Summary
Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.
Abstract
Im Herzen sind molekulare Signalstudien in der Regel in isolierten Myozyten durchgeführt. Jedoch können viele pathologische Situationen wie Ischämie und Arrhythmien nur vollständig an der gesamten Organebene verstanden werden. Hier stellen wir die spektroskopische Technik der lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM), die die Messung von zellulärer Signale im intakten Herzen ermöglicht. Die Technik basiert auf einer Kombination aus einer Langendorff perfundierten Herzen und Lichtleitfasern Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen. LFFM hat verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf Physiologie des Herzens unter normalen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Mehrere können Herz-Variablen mit unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren überwacht werden. Dazu gehören cytosolischen [Ca 2+], intra-Retikulum [Ca 2+] und Membranpotentialen. Die exogenen Fluoreszenzsonden werden angeregt und die emittierte Fluoreszenz mit drei verschiedenen Anordnungen von LFFM Epifluoreszenz-Technik nachgewiesens in diesem Papier. Die zentralen Unterschiede zwischen diesen Techniken sind die Art der Lichtquelle für die Anregung verwendet, und auf dem Weg das Anregungslicht moduliert wird. Der gepulste LFFM (PLFFM) verwendet Laserlichtimpulse, während eine kontinuierliche Welle LFFM (CLFFM) kontinuierliches Laserlicht zur Anregung verwendet. Schließlich Leuchtdioden (LEDs) als eine dritte Lichtquelle verwendet. Diese nicht-kohärente Anordnung gepulst LED-Fluoreszenzmikroskopie (PLEDFM) genannt.
Introduction
Das Herz ist das zentrale Organ des kardiovaskulären Systems. Die Kontraktion des Herzens wird durch eine Erhöhung der intrazellulären initiiert [Ca 2+]. Die Beziehung zwischen der elektrischen Erregbarkeit und Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Freisetzung wurde 1 in enzymatisch dissoziierten Zellen historisch untersucht, 2. Jedoch sind Herzzellen elektrisch, metabolisch und mechanisch gekoppelt 3, 4. Wenn isoliert, sind die Myozyten nicht nur physisch entkoppelt, sondern Myozyten aus verschiedenen Schichten werden während der Dissoziation 5 gemischt. Darüber hinaus , trotz der enormen Vorteile , die aus der Untersuchung von isolierten Zellen unter voltage clamp Bedingungen entstanden sind, 6, 7, 8 die intrinsische Natur des Herzens als elektrischer Syncytium always stellt sich die Frage, wie funktionell verschieden von denen , die in dem Gewebe 3 dissoziierten Zellen.
In diesem Manuskript beschreiben wir die in der Erkenntnis der Herzphysiologie erhalten Fortschritte durch die Verwendung von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM) Techniken im intakten Herzens. LFFM nutzt fluoreszierende Indikatoren mehrere physiologische Variablen wie zytosolischen Ca 2+, intra Retikulum (SR) Ca 2+ und Membranpotential zu messen. Diese Messungen können gleichzeitig und in Verbindung mit ventrikulären Druck 9, 10, Elektrokardiogramme 9, elektrische Aktionspotentiale (APs), Ionenstrom - Aufnahmen und Blitzphotolyse von caged Verbindungen 4, 11 erhalten. Darüber hinaus können diese Messungen in der Nähe von Stimulation des intakten Herzens bei höheren Frequenzen erhalten werdenr physiologischen Raten. Obwohl mehrere Artikel 9, 11, 12, 13, haben 14 von unserer Gruppe veröffentlicht LFFM Techniken, die Vermutung der technischen Komplexität mit dieser Technik verbunden hat ihren massiven Einsatz bei der Untersuchung ex vivo physiologischen Erscheinungen in das Herz und andere Organe verhindert.
Die LFFM Technik (Figur 1) basiert auf Epifluoreszenz - Messungen unter Verwendung eines Mehrmoden - Lichtwellenleiter in Kontakt mit dem Gewebe erhalten wird . Wie bei jedem Kontakt Fluoreszenz-Imaging-Technik hängt die optische Auflösung von dem Durchmesser und der numerischen Apertur (NA) der Faser. Eine höhere NA und kleinere Durchmesser der Faser wird die räumliche Auflösung der Messungen zu erhöhen. NAs und Faserdurchmessern von 0,22 bis 0,66 und von 50 um bis 1 mm bzw. liegen. Imdie NA Rillen wird das Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) durch die Annahme Photonen verbessern aus einem größeren Raumwinkel ankommt. Um als Epifluoreszenz Vorrichtung zu wirken, wird der Lichtstrahl fokussiert in die optische Faser mit einer asphärischen Linse oder einer Epifluoreszenz Ziel wo die NA der Linse und der Faser übereinstimmen. Diese Anpassung maximiert die Energieübertragung zur Anregung und zum Sammeln der Photonen, die von dem Fluorophor emittiert zurück.
Um die exogenen Fluoreszenzindikatoren im Gewebe, verschiedene Lichtquellen und Beleuchtungsarten geladen zu erregen können genutzt werden. Unsere wegweisenden Arbeiten des gepulsten lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie 3, 12 (PLFFM) eingesetzt , um eine Low-Cost - Pikosekunden - Laser (Abbildung 1a, PLFFM) verwendet wird . Diese Art der Lichtquelle hat den großen Vorteil, spannenden einem großen Anteil an Fluorophormoleküle unter dem Bereich Beleuchtung ohne den Farbstoff im wesentlichen Bleichen durchder kurzen Impulsdauern 12. Zusätzlich erlaubt die Verwendung von ultrakurzen Pulsen , die Beurteilung der Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffes 12. Die Fluoreszenzlebensdauer ist eine Eigenschaft , die verwendet werden kann , den Anteil von Farbstoffmolekülen an Ca 2+ gebunden zu quantifizieren. Leider ist das zeitliche Zittern der Impulse und Variationen in der Amplitude von Impuls zu Impuls begrenzen die Anwendung dieser experimentellen Strategie zu Fällen, in denen die Veränderung der Fluoreszenz durch den Liganden produziert an den Farbstoff-Bindungs groß.
Continuous Wave (CW) Laser sind in der Regel als Hauptbeleuchtungsquelle in LFFM (1b, CLFFM) verwendet. Der Laserstrahl kann kontinuierlich das Gewebe beleuchten, oder ferroelektrisch moduliert werden kann. Die ferroelektrische Modulation des Strahls ermöglicht, die Erzeugung von Mikrolichtimpulse. Diese Modulation kann durch externe Hardware gesteuert werden. Dieser Vorgang ist nicht nur dramatisch reduziert ter zeitliche jittering von Lichtpulsen sondern ermöglicht auch Strahlen unterschiedlicher Wellenlängen zu mischen. Das Mischen von Strahlen wird durch Multiplexen von Strahlen von verschiedenen Lasern durchgeführt. Als Folge können mehrere Farbstoffe unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen angeregt werden Messungen einer Vielzahl von physiologischen Variablen durchzuführen, beispielsweise Rhod-2 für cytosolische Ca 2+, MagFluo4 für intra-SR Ca 2+ und Di-8-ANEPPS für Membranpotential.
Obwohl Laser vorhanden verschiedene Vorteile, wie die Lichtquelle in LFFM, andere Arten von Lichtquellen, einschließlich Leuchtdioden (LEDs) verwendet werden. In diesem Fall bestand die Anregungslichtquelle eines InGaN - LED (1c, PLEDFM). In LEDs werden Photonen spontan emittierten wenn Elektronen aus dem Leitungsband mit Löchern in dem Valenzband rekombinieren. Der Unterschied mit Festkörperlaser ist, dass die Emission nicht von anderen Photonen angeregt wird. Dies resultiert in einer nicht-kohärenten Strahl undeine breitere spektrale Emission für LEDs.
Verschiedene Arten von High-Power-LEDs verwendet werden. Für AP - Aufnahmen Di-8-ANEPPS verwenden und für Ca 2+ Transienten aufgezeichnet unter Verwendung von Fluo-4 oder Mag-fluo-4, wir eine LED verwendet , die eine typische Peakemission bei 485 nm (blau) und einer Halbwertsbreite von 20 nm hat (Abbildung 1d). Für Ca 2+ Transienten mit Rhod-2 aufgezeichnet hatte die LED eine typische Spitzenemission bei 540 nm (grün) und eine Halbwertsbreite von 35 nm (Figur 1d). LEDs emittieren in einer Band Wellenlänge und daher Filter benötigen, um ihre spektrale Emission zu verringern. Zusätzlich kann gepulst Licht mit einer Rate von 1,6 kHz mit einer Dauer von 20 us erzeugt. Die LEDs wurden mit einem schnellen Leistungs-MOSFET-Feldeffekttransistor gepulst. Die gleichzeitige Aufnahmen mit verschiedenen Indikatoren können die LEDs von Zeitmultiplex durchgeführt werden. Leider von LEDs emittiert wird, Licht ist schwieriger auf eine Faseroptik zu fokussieren im Vergleich zu einem Laserstrahl. Somit wird der Hauptnachteil usLEDs ing ist, dass ihre Emissionsprofile Winkelverschiebungen haben (± 15 °) von der Hauptachse, und eine Hilfsoptik muss verwendet werden, um es zu korrigieren.
In allen optischen Konfigurationen zuvor beschrieben, wird das Anregungslicht mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels reflektiert wird. Der Strahl wird anschließend von einer asphärischen Linse und ein Mikroskopobjektiv auf ein Multimode-Glasfaser fokussiert, die auf dem Gewebe positioniert ist. Wie in jeder Epifluoreszenz Anordnung dient der dichroitische Spiegel auch die Anregung von dem emittierten Licht zu trennen. Das emittierte Lichtspektrum reist zurück durch einen Sperrfilter jede reflektierte Anregung zu entfernen. Schließlich wird das emittierte Licht mit einem Objektiv auf einen Photodetektor (1) fokussiert.
Die Transduktion von Licht in elektrischen Strom wird durch Silizium-Avalanche-Photodioden ausgeführt. Diese Dioden haben eine schnelle Reaktion und eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht niedrige Lichtdetektion. DasPhotostrom durch die Avalanche - Photodioden erzeugt wird, kann auf zwei Arten amplifiziert werden: a Transimpedanzverstärker einen resistiven Rückkopplungselement (1e) oder durch einen Integrator aufweist , um den Strom in eine Spannung (1f) zu konvertieren. Unter Verwendung des ersten Ansatzes ist die Ausgangsspannung proportional zum Photostrom und den Rückkopplungswiderstand. Ein typisches Beispiel für die resistive Erfassung von Pikosekunden - Laserimpulse in den Figuren 2a, 2b und 2c gezeigt. Panel 2a veranschaulicht den Ausgang des Transimpedanzverstärkers und Platte 2b eine Zeitexpansion des Intervalls mit einem Stern (*) gekennzeichnet . Ein Spitzenverfolgungsalgorithmus wurde implementiert , um die Spitze (rot) und der Basis (grün) für den Fluoreszenzantworten 12 zu ermitteln. Die Messung der Fluoreszenzbasis liefert Informationen sowohl der Dunkelstrom der Lawinenphotodiode und die von Umgebungs lig eingeführt Interferenzenht und elektromagnetische Kopplung. Eine Darstellung von Peaks und Basen ist in Abbildung 2c dargestellt ist . Diese Figur veranschaulicht die Fluoreszenz von dem Farbstoff emittiert (Rhod-2) , gebunden an Ca 2+ während des Herzzyklus eines schlagenden Herzens parakeet.
In dem zweiten Verfahren wird die Ausgangsspannung des Integrators eine Funktion des Stroms und kapazitiver Rückkopplung (Figuren 2d, 2e und 2f). Abbildung 2f zeigt zwei aufeinanderfolgende Integrationszyklen: die erste ohne externe Beleuchtung und die zweite mit der angelegten Lichtimpulse von einem gepulsten LED. Eine detaillierte Beschreibung ist in den Figuren 2g und 2h dargestellt. Dieser Ansatz, wenn auch aufwendiger, bietet eine größere S / N aufgrund der Abwesenheit von thermischem Rauschen im Rückkopplungskondensator. Das Instrument umfasst eine Zeitstufe, die alle Steuer- und Multiplexen des Anregungslichts erzeugt und Befehle, um die Integration und heads reset Perioden. Dies wird üblicherweise mit einer digitalen Signalverarbeitungsschaltung durchgeführt , die auch eine digitale Differentiation des integrierten Ausgangssignals ausführt durch Berechnen eines on-line - Regression der Daten. Im Falle einer Widerstandsrückkopplung unter Verwendung jeder A / D-Erfassungskarte verwendet werden.
Schließlich ist unsere LFFM Technik sehr vielseitig und kann angepasst werden, von mehr als einer Region aufzuzeichnen. Hinzufügen ermöglicht einen Strahlteiler in dem Lichtweg uns das Licht in zwei optische Fasern zu splitten. Jede optische Faser kann dann auf verschiedene Bereiche eines Gewebes angeordnet werden, um unabhängig zu erregen und Aufzeichnungsemission von den exogenen Fluoreszenzsonden. Diese Änderung ermöglicht es uns, wie anatomische regionale Unterschiede physiologischen Variablen beeinflussen zu beurteilen. Wobei eingesetzte 3 zeigt einen Strahlteiler aufgeteilt wit das CW Anregungslicht , so dass zwei optische Fasern verwendet werden , um zu messen transmurale elektrische oder intrazellulärem [Ca 2+] Ebenenh-Moll-Invasivität. Transmuraler Signale kann durch Platzieren einer Faser auf dem Endokard und der andere auf dem Epikard Schicht der Ventrikelwand aufgezeichnet werden. Daher hat die LFFM Technik die Fähigkeit, den zeitlichen Verlauf der zellulären Signale in unterschiedlichen Bereichen zu messen, und kann verwendet werden, um zu testen, ob regionale Veränderungen unter pathologischen Situationen auftreten.
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Protocol
Dieses Protokoll und alle Mäuse Behandlung wurde von der UC Merced Institutional Animal Care und Use Committee (Nr 2008-201) zugelassen. Experimente mit Sittiche wurden im Jahr 1999 nach den allgemeinen Richtlinien für die Nutzung von Tieren festgelegt von der wissenschaftlichen Kommission des venezolanischen Institut für wissenschaftliche Forschung (IVIC) durchgeführt.
1. Langendorff-Set Up Vorbereitung
- Bereiten Tyrode - Lösung die folgenden Konzentrationen an gelöstem Stoff in mM enthält: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 Glucose, 10 HEPES. Der pH-Wert der Tyrode-Lösung auf 7,4 mit NaOH und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter.
- Laden Sie die Tyrode - Lösung in die 60 ml Spritzen und alle Schläuche des horizontalen Langendorff - Set-up 11, 12 in 4 dargestellt ist . Stellen Sie sicher, alle Luftblasen zu entfernen.
- Verbinden Kunststoffschlauch mit einem O 2 -Tank.
- Fügen Sie einen Kunststoff-T-Adapter mit einem 5 "Rohr in die Tyrode-Lösung in der 60-ml-Spritze zu senken.
- Bringen Sie einen Kunststoff - Ausströmer bis zum Ende des 5 "Röhre so O 2 perlt in die Tyrode - Lösung.
- Legen Sie ein nicht resorbierbares chirurgisches Naht um eine Nadel als eine Kanüle eingesetzt. Die Nadel wird mit dem Verteiler gekoppelt ist (siehe 4) , die retro-Perfusion mit verschiedenen Lösungen ermöglicht. Schließlich wird das Herz der Aorta in die Nadel eine Kanüle eingeführt werden.
2. Vorbereitung der Tiere und Herz Dissection
- Wiegen und injizieren Sie die Maus mit Heparin (ex. Maus Gewicht 20 g, injizieren mit 20 Einheiten oder 200 ul) 15 Minuten vor dem durch Genickbruch euthanizing. Anesthetize Sittiche nach to die Nutzung von Tieren Büchern Ihres IACUC Protokoll und dann mit Genickbruch gehen.
HINWEIS: Verwenden Sie 8 Wochen alten Mäusen oder 20 g Sittiche. - Entfernen Sie das Herz aus der Brusthöhle nach Euthanasie. Extrahieren parakeet Herzen in genau der gleichen Weise wie für Mäuse beschrieben.
- Reinigen Sie die Maus Brust mit Ethanol.
- Mit Dissektion Schere, machen einen Einschnitt in den Unterleib und dann zerschnitten, die Seiten in Richtung Hals.
- Ziehen Sie den geschnittenen Gewebes zurück und stecken Sie es nach unten.
- Schneiden Sie die Membran. Seien Sie vorsichtig, wenn die Membran Schneiden zu vermeiden, das Herz schädigen.
- Entfernen der Lungen und des umgebenden Gewebes.
- Verwenden einer Pinzette das Herz ohne zu quetschen zu schöpfen. Schneiden Sie die Aorta so lange wie möglich.
- Transportieren Sie das Herz auf einem kleinen wiegen Boot mit etwa 1 ml Tyrode-Lösung.
- Verwendung eines nicht absorbierbaren chirurgischen Naht, binden die Aorta auf die horizontale Langendorff-Vorrichtung über einNadel. Binden Sie das Herz Aorta mit Hilfe von zwei feinen Pinzette. Beginnen retro-Perfusion durch das Ventil in Reihe mit den 60 ml Spritzen enthaltenden Tyrode-Lösung angeordnete Öffnung.
- Lassen Sie das Herz für 10 min zu stabilisieren. Nutzen Sie diese Zeit Blut zu reinigen und das Fettgewebe rund um das Herz vor den Farbstoff zu laden. Ziehen Sie das Fettgewebe in der Nähe der Basis des Herzens mit einer Pinzette und schneiden kleine Dissektion Schere. Seien Sie sicher, dass dies unter der Sicht eines Binokular zu tun.
3. Cytosolic Ca 2+ Maße: Vorbereiten Dye Rhod-02.00
- Geben Sie 20 & mgr; l der 20% igen Pluronic (ein nichtionisches Tensid) in DMSO auf eine spezielle verpackte Kunststoffröhrchen durch den Farbstoff Herstellers 50 & mgr; g des Farbstoffs enthält.
- Mischen durch Pipettieren auf und ab, Vermeidung von Blasen.
- Übertragen Sie die gemischte DMSO mit dem nicht-ionischen Tensids und der Farbstoff aus der speziellen Kunststoffröhrchen verpackt, in eine klare Glasampulle. 1 ml Tyrode solution der klaren Glasfläschchen.
- Beschallen für 15-20 min in einem Ultraschallbad.
- Perfundieren den Farbstoff Peristaltikpumpen für 30 min bei Raumtemperatur verwendet wird .
- Platzieren Sie den Farbstoff in der Farbstoffkammer.
- Verwenden, um eine mechanische Klammer alle anderen Rohrleitungen mit dem Verteiler verbunden zu komprimieren. Die Klemme wird über dem Verteiler platziert. Dies wird jegliche Rückströmung in den zu den 60 ml Spritzen verbunden Schläuche verhindern.
- Schalten Sie die Perfusion peristaltische Pumpe zu beginnen, um den Farbstoff zirkuliert. Unmittelbar in der Nähe des 3-Wege-Ventil unter der 60-ml-Spritze.
- Positionieren ein kleines Rohr, das an der Saug- peristaltische Pumpe neben dem Herzen verbunden ist, um den Farbstoff zu rezirkulieren, die in das Herz perfundiert wurde.
4. Intra-SR Ca 2+ Maße: Vorbereiten Dye Mag-Fluo4AM
- Vorbereitung Mag-Fluo4AM in der gleichen Weise wie Rhod-02.00. Siehe Abschnitt 3 für schrittweise Anweisungen.
- after den Farbstoff Laden, öffnen Sie das Ventil in Serie liegt mit den 60 ml Spritzen enthält Tyrode-Lösung Retro-Perfusion zu beginnen. Achten Sie darauf, die Klammer über dem Verteiler zu entfernen.
- In Tyrode-Lösung in die horizontale Kammer und erwärmen bis zu 37 ° C.
- Retro-perfuse mit Tyrode-Lösung für 45 min die cytosolische Farbstoff zu entfernen.
5. Membranpotentialmessungen: Vorbereitung Dye Di-8-ANEPPS
- 5 ml 99% Ethanol zu dem Farbstoff Fläschchen, die 5 mg des Farbstoffes enthält.
- Aliquot 10 ul in 500 Einzel 1 ml Plastikfläschchen, einen Repeater-Pipette.
- Desiccate in einer Geschwindigkeit Vakuum und bei -20 ° C.
- In 20 & mgr; l von 20% Pluronic in DMSO auf eine Plastikflasche mit 10 ug des desiccated Farbstoff.
- Mischen durch Pipettieren auf und ab, Vermeidung von Blasen.
- Übertragen Sie die Mischung enthaltende DMSO mit Pluronic und Farbstoff aus der Kunststoffröhrchen mit einem Meßzylinder (10 mL). Hinzufügen Tyrode-Lösung auf einen endgültigen volumen von 5 mL.
- Beschallen für 20-25 min in einem Ultraschallbad.
- Perfundieren in das Herz für 30 min unter Verwendung von peristaltischen Pumpen. Siehe schrittweise Anweisungen in Abschnitt 3.5.
6. Aufnahme Epikardiale Signale
- das Herz mit Tyrode-Lösung Nachdem der Farbstoffbeladung, retro-perfuse durch die Klammer über dem Verteiler entfernen. Öffnen Sie das Ventil in Serie liegt mit der 60 ml Spritze mit Tyrode-Lösung. Retro-perfuse Tyrode-Lösung für 10 Minuten das Herz zu stabilisieren.
- Füllen Sie die horizontale Kammer mit Tyrode-Lösung und schalten Sie das Gerät peltier die Badtemperatur auf 37 ° C zu bringen.
- Positionieren Sie die Lichtwellenleiter auf der Oberfläche des Herzens.
- Legen Sie die Faseroptik in einem 2-ml-Pipette und befestigen Sie dann die Pipette in einem Mikromanipulator.
- Verwenden der Mikromanipulator leicht die LWL gegen die Oberfläche des LV zu drücken.
- Tempo Äußerlich unterscheidet sich der heart mit einem durch einen Wellengenerator gesteuert Stimulator.
- Programmieren der Wellengenerator ein Rechteckimpuls mit einer Breite von 1 ms bereitzustellen.
- Stellen Sie den Stimulator werden extern synchronisiert und verbinden Sie den externen Eingang zu dem Wellengenerator.
- Zu jedem Ausgang des Stimulators, schließen Sie einen Draht mit einer Akupunktur-Nadel am Ende verlötet.
- Zeigen beide Akupunkturnadeln in der Spitze des Herzens etwa 3 mm voneinander entfernt.
- Erst nachdem die Nadeln in das Gewebe platziert sind, schalten Sie den Ausgang des Stimulators einen elektrischen Schlag zu verhindern.
- In der Erfassungssoftware Erfassungsfrequenz bis 10 kHz eingestellt werden.
7. Aufnahme Endocardial Signale
- Siehe 6.1 und 6.2 zu Schritt das Herz nach dem Laden der Farbstoff zu stabilisieren.
- Mit einem scharfen 23Ga Punkt über die Größe der Faseroptik, machen ein kleines Loch in der Oberfläche des Herzens in der LV in der Nähe des Septum. <li> Legen Sie eine intravitreale Chirurgie Sclerotomie Adapter bei der Positionierung des ersten faseroptischen in das Endokard mit einem Mikromanipulator zu unterstützen.
- Tempo Äußerlich das Herz. Siehe 6.4 zu treten.
- In Erfassungs-Software, Erfassung Frequenz auf 10 kHz einzustellen.
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Representative Results
AP und Ca 2+ Transienten in Endokard und Epikard
Um Signale über die Ventrikelwand zu vergleichen, eine Faseroptik in das Endokard und das andere in das Epikard angeordnet. Vergleichen der Morphologie eines AP vom Endokard mit einer aus dem Epikard aufgezeichnet ist der beste Weg, um die transmurale Funktion zu beurteilen. Die ventrikuläre Wand ist sehr heterogen, und somit sind auch die Morphologie der APs sehr unterschiedlich in diesen zwei Regionen. Es ist bekannt , dass das Endokard weniger hat ich als das Epikard 17, 18, 19. Je weniger ich macht die Repolarisation der Phase 1 langsamer in dem Endokard 18, 20. Figur 5b shows eine typische optische Aufzeichnung der AP vom Endokard und Epikard. Zur Durchführung wurden diese Aufnahmen, Mäuse Herzen geladen mit den potentiometrischen Farbstoff Di-8-ANEPPS und Fluoreszenz wurde mit der CLFFM Technik gemessen. Die Morphologie des optisch aufgezeichnet AP, insbesondere in der Phase 1 zeigt eine langsamere Zeitverlauf für das Endokard (Aktionspotentialdauer (APD) 30 8,01 ms ± 2,5) im Vergleich zum Epikard (3,4 ms ± 0,59) (5B). Im Allgemeinen kann die APD als die Zeit beschrieben werden , die AP nimmt einen bestimmten Prozentsatz zu repolarisieren einschließlich 30, 70 oder 90 (Figur 5a). Diese Spuren wurden normalisiert und verschoben Überlappungsphase haben 0. Wenn die APDs Vergleichen (5c), sehen wir , dass das Endokard und Epikard während der Phase 1 signifikant unterscheiden Obwohl diese APs Fluoreszenzsignale sind, können sie auf einen spezifischen kalibriert werden Membranpotential, indem Sie gleichzeitig die AP mit einem Messscharfe Mikroelektrode 13 mit 3 M KCl gefüllt.
Zusätzlich können mögliche exogene fluoreszierende Indikatoren Membran verwendet werden intrazellulär zu überwachen [Ca 2+]. Typischerweise verwenden wir Rhod-2AM intrazelluläre Ca 2+ Transienten in dem Cytosol zu bleiben wegen seiner hohen Dynamikbereich und ihre Fähigkeit zu messen , selbst bei physiologischen Temperaturen. 6b zeigt eine typische Aufzeichnung der intrazellulären Ca 2+ Transienten im Endokard und Epikard Schicht. Diese Ergebnisse wurden 15 teilweise veröffentlicht. Um die regionalen Unterschiede in der intrazellulären [Ca 2+] Ebenen zu vergleichen, wurden die Kinetik der Ca 2+ Transienten beurteilt (Abbildung 6a). Insgesamt zeigt die Analyse der Ca 2+ transiente Kinetik (Abbildung 6c) , dass die Ca 2+ Transienten aus dem Endokard signifi hattelich langsamer Kinetik als die aus dem Epikard aufgezeichnet.
Ca 2+ Dynamik in den SR - Lumen
Im Herzen, intrazellulären den Aufstieg und Fall von [Ca 2+] Ebenen sind von entscheidender Bedeutung bei der Definition von vielen physiologischen Variablen , einschließlich Druck, Kontraktilität und Aktionspotentialdauer (APD). Im vorigen Abschnitt beschrieben unsere Fähigkeit , die cytosolische Ca 2+ Transienten zu messen. Die Ca 2+ vom SR freigegeben ist für den Anstieg der intrazellulären Ca 2+ cytosolischen weitgehend verantwortlich. Somit für jeden Anstieg der intrazellulären Ca 2+ ist ein Ca 2+ Abbau in der SR. Cytosolischen Ca 2+ Transienten sind jedoch nicht allein aufgrund SR Ca 2+ Release, aber auch Ca 2+ in die Zelle durch die Membran Plasma kommen. Unser Labor16 konnte das SR Ca 2+ -Gehalt durch die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs, Mag-fluo-04.00 auszuwerten. Obwohl dieser Farbstoff in der myoplasm und dem SR entes können die Myozyten die cytosolische Fraktion extrudieren geführt. Dieser Farbstoff Extrusion kann einfach gefördert werden, indem die Temperatur auf 37 ° C erhöht. Bei dieser Temperatur wird die cytosolische Farbstoff durch eine ATP-bindende Kassette, wie Membranprotein entfernt. Glücklicherweise ist dieses Protein in der SR-Membran nicht vorhanden. Daher wird , nachdem die Temperatur auf 37 ° C steigt, die Fluoreszenz des PLFFM Technik aufgezeichnet unter Verwendung ist vor allem eine Folge der Ca 2+ in der SR an den Farbstoff binden. Um die Spezifität der Organell Messung zu testen, wurde ein Koffein Puls Ca 2+ Freisetzung durch RyR zu stimulieren angewendet. Es ist möglich , zu beobachten , daß das Signal tatsächlich ein Ergebnis der SR Verarmungs (Abbildung 7). Das Koffein induzierte SR Ca 2+ Freisetzung (7aSowohl, was eine Abnahme des diastolischen Niveau von Mag-Fluo-4 Fluoreszenz erzeugen) (92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012)) und eine Abnahme der Amplitude von Ca 2+ Transienten (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Intra SR Spuren vor und nach dem Coffein Stimulus aufgezeichnet werden nach unten in 7b-7d dargestellt. Im Laufe der Zeit aus dem Koffein Stimulus fortschreitet, Amplitude des SR Verarmungs kleiner ist. 7E zeigt , daß SR Verarmungs nicht nur eine Abnahme der Amplitude des Signals Ca 2+ induziert , sondern auch verlangsamt die SR Ca 2+ -Freisetzung Prozesses. Die Fluoreszenz Spuren in 7a wurde zuvor 15 veröffentlicht.
Pulsierende LED: Aktionspotentiale
In 5 haben wir gezeigt , dass Di-8-ANEPPS Änderungen mitteilenin der Potential Membran, wenn es bei 532 nm angeregt wird. Unter dieser Anregungszustand, gibt es eine Abnahme der emittierten Fluoreszenz bei Wellenlängen größer als 590 nm. Interessanterweise, wenn dieser potentiometrischen Farbstoff angeregt nahe seiner maximalen Anregungswellenlänge (~ 476 nm), die Fluoreszenzemission des Farbstoffs zu niedrigeren Wellenlängen verschiebt, wenn die Membran depolarisiert. Somit ist diese spektrale Verschiebung erlaubt es uns, die emittierte Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Wellenlängen zu erfassen. Diese spektralen Eigenschaften von Di-8-ANEPPS ermöglicht die Rationierung der emittierten Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen, eine Eigenschaft, die in der Regel von großem Wert, da der letzte berechnete Aufzeichnung unabhängig von der Farbstoffkonzentration in der Membran sein. Um den vollen Nutzen aus der Di-8-ANEPPS Spektralverschiebung zu nehmen, haben wir gepulste LEDs als Lichtquelle. Wir verwendeten gepulsten blaues Licht das Fluorophor zu erregen. Die Anregung erfolgte bei 485 nm, in der Nähe der Spitzenabsorptionswellenlänge von Di-8-A durchgeführt,NEPPS (~ 476 nm). Akquisition in zwei verschiedenen Emissionsspektroskopie Bänder ermöglicht Verhältnisbildung und die Möglichkeit, S / N und lehnen Gleichtaktrauschen, wie Umgebungslicht und Bewegungsartefakten in Vertrags Herzen, wo die mechanische Entkoppler blebbistatin nicht verwendet wurde, zu erhöhen. Diese Situation ist sehr wichtig für die experimentellen Bedingungen , bei denen sowohl die mechanische Aktivität des Herzens und die Kinetik der Ca 2+ Transienten müssen gleichzeitig gemessen werden.
Das Zeitdiagramm des PLEDFM ist in 8a dargestellt. Das Diagramm enthält die Steuerlogik für die Integration und Rücksetzen der Photodetektionsheads, der Ein-Aus-Zeitsteuerung der LED und dem Analog-Digital-Wandlung. Während des Zeitverlaufs eines AP, die Fluoreszenz im grünen Wellenlängenband detektiert zeigt eine Zunahme der Intensität, während die Fluoreszenz im roten Bande detektiert abnimmt. 8b zeigtdass das Änderungssignal der Fluoreszenz durch die Membrandepolarisation erzeugten bewegt sich in verschiedene Richtungen. Jedoch wird das Bewegungsartefakt durch die Herzkontraktion erzeugt immer in der gleichen Richtung ausgerichtet, unabhängig von der Emissionswellenlänge. Wie zuvor erläutert, muss Software konditioniert werden Daten beider Kanäle (grün und rot), bevor das Verhältnis zu berechnen. Die Konditionierung beinhaltet Offset und Korrekturen zu gewinnen. Die Auswahl von Offset- und Verstärkungsstufe Korrekturen ist nicht automatisch. Der Benutzer der Software hat die Variablen auszuwählen, die Spuren vor dem Verhältnis zu konditionieren. Das resultierende Verhältnis in Platte 8b (Abbildung 8) zeigt , dass das Artefakt durch die myokardiale Bewegung eingeführt wurde abgebrochen.
Die relative Änderung der Di-8-ANEPPS Fluoreszenz während eines AP ist in der Regel sehr klein (~ 8% pro 100 mV). Dieses di-8-ANEPPS Fluoreszenzänderung viel kleiner ist als die von der Bindin Ca 2+ erzeugtg zu Rhod-2 (<200%). Somit wird, um das Signal-Rausch-Verhältnis von Di-8-ANEPPS, mehrere Aufnahmen zu erhöhen gemittelt werden.
Pulsierende LED: Die gleichzeitige Aufnahmen von Ca 2+ und Membranpotential
Das letzte Ziel dieses experimentelle Ansatz besteht in der simultanen Aufnahmen von Ca 2+ Transienten und APs durchzuführen. Gleichzeitige Aufnahme von mehreren physiologischen Signalen erfordern Lösung technischer, um verschiedene Aspekte des Systems im Zusammenhang mit Schwierigkeiten einschließlich: Ankoppeln der Lichtquelle mit der optischen Faser, das Absorptionsspektrum des Farbstoffes mit der Emission der LEDs übereinstimmt, die Gestaltung der analogen und digitalen elektronischen Schaltung erzeugen das Timing und die Akquisition sowie die Entwicklung von schnellen Software zu analysieren, Daten on-line.
in our Studie, die Auswahl von Farbstoffen hing von ihren spektralen Eigenschaften. Flourophores verwendet diverse Signale zu messen, müssen in verschiedenen Spektralbereichen absorbieren. Diese Bedingung ist wichtig, zwischen den Signalquellen zu unterscheiden. Jedes Mal, wenn eine LED mit einer anderen Wellenlänge wird verwendet, um das Gewebe zu erregen, die Fluoreszenz detektiert entspricht dem Signal mit dem Farbstoff zusammen, dass in dieser Wellenlänge absorbiert. Auf diese Weise kommen die Fluoreszenzemission von verschiedenen Farbstoffen, aber in dem gleichen Wellenlängenband kann durch die Zeit, zu unterscheiden, bei der ein jeder erregt wird.
Dennoch kann das Übersprechen zwischen Farbstoffspektren können nicht vollständig vermieden. Dies liegt daran, die spektralen Absorptionseigenschaften der Farbstoffe sie Licht mit Wellenlängen Absorption weit von ihrem Höchststand machen absorbieren. In unseren Experimenten wurde ein Übersprechen in den beiden Wegen hergestellt: (1) Rhod-2 durch den blauen LED angeregt wird, ein Ca 2+ -Signal an den roten channe Zugabel AP Spur, und (2) Di-8-ANEPPS durch die grüne LED angeregt wird, die auf dem Ca 2+ transiente Signal (9f) erscheint. Dieses Übersprechen kann on-line korrigiert werden, wie in 9 veranschaulicht ist . Das Verfahren funktioniert, weil das eindringende Signal ein kleiner Prozentsatz des Signals, das gemessen werden muss. Schließlich Verwendung dieser Art von algebraischen Verarbeitung der fluorecence aus den zulässigen Farbstoffe uns AP (9d) bilden , Ca 2+ Transienten (Abbildung 9H) zu trennen. Eine detaillierte Übersicht dieser Verarbeitung ist in der Figur Legende beschrieben. Es ist wichtig zu bemerken , dass alle LED - Pulsed - Experimente eine 28 ° C durchgeführt wurden.
Abbildung 1: Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM). Die LFFM besteht aus einem Epifluoreszenz-Anordnungeine optische Multimode-Faser verwendet, die mit dem Gewebe in Kontakt ist, um die Fluoreszenz von exogenen Farbstoffen perfundiert in das Herz emittiert aufzuzeichnen. Die LFFM Set-up kann drei verschiedene Lichtquellen , einschließlich (a) PLFFM verwenden, in dem Anregungslicht von einem gepulsten pico Nd-Yag Laser versehen ist; (B) CLFFM, wo Dauerstrichlaser verwendet werden , und Lichtimpulse werden von einem ferroelektrischen Modulator ermöglicht das Multiplexen von Lasern mit unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt werden ; und (c) PLEDFM, wo LEDs breiteren Emissionsspektren mit Spitzenemissionen von (d) 485 nm und 540 nm für blaue und grüne LEDs mit jeweils elektronisch gepulst. Wenn Laserquellen verwendet werden, wird der Strahl durch einen Strahlexpander defokussiert. Schließlich konzentrieren dichroitische Spiegel und Objektiv-Linsen den Strahl auf das distale Ende der Faseroptik, der geringfügig gegen das Gewebe gedrückt wird. Das emittierte Licht wandert zurück durch die gleiche Faser-Optik, dichroitische Spiegel, emission Filter und wird auf eine Avalanche-Fotodiode fokussiert, wo Photonen in einen elektrischen Strom umgewandelt werden. Der Strom kann durch zwei Verfahren (e) Transimpedanzverstärker verstärkt werden, wobei die sich ergebende Ausgangsspannung an den Photostrom proportional ist und dem Rückkopplungswiderstand; (F) Integrators, wobei die Ausgangsspannung eine Funktion des Stroms und kapazitiver Rückkopplung ist. Schließlich wird das Signal durch einen A / D-Wandler und betrachtet auf einem Computer erfasst. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: resistive und kapazitive Conversion. (A) Ein typisches Beispiel für die resistive Erfassung von Pikosekunden - Laserimpulse gezeigt. Der Stern (b)zeigt eine erweiterte Zeitintervall, in dem ein Spitzenverfolgungsalgorithmus implementiert wurde der Peak (rot) und der Basis (grün) zu erfassen. (C) Eine Darstellung von Spuren von Spitzen und Basen Aufnahmen berechnet für Rhod-2 Fluoreszenz - Antworten in einer Tracht Prügel Sittich Herz extern bei 7 Hz und Badetemperatur auf 37 ° C Tempo gezeigt. d bis h) Die durch einen Integrator umgewandelt Photo eine kapazitive Rückkopplung verwendet wird . Typische Aufzeichnungen von intakten Maus Herz Ca 2+ Transienten werden in zwei unterschiedlichen Zeitskalen (d und e) gezeigt. (F) Die Integration von zwei aufeinanderfolgenden Zyklen mit und ohne LED - Beleuchtung angezeigt. Das Integral des Signals steigt linear als der Photostrom der Rückkopplungskondensator auflädt. Die Steigung des zeitabhängigen Integral (tan (Ɵ)) proportional zur Anzahl der Photonen, die Lawine Übergang neben der Elektron-Loch-Rekombination durch die p induzierten aufprallhononic Aktivität, wenn die Lawinendiode erkennt keine Photonen. Die digitalen Signale steuern heads Integration und Rücksetzperioden sind in Tafel g gezeigt. Die Signale erfasst während des Nichtbeleuchtungs (DC) und LED - Beleuchtungsperiode (F) in das Panel h gezeigt. Die Subtraktion von F und DC bietet die eigentliche Messung von fluoreszenz Ca erfasst extern 2+ Transienten von Mäusen Herzen bei 9 Hz bei 37 ° C (h) und ab ging. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: LFFM für Epikard und Endokard Messungen. Die CLFFM Set-up wurde verwendet, um die Fluoreszenz von exogenen Fluoreszenzfarbstoffe in der Epikard ein emittierter zu messend Endokardiums Schichten. Die Hinzufügung eines Strahlteilers erleichtert die Aufnahme von verschiedenen physiologischen Variablen in das Epikard und Endokard. Zwei Faseroptik wurden mit ihren individuellen headstages verwendet, um aus dem Epikard und Endokard zu erkennen. Eine kleine kreisförmige Einschnitt wurde in den Ventrikel und eine Faseroptik wurde durch Gewinde aufzuzeichnen vom Endokard hergestellt. Dieses Set-up verwendet, um einen Strom-zu-Spannungs-Wandler mit einem Widerstandsrückkopplungs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Horizontale Kammer mit Temperaturregelung. Ein Diagramm, das die Langendorff-Set-up zeigt, in dem intakten Herzen gehalten werden, funktional für Stunden. Das Herz wird mit einer Nadel verbunden, durch welche alle Lösungen und FarbstoffeRetro-perfundierten in das Herz über die Koronararterien der Aorta abzweigen sind. Die Kammer ist über einer Peltiereinheit positioniert, um die Temperatur des Bades zu erhalten, die mit einem Spannungsmesser verbunden durch einen Temperatursensor gelesen wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Transmurale Aktionspotentialmessungen in Intact Herzen. (A) Aktionspotentialdauer (APD) wird als die Zeit beurteilt sie 30% in Anspruch nimmt, 70% oder 90% der AP Repolarisation. (B) Di-8-ANEPPS Fluoreszenz aus dem Epikard (schwarz) und Endokard (grau) zeigen AP morphologische Unterschiede in Repolarisation zwischen den beiden Schichten der Ventrikelwand. (C) Nach t Beurteilunger 30 APD, 70 und 90 in das Endokard und Epikard zeigten die Ergebnisse nur signifikante Unterschiede traten bei APD 30 (8 ± 2,5 ms Endokard vs 3 ± 0,6 ms Epikard). Die Herzen wurden bei 6 Hz Tempo und Temperatur auf 37 ° C eingestellt. Daten sind Mittelwerte ± SEM von 5 Herzen. * P <0,05. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Transmurale Ca 2+ Transienten Messungen in Intact Herzen. (A) Parameter von Ca 2+ transiente Kinetik gemessen werden: die Zeit, die maximal zu erreichen dauert, Zeit zu Peak (TP); die Zeit, die von 10% bis 90% des Anstiegs zu gehen nimmt, Anstiegszeit (RT); die Zeit, die von 10% bis 90% des Zerfalls, Abklingzeit (DT) zu gehen, nimmt; und dasZeit, die 50% der transient, Halb Dauer (HD) zu vervollständigen. (B) Fluoreszenzemission von Rhod 2 nach Anregung mit einem grünen CW - Laser - Show Epikard (schwarz) und Endokard (grau) Ca 2+ Transienten mit Unterschieden in der Entspannung. c) Ca 2+ Transienten vom Endokard hatten signifikant langsamer Kinetik in RT, TP, HD, DT und als die aus dem Epikard aufgezeichnet. Die Herzen wurden bei 6 Hz Tempo und Temperatur auf 37 ° C eingestellt. Daten sind Mittelwerte ± SEM von 5 Herzen. * P <0,05. Geändert von Mattiazzi et al. 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Intra SR Ca 2+ Messungen in Intact Herzen.(A) Die emittierte Fluoreszenz von der Mag-Fluo-4 - Farbstoff fällt im Laufe der Zeit eine Abnahme der intra SR Ca 2+ -Konzentration widerspiegelt. (B) Die erweiterte Ansicht der Abnahme der Mag-Fluo 4 Fluoreszenz , die Ca 2+ Depletion induziert durch Ca 2+ Freisetzung aus dem SR. (C) eine vergrößerte Ansicht der Abnahme der transienten Amplitude von Mag-Fluo 4 Fluoreszenz darstellt , Ca 2+ Freisetzung modifiziert von Herzen mit 20 mM Koffein Perfusion. (D) Nach einer langen Anwendung von Koffein, einer Abnahme sowohl der diastolischen Niveau Mag-fluo-4 Fluoreszenz- und in der Amplitude von Ca 2+ -Transienten [bis auf 92 ± 0,05% (n = 4, P = 0,012) , und 51 ± 0,21% (n = 4, P = 0,003) von Anfangswerten jeweils], beobachtet. Da mehr Zeit von dem Coffein fortschreitet, Verarmungs desto kleiner ist die Amplitude des SR. (E) Normalized Spuren in bd zeigt , dass SR Erschöpfung nicht nur induzierens verringert sich der Signal Ca 2+ , sondern auch verlangsamt SR Ca 2+ Nachschub. Die Herzen wurden bei 4 Hz Tempo und Temperatur auf 37 ° C eingestellt. Fluoreszenz Spur von Kornyeyev et al. 16. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Ratiometrisch Messungen von APs in Intact Herzen mit gepulster LED. (A) Das Zeitdiagramm einschließlich der Integration und Rücksetzen des heads, Ein-Aus - Zeiten der LED und einer tatsächlichen Aufzeichnung veranschaulicht. (B) Spuren von den beiden Kanälen unterschiedliche Ruhewerte haben und die korrigiert wird ausgeglichen durch die Hebel bewegen , bis jeder AP von einem Ruhewert vorausgeht. Verstärkung jedes Kanals ist auch adjusted. Beachten Sie, dass eine sehr große Bewegungsartefakt zwischen den beiden Entladungswellen auf beiden Kanälen erscheint. Nachdem die Software die Signale ratiometrisch verarbeitet, ist das Ergebnis ein AP ohne merkliche Artefakte (blau). Die Herzen wurden bei 3 Hz stimuliert und die Temperatur auf 28 ° C eingestellt. Alle gezeigten Aufzeichnungen sind ein Durchschnitt von 10 Spuren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9: Gleichzeitige Ca 2+ Transienten und AP - Messungen in Intact Herzen mit gepulster LED. Das Übersprechen Kontamination von Signalen bei der Aufnahme sowohl Ca 2+ und AP kann online korrigiert werden. Die potentiometrischen Farbstoff, Di-8-ANEPPS, ist begeistert , mit 20 & mgr; s blaue LED - Impulse (a). Die Signale sind split, gefiltert mit Band roten und grünen Filter. Diese Signale werden durch zwei verschiedene Lawinenphotodioden angegeben als rot (b) und grünen Kanal (c) nachgewiesen. Es ist möglich, zu beobachten, dass beide Signale, Rot und Grün, eine merkliche Bewegung Artefakt darstellen, das als eine Abwärtsbiegung erscheint. Beide Signale, rot und grün, sind offseted und dann verstärkt. Die konditionierten Signale werden verwendet , um das Verhältnis zwischen ihnen zu berechnen und das Ergebnis wird in d gezeigt. Es ist möglich , dass in dem Verhältnis zwischen beiden Signalen (d) die Bewegungsartefakte abgebrochen werden zu beobachten. Panel - e zeigt die Folge von logischen Impulsen , die eine grün - emittierenden LED - Steuerung verwendet , um die Ca 2+ Indikator Rhod-2 zu erregen. Die Fluoreszenzsignale dieses Verfahren unter Verwendung sind in f gezeigt. Obwohl die Spur in f zeigt hauptsächlich eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals aufgrund der Ca 2+ Binding zu Rhod-2, es ist auch möglich, eine negative Ablenkung in der Spur aufgrund eines fluoreszenz detektierte Signal von Di-8-ANEPPS, wenn dieser Farbstoff angeregt mit grünem Licht zu beobachten. Dieses Problem kann durch Subtrahieren des potentiometrischen Signal in g gezeigt korrigiert werden. Das Ergebnis der Subtraktion wird in das Panel h wo ein Ca 2+ gezeigten Signal frei von einer AP Verunreinigung erhalten wird. Die Herzen wurden bei 3 Hz stimuliert und die Temperatur auf 28 ° C eingestellt. Alle gezeigten Aufzeichnungen sind ein Durchschnitt von 10 Spuren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Papier wird bei der Beschreibung der lokalen Feldfluoreszenztechniken zentriert die Funktion von Herzmuskelzellen zu bewerten ex vivo. Die Untersuchung dieser Zellen in einer gekoppelten Umgebung ist nicht nur physiologisch, sondern ist auch sehr geeignet für die Beurteilung der Organebene Pathologien. Die zelluläre Ereignisse elektromechanischen Kopplung (ECC) zugrunde liegen kann mit dem Einsatz von molekularen Sonden auf der ganzen Organebene ausgewertet werden , die 2+ Dynamik intrazellulärer Ca überwachen (Rhod 2 cytosolischen Ca 2+, Mag-Fluo4 SR Ca 2+) und elektrische Aktivität (di-8-ANEPPS). Hier haben wir drei LFFM Epifluoreszenz- Techniken vorgestellt, die sowohl anregen und die Emission von Fluoreszenzindikatoren unter Verwendung von optischen Fasern zu sammeln. Sie unterscheiden sich von der Lichtquelle auf Basis verwendet und die Art der Lichtmodulation. Die PLFFM verwendet einen Laser, der Lichtpulse, CLFFM kontinuierliche Laserlicht verwendet, während LEDFM verwendet LEDs, die auch im PLEDFM gepulst werden kann. Alle von denensind in Figur 1 als ein Satz dargestellt, kann aber mit nur einem der drei Epifluoreszenz - Anordnungen konstruiert werden. Darüber hinaus kann das detektierte Licht in unterschiedlicher Weise verarbeitet werden. Zum Beispiel 2 veranschaulicht zwei verschiedene Situationen , in denen der Photostrom integriert oder direkt umgewandelt in eine Spannung durch eine Strom-zu-Spannungs - Wandler sein kann. Im Allgemeinen kann die LFFM Ansatz verwendet werden , um gleichzeitig mehrere anatomische Stellen zu messen, wie aus 3 ersichtlich.
Das hier vorgestellte Verfahren für die Herz Eigenschaften bei der intakten Organebene Beurteilung ist angemessenere Probleme zu untersuchen, bei denen die Kopplung zwischen Zellen zu definieren, das Verhalten des Gewebes kritisch. Die intrinsische Heterogenität des Herzens können verschiedene AP erzeugen Wellenformen 13, 21, 22 basierend auf dem spezifischen Gewebe , aus dem cells stammen. Deshalb bieten ganze Organ Studien die Möglichkeit, die lokale physiologische Funktion der Zelle in verschiedenen anatomischen Strukturen zu beurteilen. Darüber hinaus haben wir gesehen , dass die intrazelluläre Ereignisse wie Funken und Wellen haben unterschiedliche Kinetik in dissoziierten Zellen als im intakten Organ 15.
Die Langendorff - Set-up (Abbildung 4) ist von entscheidender Bedeutung , das Herz in einer Situation , bei der Erhaltung , die näher an in vivo ist. Darüber hinaus ermöglicht es die Retroperfusion mehrerer Medikamente und verschiedene Fluoreszenzmolekularsonden, die die Messung von mehreren physiologischen Variablen ermöglichen. Ändern der exogenen Fluoreszenzsonden verwendet, um die Größe des Faseroptik-Erhöhung oder eine andere Lichtquelle der Wahl kann die Anwendung der Technik dramatisch verändern. Zusätzlich kann die Peltiereinheit unterhalb der horizontalen Kammer , die die Untersuchung von Ca 2+ erleichtern Dynamik bei verschiedenen Temperaturen. Hinzufügen von Zubehörzu LFFM wie ein Strahlteiler verwendet, um die Anzahl der Faseroptik erhöhen kann aus verschiedenen Regionen der intakten Herzens aufzuzeichnen. Dies ist eine sehr nützliche Anpassung zu testen, ob die regionalen Unterschiede in pathologischen Szenarien auftreten. Figur 3 zeigt das Endokard und Epikard gleichzeitig geprüft. Darüber hinaus ermöglicht eine Perfusion der Herzen mit verschiedenen Agonisten uns zu verstehen, wie die verschiedenen Regionen der Ventrikelwand reguliert werden. Die elektrische Anzeige (5) und Ca 2+ kinetischer (Abbildung 6) Heterogenitäten kann am Epikard und Endokard verglichen werden. Außerdem können mehrere Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen und Emissionsfiltern verwendet werden. Beispielsweise durch Verwendung von Mag-Fluo-4, Ca 2+ -Spiegel in das Lumen des SR kann (Abbildung 7) aufgezeichnet werden. die Größe des Faseroptik-Variation kann auch, indem man die Fluoreszenz Aufnahme von einem lar die Fähigkeit dieses Verfahrens erstreckenger Region.
Diese Arbeit zeigt auch, dass abgesehen von teuren Lasern, LEDs können als Anregungslichtquelle in unserer Technik verwendet werden. 8 zeigt , dass diese preisgünstige Art der Lichtquelle verwendet werden kann , um ratiometrisch APs messen. Die ratiometrische Messung in Figur 8 gezeigt ist vorteilhaft in eine endgültige Aufzeichnung ohne experimentelle Artefakte einschließlich Herstellung durch die Bewegung verursacht wird . Schließlich, auch das Ca 2+ Transienten und AP optisch aufgezeichnet werden, gleichzeitig durch Multiplexen verschiedener Wellenlängen und Verwendung von Farbstoffen mit dem gleichen Emissionsspektren. Die Verarbeitung der Signale in Figur 9 skizzierte ist kritisch bei der Beseitigung von durch die Überlappung der Emissionsspektren der Farbstoffe erzeugt interne Verschmutzung. Aufnahme Ca 2+ Transienten und APs, gleichzeitig aber als zwei unabhängige Ausgangssignale ist von Vorteil bei der Untersuchung ECC und Ca 2+ -induzierte Ca 2+
LFFM ist eine Technik mit mehreren Anwendungen in der Zellphysiologie von intaktem Gewebe. Jedoch ist eine wichtige Einschränkung, dass das aufgezeichnete Fluoreszenz ein Mittelwert der Emission von den darunterliegenden Fluoreszenzindikatoren in der lokalen Region ist, wo die optische Faser in Kontakt mit dem Gewebe ist. Selbst wenn zwei Lichtwellenleiter verwenden, wird LFFM keine subzelluläre räumlichen Verteilung der gemessenen Signale bereitzustellen. Optische Abbildung ist eine bessere Technik zum Überwachen physiologischer Variablen , die in Raum und Zeit , wie die Ausbreitung der AP, Ca 2+ Transienten verändern und alternans 23, 24, 25. LFFM ist auch nicht in der Lage Abbildung von Strukturen zur Verfügung zu stellen, wie die konfokale Mikroskopie und andere optische Abbildungstechniken. Dennoch macht die Verwendung von Faseroptik praktische es in rufnehmen lokale Fluoreszenzsignale aus dem Endokard oder in anderen Regionen, die mit einem konfokalen Mikroskop zum Zugriff in einer intakten Herzen schwierig oder unmöglich sind.
Der Vergleich zwischen den physiologischen Variablen aus intakten Herzen und aus isolierten Myozyten Experimenten erhalten ist eine Herausforderung. Der größte Vorteil von isolierten Kardiomyozyten mit ist die einmalige Gelegenheit, biophysikalischen Eigenschaften der Zellen unter Patch-Clamp-Bedingungen zu bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglicht LFFM die Untersuchung der physiologischen und pathologischen Erscheinung in einer natürlichen Umgebung. Beispielsweise in intakten Herzen können wir transmurale Unterschiede 15, Herzfrequenz Abhängigkeit von AP und Ca 2+ bei einem physiologischen Bereich 13 , die in isolierten Zellen unerreichbar sind beurteilen. Darüber hinaus können wir die Auswirkungen einer ischämischen Insult auf die Funktion des intakten Herzens 9, 10 studieren. Ganze Herz exExperimente erlauben uns auch die Wechselwirkung zwischen anderen Zelltypen und Myozyten 11 zu bewerten.
LFFM ermöglicht die Visualisierung von zellulären Signalen auf der intakten Herzhöhe, in dem Zellen physiologischen Kopplung aufweisen. LFFM ermöglicht die Untersuchung der intrazellulären Aktivität während Zellen noch im intakten Organ sind. In Kombination mit Fluoreszenzfarbstoffen und Epilumineszenz können LFFM zwei Schlüsselherz Eigenschaften überwachen: Ca 2+ Dynamik und elektrische Aktivität.
Schließlich können mehrere Anwendungen in der Studie des ECC haben die hier vorgestellten Verfahren. Es ist ein Werkzeug, wie supramolekulare Signale betroffen sind in pathologischen Situationen wie Arrhythmien 16 und Ischämie 9, 15 offenbart. Diese Technik ist ein Muss, um diese Krankheiten zu studieren, da sie nur auf der intakten Organebene zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Alicia Mattiazzi für kritische Diskussion der vorliegenden Arbeit. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NIH (R01 HL-084487) zu ALE unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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