonte de luz terceiro. Este arranjo não coerente é chamado pulsada microscopia de fluorescência LED (PLEDFM).
Introduction
O coração é o órgão central do sistema cardiovascular. A contracção do coração é iniciado por um aumento intracelular [Ca2 +]. A relação entre a excitabilidade elétrica e as mudanças no intracelular liberação de Ca2 + tem sido historicamente estudado em células enzimaticamente dissociada 1, 2. No entanto, as células cardíacas estão electricamente, metabolicamente e mecanicamente acoplada 3, 4. Quando isolado, os miócitos não são só fisicamente desacoplado, mas miócitos de diferentes camadas são misturados durante a dissociação 5. Além disso, apesar das enormes vantagens que surgiram a partir do estudo de células isoladas, sob condições de fixação de tensão, 6, 7, 8 a natureza intrínseca do coração como um alwa sincício elétricays coloca a questão de como funcionalmente diferentes são células dissociadas das presente no tecido 3.
Neste artigo, descrevemos os avanços obtidos no conhecimento da fisiologia cardíaca através da utilização de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais (LFFM) no coração intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiplas variáveis fisiológicas, como citosólica de Ca2 +, intra retículo sarcoplasmático (RS) Ca 2+ e potencial de membrana. Estas medições podem ser obtidos simultaneamente e em conjunto com a pressão ventricular 9, 10, eletrocardiogramas 9, potenciais de ação elétricos (APs), gravações atuais iónicos e fotólise de compostos enjaulados 4, 11. Além disso, estas medidas podem ser obtidas pelo ritmo do coração intacto em frequências mais altas pertor para taxas fisiológicas. Apesar de vários artigos 9, 11, 12, 13, 14 foram publicados pelo nosso grupo usando técnicas LFFM, a presunção de complexidades técnicas associadas com esta técnica tem impedido a sua utilização maciça em estudar fenômenos fisiológicos ex vivo no coração e outros órgãos.
A técnica LFFM (Figura 1) é baseado em medidas epifluorescência obtidos usando uma fibra óptica multimodo em contacto com o tecido. Como qualquer técnica de imagiologia de fluorescência de contacto, a resolução óptica depende do diâmetro e a abertura numérica (NA) da fibra. Um diâmetro maior e menor de NA da fibra irá aumentar a resolução espacial das medições. AEs e diâmetro das fibras pode variar 0,22-0,66 e de 50 um a 1 mm, respectivamente. Dentrovincar a AN irá melhorar a relação sinal-ruído (S / N), aceitando fotões que chegam a partir de um ângulo sólido maior. A fim de actuar como um dispositivo de epifluorescência, o feixe de luz é focado na fibra óptica com uma lente asférica ou um objectivo epifluorescência onde a NA da lente e o fósforo de fibra. Esta correspondência maximiza a transferência de energia para a excitação e para recolher de volta os fótons emitidos pelo fluoróforo.
A fim de excitar os indicadores fluorescentes exógenos carregados no tecido, diferentes fontes de luz e modos de iluminação pode ser utilizada. Nossos estudos pioneiros utilizando a microscopia pulsada de campo local de fluorescência 3, 12 (PLFFM) empregue um laser low-cost de picossegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fonte de luz tem a enorme vantagem de excitar uma grande fracção de moléculas fluoróforo sob a área de iluminação, sem branqueamento substancialmente o corante devidoao pulso curto durações 12. Além disso, a utilização de impulsos ultracurtos permitiu a avaliação do tempo de vida de fluorescência do corante 12. O tempo de vida de fluorescência é uma propriedade que pode ser utilizada para quantificar a fracção de moléculas de corante ligado ao Ca2 +. Infelizmente, a tremulação temporal dos pulsos e das variações na amplitude de impulso-para-impulso de limitar a aplicação desta estratégia experimental para casos em que a alteração na fluorescência produzida pela ligação com o ligando corante é grande.
Onda contínua (CW) lasers são usados geralmente como a principal fonte de iluminação em LFFM (Figura 1b, CLFFM). O feixe de laser pode continuamente iluminar o tecido ou pode ser modulado ferroelectrically. A modulação ferroeléctrica do feixe permite a geração de impulsos de luz microssegundos. Esta modulação pode ser controlada pelo hardware externo. Este procedimento não só reduz drasticamente tele jittering temporal dos pulsos de luz, mas também permite misturar vigas de diferentes comprimentos de onda. A mistura de vigas é feito por multiplexagem de diferentes raios laser. Como consequência, vários corantes possuindo diferentes propriedades espectrais pode ser animado para realizar medições de uma variedade de variáveis fisiológicas, por exemplo, Rhod-2 para o Ca2 + citosólico, MagFluo4 para administração intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS para potencial de membrana.
Embora lasers apresentam várias vantagens como a fonte de luz em LFFM, outros tipos de fontes de luz podem ser utilizados, incluindo díodos emissores de luz (LEDs). Neste caso, a fonte de luz de excitação consistiu de um LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). Em LEDs, os fótons são espontaneamente emitida quando elétrons da banda de condução recombinar com furos na banda de valência. A diferença com lasers de estado sólido é que a emissão não é estimulada por outros fotões. Isto resulta num feixe coerente e não-uma emissão espectral mais amplo para os LEDs.
Podem ser usados diferentes tipos de LEDs de alta potência. Para as gravações PA usando Di-8-ANEPPS e para Ca 2+ transientes registados utilizando Fluo-4 ou MAG-Fluo-4, utilizou-se um diodo emissor de luz que tem um pico de emissão a 485 nm típico (azul) e uma meia largura de 20 nm (Figura 1D). Para Ca 2 + transientes gravados com Rhod-2, o LED teve um pico de emissão típica a 540 nm (verde) e uma meia largura de 35 nm (Figura 1d). LEDs emitem em um comprimento de onda de banda e, portanto, exigem filtros para reduzir sua emissão espectral. Além disso, a luz pulsada pode ser gerado a uma taxa de 1,6 kHz com duração de 20 uS. Os LEDs foram pulsadas com uma potência MOSFET de efeito de campo transistor rápido. gravações em simultâneo com diferentes indicadores pode ser realizada por tempo-de multiplexação os LEDs. Infelizmente, a luz emitida pelos LEDs é mais difícil de foco para uma fibra óptica em relação a um feixe de laser. Assim, a principal desvantagem de nósing LEDs é que os seus perfis de emissão têm deslocamentos angulares (± 15 °) em relação ao eixo principal, e uma óptica auxiliar deve ser usada para corrigir o problema.
Em todas as configurações ópticas anteriormente descritos, a luz de excitação é reflectida com a ajuda de um espelho dicróico. O feixe é subsequentemente focada por uma lente asférica e uma objectiva de microscópio sobre uma fibra óptica multimodo que é posicionada sobre o tecido. Como em qualquer arranjo de epifluorescência, o espelho dicróico também serve para separar a excitação da luz emitida. O espectro de luz emitida viaja de volta através de um filtro de barreira para remover qualquer excitação reflectida. Por fim, a luz emitida é focada, com uma objectiva para um fotodetector (Figura 1).
A transdução de luz a corrente eléctrica é feita pelos fotodíodos de avalanche de silício. Estes diodos têm uma resposta rápida e uma alta sensibilidade permitindo a detecção de pouca luz. ofotocorrente produzida pelos fotodiodos de avalanche pode ser amplificado em duas formas: um amplificador de transimpedância resistiva tendo um elemento de retorno (Figura 1e) ou por um integrador para converter a corrente em tensão (Figura 1F). Usando o primeiro método, a tensão de saída é proporcional à fotocorrente e a resistência de realimentação. Um exemplo típico de detecção resistiva de pulsos de laser de picossegundos é mostrado nas Figuras 2a, 2b e 2c. Painel 2a ilustra a saída do amplificador de transimpedância e o painel 2b mostra uma expansão no tempo do intervalo indicado com um asterisco (*). Um algoritmo de rastreamento de pico foi implementada para detectar o pico (vermelho) e a base (verde) para as respostas fluorescentes 12. A medição da fluorescência de base fornece informações tanto da corrente escura do fotodiodo avalanche e as interferências introduzido por lig ambienteht e acoplamento electromagnético. Uma representação de picos e bases é mostrado na Figura 2c. Esta figura ilustra a fluorescência emitida pelo corante (Rhod-2) ligado ao Ca2 + durante o ciclo cardíaco de um coração a bater periquito.
No segundo método, a tensão de saída do integrador é uma função de realimentação de corrente e capacitiva (Figuras 2d, 2e, 2f). Figura 2f mostra dois ciclos de integração consecutivos: o primeiro sem iluminação exterior eo segundo com pulsos de luz aplicada a partir de um diodo emissor de luz pulsada. Uma descrição detalhada é apresentada nas Figuras 2G e 2H. Esta abordagem, apesar de mais laborioso, proporciona uma maior S / N devido à ausência de ruído térmico no condensador de realimentação. O instrumento inclui um estágio de tempo que gera todo o controle e multiplexação da luz de excitação e comanda a integração headstage e resperíodos et. Esta é normalmente realizada com um circuito de processamento de sinal digital que executa também uma diferenciação digital do sinal de saída integrado calculando uma regressão on-line dos dados. No caso de se utilizar um gabarito resistiva, qualquer de A / D placa de aquisição pode ser usado.
Finalmente, a técnica LFFM é altamente versátil e pode ser adaptado para gravar a partir de mais do que uma região. Adicionando um divisor de feixe no caminho da luz nos permite dividir a luz em duas fibras ópticas. Cada fibra óptica pode então ser colocado em diferentes regiões de tecido para um, independentemente, excita e emissão ficha das sondas fluorescentes exógenos. Esta modificação permite-nos avaliar como anatômica diferenças regionais influenciam variáveis fisiológicas. A Figura 3 mostra um separador de feixe a ser utilizado para separar a luz de excitação CW de tal modo que duas fibras ópticas são utilizados para medir transmural intracelular eléctrica ou [Ca 2+] níveis with minor-invasivo. transmurais sinais podem ser gravados pela colocação de uma fibra no endocárdio e a outra na camada epicárdio da parede ventricular. Portanto, a técnica LFFM tem a capacidade de medir o curso de tempo dos sinais celulares em diferentes regiões e pode ser utilizado para testar se as alterações regionais ocorrer em situações patológicas.
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Protocol
Este protocolo e todo o tratamento ratos foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a UC Merced (No. 2008-201). Experimentos com periquitos foram realizadas em 1999, de acordo com as condições gerais do uso de animais estabelecida pela comissão científica do Instituto Venezuelano de Pesquisas Científicas (IVIC).
1. Langendorff Set Up Preparação
- Preparar a solução de Tyrode contendo as seguintes concentrações de soluto em mM: 140 de NaCl, 5,4 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 de glucose, 10 de HEPES. Ajuste o pH da solução de Tyrode a 7,4 com NaOH e filtra-se a solução através de um filtro de 0,22 um.
- Carregar a solução de Tyrode para as seringas 60 mL e toda a tubagem de Langendorff o plano horizontal definido 11, 12 ilustradas na Figura 4. Certifique-se de eliminar todas as bolhas de ar.
- Ligar a tubagem de plástico para um tanque de O2.
- Adicionar um adaptador T de plástico para reduzir a "tubo 5 na solução de Tyrode na seringa de 60 mL.
- Anexar uma pedra de ar de plástico para o fim do "tubo 5 de modo O2 vai borbulhar para dentro da solução de Tyrode.
- Coloque uma sutura cirúrgica não absorvível em torno de uma agulha usada como uma cânula. A agulha é acoplado ao colector (ver Figura 4) que permite que retro-perfusão com soluções diferentes. Finalmente, aorta do coração vai ser transferida por cânula para a agulha.
2. Preparação Animal e Coração Dissecção
- Pesar e injetar o mouse com heparina (ex. Rato de peso de 20 g, injetar com 20 unidades ou 200 ul) 15 min antes da eutanásia por deslocamento cervical. Anestesiar periquitos de acordo com to guias uso de animais de seu protocolo IACUC e então prosseguir com deslocamento cervical.
NOTA: Use 8 semanas ratos velhos ou 20 g de periquitos. - Tiraram o coração do interior da cavidade torácica após a eutanásia. Extrair corações parakeet exactamente da mesma maneira como descrito para os ratos.
- Limpe o peito do rato com etanol.
- Com uma tesoura de dissecção, fazer uma incisão no abdômen inferior e, em seguida, cortar os lados em direção ao pescoço.
- Puxe o tecido cortado e fixá-lo.
- Cortar o diafragma. Tenha cuidado ao cortar o diafragma para evitar danificar o coração.
- Remover os pulmões e do tecido circundante.
- Use uma pinça para colher o coração sem apertar. Cortar a aorta tanto tempo quanto possível.
- Transportar o coração em um pequeno pesar barco com cerca de 1 mL de solução de Tyrode.
- Usando uma sutura cirúrgica não absorvível, amarrar a aorta para o aparelho de Langendorff horizontal através de umagulha. Amarre a aorta do coração com o auxílio de duas pinças finas. Comece retro-perfusão através da abertura da válvula situado em série com as seringas de 60 ml contendo solução de Tyrode.
- Permitir que o coração estabilizar durante 10 min. Use esse tempo para limpar o sangue e o tecido gordo em torno do coração antes do carregamento do corante. Puxar o tecido adiposo perto da base do coração com pinças e cortadas usando pequenas tesouras de dissecação. Certifique-se de fazer isso sob o ponto de vista de um microscópio de dissecação.
3. Ca citosólico 2 + Medidas: Preparando Dye Rhod-02:00
- Adiciona-se 20 uL da plurónico a 20% (um agente tensioactivo não-iónico) em DMSO para um frasco de plástico embalados especial fornecida pelo fabricante de corante contendo 50 g do corante.
- Misturar por pipetagem cima e para baixo, evitando bolhas.
- Transferir o DMSO misturado com o agente tensioactivo não iónico e do corante a partir do frasco de plástico embalados especial para um frasco de vidro transparente. Adicionar 1 ml de Tyrode solução para o frasco de vidro transparente.
- Sonicar durante 15-20 min num sonicador de banho.
- Perfundir o corante utilizando bombas peristálticas durante 30 min à temperatura ambiente.
- Coloque o corante na câmara de corante.
- Usar um grampo mecânico para comprimir todas as outras linhas de tubos ligados ao colector. O grampo é colocado acima do colector. Isto irá evitar qualquer refluxo para a tubagem ligada para as seringas de 60 ml.
- Ligar a bomba peristáltica para começar a perfusão de circulação do corante. Imediatamente fechar a válvula de 3 vias abaixo da seringa de 60 mL.
- Posicionar um pequeno tubo que está ligado à bomba peristáltica de sucção ao lado do coração para recircular o corante que tenha sido perfundidos no coração.
4. Intra-SR Ca 2+ Medidas: Preparando Dye Mag-Fluo4AM
- Prepara-Mag Fluo4AM da mesma maneira como Rhod-02:00. Consulte a seção 3 para obter instruções passo a passo.
- afteR carregamento do corante, abrir a válvula situada em série com as seringas de 60 ml contendo solução de Tyrode para começar a retro-perfusão. Certifique-se de remover o grampo acima do colector.
- Adicionar solução de Tyrode com a câmara horizontal e aquecer até 37 ° C.
- Retro-aspergir com solução de Tyrode durante 45 minutos para remover o corante citosólica.
5. potencial de membrana Medidas: Preparando Dye Di-8-ANEPPS
- Adicionar 5 ml de etanol a 99% para o frasco de tinta que contém 5 mg de corante.
- Alíquota de 10 uL em 500 frascos de plástico 1 mL individuais utilizando uma pipeta de repetidor.
- Desidratar no vácuo velocidade e armazenar a -20 ° C.
- Adicionar 20 uL de 20% de Pluronic em DMSO para um frasco de plástico com 10 ^ g do corante dessecada.
- Misturar por pipetagem cima e para baixo, evitando bolhas.
- Transferir a mistura contendo DMSO com Pluronic e corante a partir do tubo de plástico a um cilindro graduado (10 mL). Adicionar uma solução de Tyrode a VO definitivalume de 5 mL.
- Sonicate para 20-25 min num sonicador de banho.
- Perfundir para o coração durante 30 minutos utilizando bombas peristálticas. Consulte as instruções passo a passo na Seção 3.5.
6. Gravar sinais epicárdicas
- Após o carregamento do corante, retro-perfundir o coração com solução de Tyrode, removendo o grampo por cima do colector. Abrir a válvula situada em série com a seringa de 60 ml contendo solução de Tyrode. solução de Tyrode-rociar retro durante 10 minutos para estabilizar o coração.
- Encher a câmara horizontal com solução de Tyrode e ligar o aparelho de Peltier para trazer a temperatura do banho para 37 ° C.
- Posicionar a fibra óptica na superfície do coração.
- Coloque a fibra óptica dentro de uma pipeta de 2 ml e em seguida, anexar a pipeta para um micromanipulador.
- Use o micromanipulador para pressionar ligeiramente o fibra óptica contra a superfície do VE.
- Externamente andar pelo heata com um estimulador controlado por um gerador de ondas.
- Programar o gerador de onda para fornecer um impulso quadrado com uma largura de 1 ms.
- Defina o estimulador para ser sincronizado externamente e ligar a entrada externa para o gerador de onda.
- Para cada uma das saídas do estimulador, ligar um fio com uma agulha de acupunctura soldada no final.
- Coloque as duas agulhas de acupuntura no ápice do coração aproximadamente 3 mm de distância um do outro.
- Só depois de as agulhas são colocadas no tecido, ligar a saída do estimulador para evitar o choque eléctrico.
- No software de aquisição, ajustar a frequência de aquisição até 10 kHz.
7. Gravar sinais endocárdicos
- Consulte a etapa 6,1 e 6,2 para estabilizar o coração após o carregamento do corante.
- Utilizando um ponto afiado 23Ga sobre o tamanho da fibra óptica, faça um pequeno orifício na superfície do coração no ventrículo esquerdo perto do septo. <li> Coloque um adaptador cirurgia esclerotomia intravítrea para auxiliar no posicionamento da primeira fibra óptica no endocárdio usando um micromanipulador.
- Externamente ritmo do coração. Consulte o passo 6.4.
- Em software de aquisição, ajustar a frequência de aquisição até 10 kHz.
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Representative Results
AP e Ca 2 + transientes em endocárdio e epicárdio
A fim de comparar os sinais do outro lado da parede ventricular, uma fibra óptica é posicionada no endocárdio e a outra no epicárdio. Comparando-se a morfologia de um AP gravado a partir do endocárdio com um a partir do epicárdio é a melhor maneira de avaliar a função transmural. A parede ventricular é altamente heterogénea e, assim, a morfologia dos APs são muito diferente nas duas regiões. É bem sabido que o endocárdio tem menos I do que o epicárdio 17, 18, 19. Quanto menos eu que faz com que a repolarização da fase 1 mais lento no endocárdio 18, 20. Figura sh 5buxos uma gravação óptica típica do AP a partir do endocárdio e epicárdio. Para executar estas gravações, corações ratos foram carregadas com o corante potenciométrica di-8-ANEPPS e a fluorescência foi medida utilizando a técnica CLFFM. A morfologia do AP opticamente gravado, particularmente na fase 1, mostra um curso mais lento tempo para o endocárdio (duração da potencial acção (DPA) 30 é 8,01 ms ± 2,5) em comparação com o epicárdio (3,4 ms ± 0,59) (Figura 5b). Em geral, a APD pode ser descrito como o tempo que leva o AP para repolarizar uma certa percentagem, incluindo 30, 70 ou 90 (Figura 5a). Esses vestígios foram normalizados e deslocou-se para ter fase de sobreposição 0. Ao comparar os APDs (Figura 5c), vemos que o endocárdio e epicárdio são significativamente diferentes durante a fase 1. Embora esses APs são sinais de fluorescência, que pode ser calibrado para uma específica potencial de membrana medindo simultaneamente a AP com umafiada microeletrodos preenchido com 3 M KCl 13.
Além de potencial de membrana, os indicadores fluorescentes exógenos pode ser usada para monitorizar intracelular [Ca2 +]. Normalmente, usamos Rhod-02:00 para medir intracelulares de Ca2 + transientes, devido à sua alta gama dinâmica e sua capacidade de permanecer no citoplasma mesmo em temperaturas fisiológicas. A Figura 6b mostra uma gravação típico dos transientes de Ca2 + intracelular em camada endocárdio e epicárdio. Estes resultados foram parcialmente publicada em 15. A fim de comparar as diferenças regionais no intracelular [Ca2 +] níveis, a cinética das Ca 2 + transientes foram avaliados (Figura 6a). No geral, a análise dos Ca 2+ cinética transitórios (Figura 6C) mostra que o Ca 2 + transientes do endocárdio teve significativamente cinética mais lenta do que os registrados do epicárdio.
Ca2 + dinâmica no lúmen SR
No coração, a ascensão e queda de intracelular [Ca2 +] níveis são fundamentais na definição muitas variáveis fisiológicas, incluindo a pressão, a contratilidade e duração da potencial acção (APD). A seção anterior descreveu a nossa capacidade de medir os citosólicas Ca 2 + transientes. O Ca 2+ liberada a partir do SR é a grande responsável pelo aumento do intracelulares citosólicos de Ca2 +. Assim, por cada aumento no Ca2 + intracelular existe uma Ca 2+ esgotamento na SR. No entanto, citosólica de Ca2 + transientes não são unicamente devido à libertação de Ca2 + SR, mas também incluem Ca 2+ que entra na célula através da membrana plasmática. nosso laboratório16 tem sido capaz de avaliar o SR teor de Ca2 + através da utilização de um corante fluorescente, Fluo-Mag-04:00. Embora este corante é des-esterificada na myoplasm e o SR, os miócitos pode extrudir a fracção citosólica. Esta extrusão corante pode ser promovida por simples aumento da temperatura para 37 ° C. A esta temperatura, o corante citosólica é removido por uma cassete de ligação a ATP como a proteína de membrana. Felizmente, esta proteína não está presente na membrana RE. Portanto, depois de aumentar a temperatura para 37 ° C, a fluorescência registada usando a técnica PLFFM é principalmente um resultado da ligação de Ca2 + para o corante no interior da SR. A fim de testar a especificidade da medição organelo, um impulso de cafeína foi aplicado para estimular a libertação de Ca2 + através RyR. É possível observar que o sinal é de facto um resultado da depleção SR (Figura 7). A cafeína induzida SR Ca 2+ liberação (Figura 7a) Produzir tanto, uma diminuição no nível diastólico de Mag-Fluo-4 fluorescência (92 ± 0,05% (n = 4; P = 0,012)) e uma redução na amplitude de transientes de Ca 2+ (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Vestígios SR intra gravadas antes e após o estímulo cafeína são representados para baixo na Figura 7b-7d. Medida que o tempo progride a partir do estímulo de cafeína, amplitude da depleção SR é menor. A figura 7e ilustra que a depleção de SR não só induz uma diminuição da amplitude do sinal de Ca2 + mas também retarda o processo de libertação SR 2+ Ca. O traço de fluorescência na Figura 7a foi publicado anteriormente 15.
Pulsed LED: Os potenciais de ação
Na Figura 5 nós mostramos que Di-8-ANEPPS pode relatar alteraçõesno potencial de membrana quando é excitado a 532 nm. Sob esta condição de excitação, há uma diminuição da fluorescência emitida a comprimentos de onda maiores do que 590 nm. Curiosamente, quando este é animado corante potenciométrica perto de seu comprimento de onda máximo de excitação (~ 476 nm), a emissão de fluorescência das mudanças de corante a comprimentos de onda mais baixos quando as despolariza membranas. Por conseguinte, este desvio espectral nos permite gravar a fluorescência emitida em dois comprimentos de onda diferentes. Esta propriedade espectral de Di-8-ANEPPS permite o racionamento da fluorescência emitida registada em dois comprimentos de onda diferentes, uma característica que é normalmente de grande valor porque a gravação computadorizada final será independente da concentração do corante na membrana. A fim de tirar o máximo proveito da mudança espectral Di-8-ANEPPS, usamos LEDs pulsantes como fonte de luz. Usamos luz azul pulsada para excitar o fluoróforo. A excitação foi realizada a 485 nm, perto do pico de comprimento de onda de absorção de Di-8-ANEPPS (~ 476 nm). Aquisição em duas bandas espectroscópicas de emissão diferentes permite a formação de rácio e a capacidade de aumentar S / N e rejeitar ruído de modo comum como a luz ambiental e artefato movimento na contratação de corações onde o blebbistatin desacoplador mecânica não foi usado. Esta situação é muito importante para as condições experimentais em que tanto a actividade mecânica do coração e a cinética de transientes de Ca 2+ precisam de ser medidos simultaneamente.
O diagrama de temporização da PLEDFM é ilustrado na Figura 8a. O diagrama inclui a lógica de controlo para a integração e a reinicialização do andar de entrada de fotodetecção, o momento de ligar-desligar do LED e a conversão analógico-para-digital. Durante o curso de tempo de um AP, a fluorescência detectada na banda de comprimento de onda verde indica um aumento na intensidade de fluorescência, enquanto o detectado na faixa vermelha diminui. A Figura 8b mostraque a alteração do sinal de fluorescência produzida pela despolarização da membrana move-se em direcções diferentes. No entanto, o artefacto de movimento produzido pela contracção do coração está sempre orientada na mesma direcção, independente do comprimento de onda de emissão. Como explicado anteriormente, os dados de ambos os canais (verde e vermelho) deve ser antes de calcular a relação ar-software. O condicionamento inclui offset e ganhar correções. A seleção de correcções nível offset e ganho não é automática. O usuário do software tem de selecionar as variáveis para condicionar os traços antes de a razão. A proporção resultante em 8b do painel (Figura 8) mostram que o artefacto introduzido pelo movimento do miocárdio foi cancelada.
A variação relativa da fluorescência di-8-ANEPPS durante um AP é geralmente muito pequeno (~ 8% por 100 mV). Este di-8-ANEPPS mudança de fluorescência é muito menor do que o produzido pelo bindin Ca 2+g a Rhod-2 (<200%). Assim, a fim de aumentar a relação sinal-ruído de di-8-ANEPPS, várias gravações pode ser calculada a média.
Pulsed LED: gravações simultâneas de Ca 2+ e potencial de membrana
A última meta usando esta abordagem experimental consiste na realização de gravações simultâneas de Ca 2 + transientes e APs. gravações simultânea de vários sinais fisiológicos requerem resolver as dificuldades técnicas relacionadas com os diferentes aspectos do sistema incluindo: acoplamento da fonte de luz com a fibra óptica, correspondente ao espectro de absorção do corante, com a emissão dos LEDs, conceber o análogo e o circuito electrónico digital para gerar a temporização e de aquisição, bem como o desenvolvimento de software rápido para analisar os dados em linha.
em UOR estudo, a selecção dos corantes dependia das suas características espectrais. Flourophores usados para medir diversos sinais devem absorver em diferentes bandas espectrais. Esta condição é essencial distinguir entre fontes de sinais. Cada vez que um LED tendo um comprimento de onda diferente é utilizado para excitar o tecido, a fluorescência detectado corresponde ao sinal relacionado com o corante que absorve no comprimento de onda. Desta forma, a emissão de fluorescência proveniente de diferentes corantes, mas na mesma banda de comprimento de onda, podem ser distinguidos pelo tempo em que cada um é animado.
No entanto, a interferência entre os espectros de corante não pode ser totalmente evitado. Isto é porque as características do espectro de absorção dos corantes torná-los absorvem luz com comprimentos de onda muito longe do seu pico de absorção. Nas nossas experiências, a interferência foi produzido em ambas as formas: (1) Rhod-2 a ser excitado pelo diodo emissor de luz azul, a adição de um sinal de Ca 2+ para a channe vermelhol trace AP, e (2) Di-8-ANEPPS sendo excitado pela luz verde, que aparece no Ca 2+ sinal transiente (Figura 9F). Esta diafonia pode ser corrigido em linha, tal como ilustrado na Figura 9. O processo funciona, porque o sinal de intrusão é uma pequena percentagem do sinal que tem de ser medido. Finalmente, usando este tipo de processamento algébrica do fluorecence dos corantes nos permitiu separar AP (Figura 9d) formar transientes de Ca 2+ (Figura 9H). Uma descrição pormenorizada deste processamento é descrito na legenda da figura. É importante notar que todas as experiências conduziram pulsada foram realizadas de 28 ° C.
Figura 1: O campo local microscopia de fluorescência (LFFM). O LFFM consiste de um arranjo de epifluorescênciausando uma fibra óptica multimodo que está em contacto com o tecido para gravar a fluorescência emitida a partir de corantes exógenos perfundidos no coração. O LFFM set-up podem utilizar três fontes de luz diferentes, incluindo (a) PLFFM, onde a luz de excitação é fornecido por um pico pulsado de Nd-Yag; (B) CLFFM, onde os lasers de onda contínua e são usados impulsos de luz são gerados por um modulador ferroeléctrica permitindo a multiplexagem de lasers com comprimentos de onda diferentes; e (c) PLEDFM, onde LEDs tendo espectros de emissão mais amplas com emissões de pico de (d) de 485 nm e 540 nm para LEDs azuis e verdes, respectivamente, são pulsadas electronicamente. Quando são utilizadas fontes de laser, o feixe é desfocado por um expansor de feixe. Finalmente, espelhos dicróicos e lentes objectivas focar o feixe para a extremidade distai da fibra óptica da qual é ligeiramente pressionada contra o tecido. A luz emitida viaja de volta através da mesma fibra óptica, espelho dicróico, emifiltros Ssion, e é focado em um fotodiodo avalanche onde fótons são convertidos em uma corrente elétrica. A corrente pode ser amplificado por dois métodos (e) amplificador de transimpedância, onde a tensão de saída resultante é proporcional à fotocorrente e a resistência de realimentação; (F) integrador, onde a tensão de saída é uma função de realimentação de corrente e capacitivo. Finalmente, o sinal é adquirido por um conversor A / D e visualizados num computador. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resistiva e capacitiva de conversão. (A) Um exemplo típico de detecção resistiva de pulsos de laser de picossegundos é mostrado. O asterisco (b)mostra um intervalo de tempo expandida, em que um algoritmo de seguimento de pico foi implementado para detectar o pico (vermelho) e a base (verde). (C) Uma representação de traços calculados a partir picos e gravações de bases é mostrado para Rhod-2 respostas fluorescentes em um coração periquito bater cadenciado externamente às 7 Hz e temperatura do banho definido para 37 ° C. d a h) a fotocorrente convertido por um integrador utilizando uma reacção capacitiva. Gravações típicos de coração intacto do rato transientes de Ca2 + são mostrados em duas escalas de tempo diferentes (D e E). (F) A integração dos dois ciclos consecutivos com e sem iluminação LED são mostrados. A integral do sinal aumenta linearmente com a fotocorrente carrega o capacitor feedback. O declive do tempo dependente integral (tan (ɵ)) é proporcional ao número de fotões que impactam a junção avalanche em adição à recombinação de electrões buracos induzida pela Patividade hononic quando o diodo avalanche não detectar quaisquer fótons. Os sinais digitais controlar a integração headstage e redefinir períodos são mostrados no painel g. Os sinais detectados durante o período de não-iluminação (DC) e o LED de iluminação (F) são mostrados no painel h. A subtracção de F e CC proporciona a medição real da fluorescência detectada transientes de Ca2 + a partir de ratinhos corações cadenciado externamente às 9 Hz a 37 ° C (h). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: LFFM para Epicárdio e Medidas endocárdio. O CLFFM set-up foi usada para medir a fluorescência emitida a partir de corantes fluorescentes exógenos presentes no um epicárdiod camadas endocárdio. A adição de um divisor de feixe facilitou a gravação de diferentes variáveis fisiológicas no epicárdio e endocárdio. Duas fibras ópticas foram utilizados com seus headstages individuais para detectar a partir do epicárdio e endocárdio. Uma pequena incisão circular foi feita no ventrículo e uma fibra óptica foi enfiado através de gravar a partir do endocárdio. Este set-up usado um conversor de corrente para voltagem com um feedback resistiva. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Câmara Horizontal com controle de temperatura. Um diagrama que mostra o set-up Langendorff onde os corações intactos são mantidos funcional durante horas. O coração está ligada a uma agulha através da qual todas as soluções e corantessão retro-perfundido para o coração através das coronárias se ramificam da aorta. A câmara é posicionada acima de um aparelho de Peltier para manter a temperatura do banho, que é lida por um sensor de temperatura ligado a um voltímetro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Transmural potencial de ação Medidas em corações intactos. (A) a duração do potencial de acção (DPA) é avaliada como o tempo que leva a completar 30%, 70%, ou 90% da repolarização AP. (B) Di-8-ANEPPS fluorescência do epicárdio (preto) e no endocárdio (cinzento) mostram AP diferenças morfológicas da repolarização entre as duas camadas da parede do ventrículo. (C) Depois de avaliar tele APD 30, 70 e 90 no endocárdio e epicárdio, os resultados mostraram únicas diferenças significativas ocorreram em APD 30 (8 ± 2,5 ms endocárdio vs 3 ± 0,6 ms epicárdio). Os corações foram estimulado e regulado a 6 Hz e a temperatura ajustada para 37 ° C. Os dados são média ± SEM de 5 corações. * P <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Transmural Ca 2+ Medidas transitórias nos corações intactos. (A) Parâmetros de transientes de Ca 2+ cinética medidos são: o tempo que demora a atingir o máximo, tempo até ao pico (TP); o tempo que leva para ir de 10% a 90% da subida, tempo de subida (RT); o tempo que leva para ir de 10% a 90% da deterioração, tempo de decaimento (DT); e atempo necessário para completar 50% do transiente, metade duração (HD). (B) A fluorescência emitida por Rhod 2 após excitação com um laser show epicárdio verde CW (preto) e endocárdio (cinzento) Ca 2 + transientes com diferenças de relaxamento. c) Ca 2 + transientes do endocárdio teve cinética significativamente mais lento na RT, TP, HD, e DT que os registrados do epicárdio. Os corações foram estimulado e regulado a 6 Hz e a temperatura ajustada para 37 ° C. Os dados são média ± SEM de 5 corações. * P <0,05. Modificado de Mattiazzi et ai. 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Ca 2+ Medidas SR Intra nos corações intactos.(A) A fluorescência emitida a partir do corante Fluo-Mag-4 gotas ao longo do tempo, o que reflecte uma diminuição na concentração de SR intra Ca 2+. (B) A visão expandida da diminuição da Mag-Fluo 4 de fluorescência indicando Ca 2+ exaustão induzida por Ca 2+ liberação do SR. (C) Uma visão expandida da diminuição da amplitude transitória da Mag-Fluo 4 de fluorescência representando Ca 2+ liberação modificada por perfusão corações com cafeína 20 mM. (D) Depois de um tempo de aplicação de cafeína, uma diminuição tanto no nível diastólico de Mag-Fluo-4 e de fluorescência na amplitude de transientes de Ca 2+ [até 92 ± 0,05% (n = 4; P = 0,012) e observa-se 51 ± 0,21% (n = 4; P = 0,003) de valores iniciais, respectivamente],. À medida que mais tempo progride a partir da cafeína, menor é a amplitude da depleção SR. (E) os traços normalizados em bd mostra que a depleção SR não só induzems diminui do sinal de Ca2 +, mas também retarda SR Ca 2+ reabastecimento. Os corações foram estimulado e regulado a 4 Hz e a temperatura ajustada para 37 ° C. Fluorescência de rastreio é Kornyeyev et ai. 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Medidas raciométrica de APs em corações intacto com LED pulsada. (A) O diagrama de tempo, incluindo a integração e de reset do headstage, on-off vezes do LED e um real de gravação é ilustrada. (B) a partir dos traços dos dois canais têm diferentes valores de repouso e o deslocamento é corrigida pelo movimento das alavancas até que cada ponto de acesso é precedido por um valor de repouso. Ganho de cada canal é também Adjusted. Note-se que um grande movimento artefato aparece em ambos os canais entre as duas despolarizações. Depois que o software processa os sinais ratiometrically, o resultado é um AP sem artefatos visíveis (azul). Os corações foram estimulado e regulado a 3 Hz e a temperatura ajustada para 28 ° C. Todos os registros mostrados são uma média de 10 traços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: simultâneas Ca 2 + transientes e Medições AP nos corações intacto com LED pulsada. A contaminação cruzada de sinais de conversação quando gravar tanto Ca 2+ e AP pode ser corrigido em-linha. O corante potenciométrica, di-8-ANEPPS, está animado com 20 mS azuis pulsos LED (a). Os sinais são split, filtrada com bandpass filtros vermelhos e verdes. Esses sinais são detectados por dois fotodiodos de avalanche diferentes indicados como o vermelho (b) e do canal verde (C). É possível observar que ambos os sinais, vermelho e verde, apresentar um artefato movimento visível que aparece como uma deflexão para baixo. Ambos os sinais, vermelho e verde, e, em seguida, são offseted amplificado. Os sinais condicionados são usados para calcular a relação entre eles eo resultado é mostrado na d. É possível observar que na relação entre ambos os sinais (d) os artefatos móveis são cancelados. Painel e ilustra a sequência de impulsos de lógica que controlam um LED emissor de verde utilizado para excitar o indicador de Ca2 + Rhod-2. Sinais fluorescentes obtidos utilizando este procedimento são mostrados na f. Embora o traço em F mostra principalmente um aumento do sinal de fluorescência devido à bindin Ca 2+g a Rhod-2, é também possível observar um desvio negativo no rastreio, devido a um sinal fluorescente detectada a partir de Di-8-ANEPPS quando este corante é animado com luz verde. Este problema pode ser corrigido através da subtracção do sinal potenciométrico mostrado em g. O resultado da subtracção é mostrada no painel h em que um de Ca 2+ sinalizar livre da contaminação de uma AP é obtido. Os corações foram estimulado e regulado a 3 Hz e a temperatura ajustada para 28 ° C. Todos os registros mostrados são uma média de 10 traços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo é centrada em descrever as técnicas de fluorescência de campo locais para avaliar a função dos miócitos cardíacos ex vivo. O estudo destas células em um ambiente acoplado é não só mais fisiológico, mas também é altamente adequada para a avaliação de nível patologias de órgãos. Os eventos celulares subjacentes acoplamento de excitação-contracção (ECC) pode ser avaliado em todo o nível do órgão com o uso de sondas moleculares que monitoram Ca2 + intracelular dinâmica (Rhod 2 citosólica de Ca2 +, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) e actividade eléctrica (di-8-ANEPPS). Aqui, nós apresentamos três técnicas LFFM epifluorescência que tanto excitam e recolher a emissão de indicadores fluorescentes de fibras ópticas. Eles diferem de acordo com a fonte de luz utilizada e do tipo de modulação de luz. O PLFFM usa um laser de impulsos de luz que, CLFFM utiliza luz laser contínuo, enquanto LEDFM utiliza LEDs que também podem ser pulsadas no PLEDFM. Todos essessão apresentados na Figura 1 como um conjunto, mas pode ser construído com apenas um dos três regimes de epifluorescência. Além disso, a luz detectada pode ser processada de diferentes maneiras. Por exemplo, a Figura 2 ilustra duas situações diferentes, em que a fotocorrente podem ser integrados ou directamente convertido para uma tensão por meio de um conversor de corrente para voltagem. Em geral, a abordagem LFFM pode ser utilizado para medir, simultaneamente, múltiplos locais anatómicos, como pode ser visto da Figura 3.
O método aqui apresentado para avaliar propriedades cardíacas no nível do órgão intacto é mais adequada para estudar problemas em que o acoplamento entre as células é crucial para definir o comportamento do tecido. A heterogeneidade intrínseca do coração pode produzir diferentes AP formas de onda 13, 21, 22, com base no tecido específico a partir da qual cells originam. Portanto, estudos de órgãos inteiros oferecem a oportunidade de avaliar a função fisiológica locais da célula em diferentes estruturas anatômicas. Além disso, vimos que os eventos intracelulares como faíscas e ondas têm diferentes cinéticas em células dissociadas do que no órgão intacta 15.
O conjunto de Langendorff-se (Figura 4) é crítico na manutenção do coração numa situação que está mais perto de in vivo. Além disso, ele permite que o retroperfusão de múltiplas drogas e várias sondas moleculares fluorescentes que permitem a medição de diversas variáveis fisiológicas. Alterando as sondas fluorescentes utilizadas exógenos, o aumento do tamanho da fibra óptica, ou a escolha de uma fonte de luz diferente pode alterar drasticamente a aplicação da técnica. Além disso, a unidade de Peltier abaixo da câmara horizontal pode facilitar o estudo de Ca 2+ dinâmica a várias temperaturas. O acréscimo de acessóriospara LFFM tal como um separador de feixe pode aumentar o número de fibras ópticas utilizadas para gravar a partir de diferentes regiões no coração intacto. Esta é uma adaptação muito útil para testar se as diferenças regionais ocorrem em situações patológicas. A Figura 3 mostra o endocárdio e epicárdio a ser avaliado simultaneamente. Além disso, irrigando o coração com diferentes agonistas nos permite compreender como as diferentes regiões através da parede ventricular são regulados. A sinalização eléctrica (Figura 5) e cinética de Ca2 + (Figura 6) pode ser comparado heterogeneidades no epicárdio e endocárdio. Além disso, podem ser utilizados vários corantes com diferentes comprimentos de onda de excitação e filtros de emissão. Por exemplo, usando-Mag de Fluo-4, os níveis de Ca2 + no lúmen da SR pode ser registada (Figura 7). Variando o tamanho da fibra óptica pode também estender a capacidade deste método de gravação, permitindo que o fluorescente a partir de um Larregião ger.
Este documento também mostra que, além de lasers caros, os LEDs podem ser utilizados como uma fonte de luz de excitação na nossa técnica. A Figura 8 mostra que este tipo de fonte de luz barata pode ser utilizada para medir ratiometrically APs. A medição raciométrica mostrado na Figura 8 é vantajosa na produção de uma gravação final sem artefactos experimentais, incluindo as causadas pelo movimento. Finalmente, mesmo o Ca 2+ transitória e AP podem ser opticamente gravado, simultaneamente, por diferentes comprimentos de onda de multiplexação e utilizando corantes com o mesmo espectro de emissão. O processamento de sinais descrito na Figura 9 é crítica na remoção de contaminação interna, produzida pela sobreposição de espectros de emissão dos corantes. Gravação de Ca 2 + transientes e APs, simultaneamente, mas como dois sinais de saída independentes é benéfica em estudar ECC e Ca 2+ induzida por Ca 2+
LFFM é uma técnica com múltiplas aplicações na fisiologia celular de tecidos intactos. No entanto, uma limitação importante é que a fluorescência registada é a média de emissão dos indicadores fluorescentes subjacentes na região local em que a fibra óptica está em contacto com o tecido. Mesmo quando se utiliza duas fibras ópticas, LFFM não fornece uma distribuição espacial subcelular dos sinais medidos. Mapeamento óptico é a melhor técnica para monitoramento de variáveis fisiológicas que se alteram no espaço e no tempo, como a propagação da AP, Ca 2 + transientes e alternans 23, 24, 25. LFFM também não é capaz de fornecer imagens de estruturas, como a microscopia confocal e de outras técnicas de mapeamento óptico. No entanto, o uso de fibra óptica torna prático em recording sinais de fluorescência do endocárdio locais ou outras regiões que são difíceis ou impossíveis de acesso num coração intacto com um microscópio confocal.
A comparação entre as variáveis fisiológicas obtidas a partir de corações intactos e das experiências de miócitos isolados é um desafio. A maior vantagem da utilização de miócitos cardíacos isolados é a oportunidade única para avaliar as propriedades biofísicas das células sob condições de patch clamp. Em contraste, LFFM permite o estudo do fenómeno fisiológico e patológico em um ambiente mais natural. Por exemplo, em corações intactos podemos avaliar as diferenças transmurais 15, dependência da frequência cardíaca do AP e Ca 2+ no fisiológica varia 13 que são inatingíveis em células isoladas. Além disso, pode-se estudar os efeitos de um insulto isquémico na função do coração intacto 9, 10. Todo coração exexperi- também nos permitem avaliar a interação entre outros tipos de células e miócitos 11.
LFFM permite a visualização de sinais celulares ao nível do coração intacto em que as células têm de acoplamento fisiológico. LFFM permite o estudo da actividade intracelular, enquanto as células estão ainda no órgão intacto. Em combinação com corantes fluorescentes e epiluminescence, LFFM pode monitorar duas propriedades cardíacas chave: Ca2 + dinâmica e atividade elétrica.
Finalmente, o método aqui apresentado pode ter várias aplicações no estudo da ECC. É uma ferramenta que revela como sinais supramolecular são afetados em situações patológicas como arritmias 16 e isquemia 9, 15. Esta técnica é uma obrigação para estudar essas patologias, uma vez que só pode ser compreendido no nível do órgão intacto.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Alicia Mattiazzi para a discussão crítica do trabalho apresentado. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 HL-084487) para ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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