Summary
I hjärtat, molekylära händelser samordna elektriska och kontraktila funktion av organet. En uppsättning av lokala fält fluorescensmikroskopi tekniker som presenteras här möjliggör inspelningen av cellulära variabler i intakta hjärtan. Identifiera mekanismer som definierar hjärtfunktion är viktiga för att förstå hur hjärtat fungerar under patologiska situationer.
Abstract
I hjärtat är molekylära signal studier vanligtvis i isolerade myocyter. Men många patologiska situationer såsom ischemi och arytmier kan endast till fullo förstås vid hela organnivå. Här presenterar vi den spektroskopiska teknik för lokal fält fluorescensmikroskopi (LFFM) som möjliggör mätning av cellulära signaler i den intakta hjärtat. Tekniken är baserad på en kombination av en Langendorff perfusion hjärta och optiska fibrer för att spela in fluorescerande signaler. LFFM har olika tillämpningar inom kardiovaskulär fysiologi att studera hjärtat under normala och patologiska tillstånd. Flera hjärt variabler kan övervakas med hjälp av olika fluorescerande indikatorer. Dessa inkluderar cytosolisk [Ca2 +], intra-sarko nätmagen [Ca2 +] och membranpotentialer. De exogena fluorescerande prober är glada och den emitterade fluorescensen detekterades med tre olika arrangemang av LFFM epifluorescence tekniks presenteras i detta dokument. De centrala skillnader bland dessa tekniker är den typ av ljuskälla som används för excitering och på vägen excitationsljuset moduleras. Den pulsade LFFM (PLFFM) använder laserljuspulser medan kontinuerlig våg LFFM (CLFFM) använder kontinuerligt laserljus för excitering. Slutligen tillsattes Ijusemitterande dioder (LED) används som en tredje ljuskälla. Denna icke-koherent arrangemang kallas pulse LED fluorescensmikroskopi (PLEDFM).
Introduction
Hjärtat är den centrala organ i det kardiovaskulära systemet. Hjärtats kontraktion initieras av en ökning av intracellulär [Ca2 +]. Förhållandet mellan elektriska retbarhet och förändringar i intracellulär Ca2 + frisättning har historiskt studerats i enzymatiskt dissocierade celler 1, 2. Emellertid hjärtceller är elektriskt, metaboliskt och mekaniskt kopplade 3, 4. När isolerade, de myocyter är inte bara fysiskt ansluten, men myocyter från olika skikt blandas under dissociation 5. Dessutom, trots de enorma fördelar som framkommit i studien av isolerade celler under spänningsklämförhållanden, 6, 7, 8 inneboende karaktären av hjärtat som en elektrisk syncytium always ställer frågan om hur funktionellt olika dissocieras celler från de som finns i vävnaden tre.
I detta manuskript, beskriver vi de framsteg som erhållits i kunskapen om hjärtats fysiologi med hjälp av lokala fält fluorescensmikroskopi (LFFM) tekniker i den intakta hjärtat. LFFM använder fluorescerande indikatorer för att mäta flera fysiologiska variabler såsom cytosoliskt Ca2 +, intra sarko nätmagen (SR) Ca 2+ och membranpotential. Dessa mätningar kan erhållas samtidigt och i samband med kammartryck 9, 10, elektrokardiogram 9, elektriska aktionspotentialer (APS), joniska ström inspelningar och flash fotolys av bur föreningarna 4, 11. Dessutom kan dessa mätningar erhållas genom pacing den intakta hjärtat vid högre frekvenser närar till fysiologiska priser. Även flera artiklar 9, 11, 12, 13, 14 har publicerats av vår grupp använder LFFM tekniker har antagandet av tekniska komplikationer i samband med denna teknik förhindras sin massiva användning studera ex vivo fysiologiska fenomen i hjärtat och andra organ.
Den LFFM tekniken (figur 1) är baserat på epifluorescence mätningar erhållna med användning av en optisk multimodfiber i kontakt med vävnaden. Precis som alla kontakt fluorescens bildteknik, den optiska upplösningen beror på diametern och den numeriska aperturen (NA) hos fibern. En högre NA och mindre diameter hos fibern kommer att öka den rumsliga upplösningen av mätningarna. NAS och fiberdiametrar kan sträcka sig från 0,22 till 0,66 och från 50 | im till 1 mm, respektive. Iskrynklas NA kommer att förbättra signalbrusförhållandet (S / N) genom att acceptera fotoner som anländer från en större rymdvinkel. För att fungera som en epifluorescence enhet, är ljusstrålen fokuseras i den optiska fibern med en asfärisk lins eller en epifluorescence mål där NA av linsen och fibern matchen. Denna matchning maximerar energiöverföringen för excitation och för att samla tillbaka fotoner som avges av fluoroforen.
För att excitera de exogena fluorescerande indikatorer laddade i vävnaden, kan olika ljuskällor och belysningslägen användas. Våra banbrytande studier med den pulsade lokala fältet fluorescensmikroskopi 3, 12 (PLFFM) använde en låg kostnad pikosekund laser (Figur 1a, PLFFM). Denna typ av ljuskälla har stor fördel av spännande en stor del av fluoroforen molekyler under belysningsområdet utan att väsentligen blekning av färgämnet på grundtill den korta pulsvaraktigheter 12. Dessutom, användningen av ultrakorta pulser tillät bedömning av fluorescenslivstid av färgämnet 12. Den fluorescenslivstid är en egenskap som kan användas för att kvantifiera den fraktion av färgämnesmolekyler bundna till Ca 2 +. Tyvärr, den tidsmässiga bilden darrar av pulserna och variationer i amplitud från puls-till-puls begränsa tillämpningen av denna experimentella strategi till fall där förändring i fluorescens som produceras av ligandbindning till färgämnet är stort.
Kontinuerlig våg (CW) lasrar används vanligen som huvudbelysningskällan i LFFM (figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan kontinuerligt belysa vävnaden eller kan ferroelectrically moduleras. Det ferroelektriska modulering av strålen tillåter alstring av mikrosekunders pulser av ljus. Denna modulering kan kontrolleras genom extern hårdvara. Detta förfarande minskar inte bara dramatiskt than temporal flimret av ljuspulser utan gör det också möjligt att blanda strålar av olika våglängder. Blandningen av balkarna sker genom multiplexering av strålar från olika lasrar. Som en följd av detta kan flera färgämnen med olika spektrala egenskaper vara glada att utföra mätningar av olika fysiologiska variabler, till exempel, Rhod-2 för cytosoliskt Ca2 +, MagFluo4 för intra-SR Ca 2 + och di-8-ANEPPS för membranpotential.
Fastän lasrar är närvarande olika fördelar som ljuskälla i LFFM, kan andra typer av ljuskällor användas innefattande Ijusemitterande dioder (LED). I detta fall bestod excitationsljuset källa för en InGaN lysdiod (fig 1c, PLEDFM). I lysdioder, är fotoner spontant emitteras när elektroner från ledningsbandet rekombinerar med hål i valensbandet. Skillnaden med solid-state laser är att utsläppen inte stimuleras av andra fotoner. Detta resulterar i en icke-koherent stråle ochen bredare spektralemission för lysdioder.
Olika typer av hög effekt lysdioder kan användas. För AP inspelningar med Di-8-ANEPPS och Ca 2 + transienter som spelats in med Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, använde vi en lysdiod som har en typisk toppemission vid 485 nm (blå) och en halv bredd av 20 nm (figur 1d). För Ca2 + transienter som spelats in med Rhod-2, hade lysdioden en typisk toppemission vid 540 nm (grön) och en halv bredd av 35 nm (figur 1d). Lysdioder avger i ett band våglängd och därför kräver filter för att begränsa deras spektrala utsläpp. Dessutom kan pulserat ljus alstras med en hastighet av 1,6 kHz med varaktigheten av 20 ^ s. Lysdioderna pulserades med en snabb effekt-MOSFET fälteffekttransistor. Samtidiga inspelningar med olika indikatorer kan utföras genom tidsmultiplexering lysdioderna. Tyvärr, är ljus som sänds ut av lysdioder mer svårt att fokusera på en fiberoptisk jämfört med en laserstråle. Således, den stora nackdelen av ossing lysdioder är att deras utsläppsprofiler har vinkelförskjutningar (± 15 °) från huvudaxeln, och en extra optisk måste användas för att rätta till det.
I alla de optiska konfigurationer som tidigare beskrivits, är exciteringsljuset reflekteras med hjälp av en dikroisk spegel. Strålen därefter fokuseras av en asfärisk lins och ett mikroskopobjektiv på en multimode fiberoptisk som är placerad på vävnaden. Som i alla epifluorescence arrangemang, den dikroiska spegeln tjänar också till att separera excitering från det utsända ljuset. Det emitterade ljuset spektrum färdas tillbaka genom ett spärrfilter för att avlägsna eventuellt reflekterade excitering. Slutligen är det emitterade ljuset fokuseras med ett mål på en fotodetektor (Figur 1).
Transduktionen från ljus till elektrisk ström utförs genom kisellavinfotodioder. Dessa dioder har en snabb respons och hög känslighet gör det möjligt svagt ljus upptäckt. Defotoström som alstras av lavinfotodioder kan amplifieras på två sätt: en transimpedansförstärkare som har ett resistivt återkopplingselement (Figur 1e) eller av en integrator för att omvandla strömmen till en spänning (figur 1f). Med användning av den första metoden, är utspänningen som är proportionell mot fotoströmmen och återkopplingsmotståndet. Ett typiskt exempel på den resistiva detektering av pikosekund laserpulser visas i figurerna 2a, 2b och 2c. Panel 2a illustrerar utsignalen från transimpedansförstärkaren och panel 2b visar en tidsexpansion av intervallet indikeras med en asterisk (*). En topp spårning algoritm genomfördes för att detektera toppen (röd) och basen (grön) för fluorescerande svar 12. Mätningen av basen fluorescens ger information av både den mörka strömmen hos lavinfotodiod och störningarna som införs genom omgivnings light och elektromagnetisk koppling. En representation av toppar och baser visas i figur 2c. Denna figur illustrerar den fluorescens som emitteras av färgämnet (Rhod-2) bundet till Ca 2 + under hjärtcykeln av stryk undulat hjärta.
I den andra metoden, är utspänningen från integratorn en funktion av strömmen och kapacitiv återkoppling (figurerna 2d, 2e och 2f). Figur 2F visar två på varandra följande cykler integration: den första utan ytterbelysning och andra med pålagda ljuspulser från en pulsad LED. En detaljerad beskrivning presenteras i figurerna 2g och 2h. Detta tillvägagångssätt, även om mer arbetskrävande, ger en större S / N på grund av frånvaron av termiskt brus i återkopplingskondensator. Instrumentet innehåller en tidssteg som genererar all kontroll och multiplexering av excitationsljuset och beordrar huvudsteg integration och reset perioder. Detta utförs vanligtvis med en digital signalbehandlingskrets som även utför en digital differentiering av den integrerade utsignalen genom att beräkna en on-line regression av data. I fallet med användning av en resistiv återkoppling, kan vilken som helst A / D-upptagningskortet.
Slutligen är vår LFFM teknik mycket mångsidig och kan anpassas för att spela in från mer än en region. Tillsats av en stråldelare i strålgången tillåter oss att dela upp ljuset i två optiska fibrer. Varje optisk fiber kan sedan placeras på olika regioner i en servett för att oberoende excitera och emissions rekord från exogena fluorescerande prober. Denna ändring gör det möjligt för oss att bedöma hur anatomiska regionala skillnader påverkar fysiologiska variabler. Figur 3 visar en stråldelare som utnyttjas för att dela upp CW excitationsljus så att två optiska fibrer används för att mäta transmural elektrisk eller intracellulär [Ca2 +] nivåer with moll-invasivt. Transmural signaler kan spelas in genom att placera en fiber på endokardium och den andra på epikardium lagret av kammarväggen. Därför har de LFFM teknik möjligheten att mäta tidsförloppet av cellulära signaler i olika regioner och kan användas för att testa om regionala förändringar inträffa under patologiska situationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll och alla möss hantering godkändes av UC Merced Institutional Animal Care och användning kommittén (nr 2008-201). Experiment med parakiter genomfördes under 1999 enligt allmänna riktlinjer för djur som fastställts av vetenskapliga uppdrag av venezuelanska Institute for Scientific Research (Ivic).
1. Langendorff Ställande Förberedelse
- Förbereda Tyrode-lösning innehållande följande lösta koncentrationer i mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glukos, 10 HEPES. Justera pH i Tyrode-lösning till 7,4 med NaOH och filtrera lösningen genom ett 0,22 pm filter.
- Ladda Tyrode-lösning in i de 60 ml sprutor och alla slangar av den horisontella Langendorff set-up 11, 12 som visas i fig 4. Se till att eliminera alla luftbubblor.
- Ansluta plaströr till en O 2 tank.
- Lägg till en plastpegen adapter för att sänka en 5 "röret i Tyrode-lösning i 60 ml sprutan.
- Fästa en plast luft graven till slutet av den 5 "röret så O 2 kommer att bubbla ut i Tyrode-lösning.
- Placera en icke-absorberbar kirurgisk sutur runt en nål som används som en kanyl. Nålen är kopplad till förgreningsröret (se fig 4) som gör retro perfusion med olika lösningar. Slutligen kommer hjärtats aorta vara kanylerade in i nålen.
2. Animal Förberedelser och hjärta Dissection
- Väg och injicera musen med heparin (ex. Mus vikt 20 g, injicera med 20 enheter eller 200 mikroliter) 15 min innan euthanizing genom halsdislokation. Söva parakeets enligt to djur använda guider din IACUC protokollet och sedan fortsätta med halsdislokation.
OBS: Använd 8 veckor gamla möss eller 20 g parakiter. - Ta hjärtat ur brösthålan efter eutanasi. Extrahera parakiter hjärtan på exakt samma sätt som beskrivs för möss.
- Rengöra musen bröstet med etanol.
- Använda dissektion sax, gör ett snitt i nedre delen av magen och sedan skära upp sidorna mot halsen.
- Dra tillbaka den skurna vävnaden och stift ner.
- Skär membranet. Var försiktig när du skär membranet att undvika skador på hjärtat.
- Avlägsna lungorna och omgivande vävnad.
- Använd pincett att ösa hjärtat utan att klämma. Skär aortan så länge som möjligt.
- Transportera hjärta på en liten väg båt med cirka 1 ml Tyrode lösning.
- Med hjälp av en icke-absorberbara kirurgiska suturer, knyta aorta på den horisontella Langendorff apparaten via ennål. Knyt hjärtat aorta med hjälp av två fina pincett. Börja retro perfusion genom att öppna ventilen placerad i serie med 60 ml sprutor innehållande Tyrode-lösning.
- Ge hjärtat stabiliseras under 10 min. Använd denna tid att rensa blodet och fettvävnad som omger hjärtat innan du lägger färgen. Dra fettvävnad nära basen av hjärtat med pincett och skär med hjälp av små dissektion sax. Var noga med att göra detta under visningen av en dissekera mikroskop.
3. cytosoliska Ca 2 + Mått: Förbereda Dye Rhod-02:00
- Tillsätt 20 mikroliter av pluronic 20% (ett icke-joniskt ytaktivt medel) i DMSO till en särskild förpackad plastampull som tillhandahålls av färgämnestillverkaren innehållande 50 | j, g av färgämnet.
- Blanda genom att pipettera upp och ned, för att undvika bubblor.
- Överför den blandade DMSO med icke-joniska ytaktiva medlet och färgämnet från den särskilda paketerade plastflaska i en genomskinlig glasflaska. Tillsätt 1 ml av Tyrode lösningarning till den klara glasflaska.
- Sonikera för 15-20 minuter i ett bad sonikator.
- BEGJUTA färgen med hjälp av peristaltiska pumpar under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Placera färgämnet i färgkammaren.
- Använda en mekanisk klämma för att komprimera alla andra slangledningar anslutna till grenröret. Klämman är placerad ovanför fördelaren. Detta kommer att förhindra varje backflöde i slangen som är ansluten till de 60 ml sprutor.
- Slå på den peristaltiska pumpen perfusion att börja cirkulera färgen. Stäng omedelbart 3-vägsventilen under 60 ml spruta.
- Placera ett litet rör som är ansluten till den peristaltiska pumpens insugnings bredvid hjärtat att återcirkulera det färgämne som har perfusion in i hjärtat.
4. Intra-SR Ca2 + Mått: Förbereda Dye Mag-Fluo4AM
- Förbereda Mag-Fluo4AM på samma sätt som Rhod-02:00. Se avsnitt 3 för stegvisa instruktioner.
- after laddar färgen, öppna ventilen placerad i serie med 60 ml sprutor innehållande Tyrode-lösning för att börja retro perfusion. Var noga med att ta bort klämman över grenröret.
- Lägga Tyrode-lösning till det horisontella kammaren och värma upp till 37 ° C.
- Retro-BEGJUTA med Tyrode-lösning i 45 minuter för att ta bort den cytosoliska färgämne.
5. membranpotential Mått: Förbereda Dye Di-8-ANEPPS
- Tillsätt 5 ml av 99% etanol till färgen flaskan som innehåller 5 mg av färgämnet.
- Alikvotera 10 mikroliter till 500 enskilda 1 ml plastflaskor med hjälp av en repeater pipett.
- Desiccate i en hastighetsvakuum och förvara vid -20 ° C.
- Tillsätt 20 mikroliter av 20% pluronic i DMSO till en plastflaska med 10 mikrogram av den torkade färgen.
- Blanda genom att pipettera upp och ned, för att undvika bubblor.
- Överföra blandning innehållande DMSO med pluronic och färgämne från plastflaskan till en graderad cylinder (10 ml). Lägga Tyrode-lösning till en slutlig voLume av 5 ml.
- Sonikera för 20-25 minuter i ett bad sonikator.
- Perfundera in i hjärtat under 30 min med hjälp av peristaltiska pumpar. Se stegvis instruktioner i avsnitt 3.5.
6. Inspelning epikardisk Signaler
- Efter att ha laddat färgämnet, retro BEGJUTA hjärtat med Tyrode-lösning genom att ta bort klämman över grenröret. Öppna ventilen placerad i serie med 60 ml spruta innehållande Tyrode-lösning. Retro-GJUTA Tyrode-lösning under 10 min för att stabilisera hjärtat.
- Fylla den horisontella kammaren med Tyrode-lösning och slå på peltier enheten för att bringa badtemperaturen till 37 ° C.
- Positionera den fiberoptiska på ytan av hjärtat.
- Placera den fiberoptiska i en 2 ml pipett och fäst sedan pipetten till en mikromanipulator.
- Använd mikromanipulator att något tryck på fiberoptiska mot ytan av LV.
- Externt stimulera heart med en stimulator som styrs av en våggenerator.
- Programmera våggeneratorn för att åstadkomma en kvadratisk puls med en bredd på 1 ms.
- Ställ stimulatorn att externt synkroniserad och anslut den externa ingången till våggeneratorn.
- Till varje utgång av stimulatorn, ansluter en tråd med en akupunkturnål lödda i slutet.
- Placera båda akupunkturnålar i spetsen av hjärtat ca 3 mm från varandra.
- Först efter nålarna placeras i vävnaden, slå på utgången på stimulator för att förhindra elektriska stötar.
- I förvärvs programvara, justera förvärvsfrekvensen till 10 kHz.
7. Inspelning Endocardial Signaler
- Se steg 6,1 och 6,2 för att stabilisera hjärtat efter lastning färgämnet.
- Med användning av en skarp 23Ga punkt om storleken på den fiberoptiska, gör ett litet hål i ytan av hjärtat på LS nära septum. <li> Placera en intravitreal kirurgi sclerotomy adapter för att underlätta positionering av första fiberoptiska i endokardiet med hjälp av en mikromanipulator.
- Externt stimulera hjärtat. Se steg 6,4.
- I förvärv programvara, justera förvärvsfrekvensen till 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AP och Ca2 + transienter i endokardium och epikardium
För att kunna jämföra signaler över den ventrikulära väggen, är en fiberoptisk positionerad i endokardiet och den andra i epikardium. Att jämföra morfologin hos en AP registrerades från endokardiet med ett från epikardium är det bästa sättet att bedöma transmural funktion. Den ventrikulära väggen är mycket heterogen och sålunda, morfologin för AP är mycket olika i dessa två regioner. Det är väl känt att endokardiet har mindre I till än epikardium 17, 18, 19. Ju mindre jag gör repolarisering av fas ett långsammare i endokardiet 18, 20. Figur 5b shöden en typisk optisk inspelning av AP från endokardiet och epikardium. För att utföra dessa inspelningar möss hjärtan laddas med potentiometrisk färgämnes di-8-ANEPPS och fluorescens mättes med användning av CLFFM teknik. Morfologi optiskt inspelad AP, särskilt i fas 1, visar en långsammare tidsförlopp för endokardiet (aktionspotentialens duration (APD) 30 är 8,01 ms ± 2,5) jämfört med epikardium (3,4 ms ± 0,59) (Figur 5b). I allmänhet kan den APD beskrivas som den tid det tar för AP att repolarize en viss procent inklusive 30, 70 eller 90 (figur 5a). Dessa spår har normaliserats och flyttas för att ha överlappande fas 0. Vid en jämförelse av APD (Figur 5c), ser vi att endokardiet och epikardium skiljer sig signifikant under fas 1. Även om dessa AP är fluorescenssignaler, de kan kalibreras till en specifik membranpotential genom att samtidigt mäta den AP med enskarp mikro fylld med 3 M KCl 13.
Förutom att membranpotentialen, kan exogena fluorescerande indikatorer användas för att övervaka intracellulär [Ca2 +]. Vanligtvis använder vi Rhod-02:00 för att mäta intracellulära Ca 2 + transienter på grund av dess höga dynamiskt omfång och dess förmåga att stanna i cytosolen även vid fysiologiska temperaturer. Figur 6b visar ett typiskt inspelning av de intracellulära Ca 2 + transienter i endokardiet och epikardium skiktet. Dessa resultat har delvis publicerats 15. För att kunna jämföra regionala skillnader i den intracellulära [Ca2 +] nivåer, kinetiken av Ca 2 + transienter bedömdes (figur 6a). Sammantaget analys av Ca2 + gående kinetik (figur 6c) visar att Ca 2 + transienter från endokardiet hade signifibart långsammare kinetik än de som registrerats från epikardium.
Ca2 + dynamiken i SR lumen
I hjärtat, uppgång och fall av intracellulär [Ca2 +] nivåerna är avgörande för att definiera många fysiologiska variabler, inklusive tryck, kontraktilitet och aktionspotentialens duration (APD). I föregående avsnitt beskrivs vår förmåga att mäta cytosoliska Ca 2 + transienter. Ca2 + frigörs från SR är till stor del ansvarig för ökningen av intracellulära cytosoliska Ca 2 +. Således, för varje ökning av den intracellulära Ca2 + det finns en Ca 2 + utarmning i SR. Men cytosoliska Ca 2 + transienter är inte enbart beror på SR Ca 2 + release, men inkluderar även Ca2 + kommer in i cellen genom plasmamembranet. vårt labb16 har kunnat utvärdera SR Ca 2 + innehåll genom användning av ett fluorescerande färgämne, Mag-Fluo-04:00. Fastän detta färgämne är de-förestrad i myoplasm och SR, kan de myocyter extrudera ut den cytosoliska fraktionen. Detta färgämne extrudering kan främjas genom att helt enkelt öka temperaturen till 37 ° C. Vid denna temperatur är den cytosoliska färgämne avlägsnades genom en ATP-bindande kassett liknande membranprotein. Lyckligtvis är detta protein som inte är närvarande i SR membranet. Därför, efter ökning av temperaturen till 37 ° C, är fluorescens spelats in med PLFFM teknik mestadels ett resultat av den Ca2 + bindning till färgämnet inom SR. För att testa specificiteten hos organellen mätning, var en koffeinpuls appliceras för att stimulera Ca2 + frisättning genom Ryr. Det är möjligt att konstatera att signalen är verkligen ett resultat av SR utarmning (Figur 7). Koffein inducerad SR Ca 2 + frisättning (Figur 7a) Producerar både, en minskning av det diastoliska nivån av Mag-Fluo-4 fluorescens (92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012)) och en minskning i amplituden för Ca 2 + transienter (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Intra SR spår inspelade före och efter koffein stimulus representeras nedåt i figur 7b-7d. Eftersom tiden går från koffein stimulans, är amplituden av SR utarmning mindre. Figur 7e visar att SR utarmning inducerar inte bara en minskning i amplituden för den Ca2 + signalen utan även saktar ner SR Ca 2 + utgivningsprocessen. Fluorescensen trace i figur 7a har tidigare publicerats 15.
Pulserande LED: Action potentialer
I figur 5 visade vi att Di-8-ANEPPS kan rapportera förändringari membranpotentialen när den exciteras vid 532 nm. Under denna excitation tillstånd, finns det en minskning av utsända fluorescens vid våglängder högre än 590 nm. Intressant, när denna potentiometrisk färgämne exciteras nära dess maximala excitationsvåglängden (~ 476 nm), fluorescensemissionen från de färgämnes skiftar till lägre våglängder när membranet depolariserar. Följaktligen tillåter denna spektrala skift oss att spela in den emitterade fluorescensen vid två olika våglängder. Detta spektral egenskap av Di-8-ANEPPS tillåter ransonering av den emitterade fluorescens registreras vid två olika våglängder, en funktion som är vanligtvis av stort värde eftersom det slutliga beräknade inspelningen kommer att vara oberoende av färgämneskoncentrationen i membranet. För att dra full nytta av Di-8-ANEPPS spektral förskjutning, använde vi pulsade lysdioder som ljuskälla. Vi använde pulsade blått ljus för att excitera fluoroforen. Excitation utfördes vid 485 nm, nära toppen absorptionsvåglängden för Di-8-ANEPPS (~ 476 nm). Förvärv i två olika emissions spektroskopiska band tillåter förhållandet bildning och förmågan att öka S / N och avvisa likfasigt brus som ljus miljö och rörelseartefakt i contracting hearts där den mekaniska frikopplare blebbistatin inte har använts. Denna situation är mycket viktigt för experimentella förhållanden där både den mekaniska aktiviteten i hjärtat och kinetiken för Ca 2 + transienter behöver mätas samtidigt.
Tidsdiagrammet i den PLEDFM illustreras i figur 8a. Diagrammet innefattar styrlogiken för integrering och återställning av fotodetekteringshuvudsteg, på-av tidpunkten för LED och analog-till-digital-omvandling. Under tidsförloppet för en AP, fluorescensen detekterad i den gröna våglängdsbandet visar en ökning i intensitet medan fluorescensen detekteras i det röda bandet minskar. Figur 8b visaratt förändringen av fluorescenssignalen som alstras av membrandepolarisering rör sig i olika riktningar. Emellertid är rörelseartefakt som produceras av hjärtat kontraktion alltid orienterad i samma riktning, oberoende av emissionsvåglängden. Som förklarats tidigare, måste data från båda kanalerna (grön och röd) vara mjukvarurade vid beräkningen av förhållandet. Konditione inkluderar offset och få korrigeringar. Valet av offset och få korrigeringar nivå är inte automatisk. Användaren av mjukvara har för att välja variablerna för att konditionera spåren innan förhållandet. Den resulterande förhållandet i panelen 8b (Figur 8) visar att artefakten införts av hjärtmuskel rörelsen har avbrutits.
Den relativa förändringen av di-8-ANEPPS fluorescens under en AP är vanligen mycket liten (~ 8% per 100 mV). Detta di-8-ANEPPS fluorescensförändring är mycket mindre än den som tillverkas av den Ca2 + binding till Rhod-2 (<200%). Således, för att öka signalbrusförhållandet för di-8-ANEPPS, flertal inspelningar kan medelvärdesbildas.
Pulserande LED: Samtidiga inspelningar av Ca2 + och membranpotential
Det sista målet med hjälp av denna experimentella tillvägagångssättet består i att utföra samtidiga inspelningar av Ca 2 + transienter och AP. Samtidiga registreringar av flera fysiologiska signaler kräver att lösa tekniska problem i samband med olika aspekter av systemet inklusive: koppla ljuskällan med den optiska fibern, som matchar absorptionsspektrum av färgämnet med utsläpp av lysdioderna, utforma analoga och digitala elektronisk krets till generera timing och förvärv samt utvecklingen av snabb mjukvara för att analysera data on-line.
i our studie, val av färgämnen berodde på deras spektrala egenskaper. Flourophores används för att mäta olika signaler måste absorbera i olika spektralband. Detta villkor är nödvändigt för att skilja mellan signalkällorna. Varje gång som en LED som har en annan våglängd används för att excitera vävnaden, detekterade fluorescensen motsvarar den signal relaterad med det färgämne som absorberar i den våglängden. På detta sätt, fluorescensemission som kommer från olika färgämnen, men i samma våglängdsbandet, kan särskiljas genom den tid vid vilken var och en exciteras.
Icke desto mindre, kan överhörningen mellan färgspektra inte undvikas helt. Detta beror på att de spektrala absorptionsegenskaperna hos färgämnena gör dem absorberar ljus med våglängder långt ifrån sin topp absorption. I våra experiment överhörning på båda sätten: (1) Rhod-2 som exciteras av blå LED, lägga till en Ca2 + signal till den röda channel AP spår, och (2) Di-8-ANEPPS som exciteras av den gröna lysdioden, som visas på Ca2 + övergående signal (figur 9F). Denna överhörning kan korrigeras on-line, såsom illustreras i fig 9. Proceduren fungerar eftersom den inkräktar signalen är en liten andel av den signal som måste mätas. Slutligen, med hjälp av denna typ av algebraisk bearbetning av fluorescens från färgämnena tillät oss att separera AP (figur 9d) bildar Ca 2 + transienter (figur 9h). En detaljerad beskrivning av denna bearbetning beskrivs i figuren legend. Det är viktigt att lägga märke till att alla Pulsed LED experiment utfördes en 28 ° C.
Figur 1: Local Field fluorescensmikroskopi (LFFM). Den LFFM består av en epifluorescence arrangemangmed användning av en optisk multimodfiber som är i kontakt med vävnaden för att spela in den fluorescens som emitteras från exogena färgämnen perfunderade in i hjärtat. Den LFFM set-up kan använda tre olika ljuskällor, inklusive (a) PLFFM, där exciteringsljuset åstadkommes genom en pulsad pico Nd-YAG-laser; (B) CLFFM, där kontinuerlig våg lasrar används och ljuspulser genereras av en ferroelektrisk modulator tillåter multiplexering av lasrar med olika våglängder; och (c) PLEDFM, där lysdioder har bredare emissionsspektra med utsläpp topp (d) 485 nm och 540 nm för blå och gröna lysdioder, respektive, elektroniskt pulsad. När laserkällor används, är strålen oskärpa med en balk expander. Slutligen dikroiska speglar och objektivlinser fokusera strålen på fiberoptiska distala ände som är något tryckt mot vävnaden. Det emitterade ljuset färdas tillbaka genom samma fiberoptik, dikroisk spegel, emission filter och fokuseras på en lavinfotodiod där fotoner omvandlas till en elektrisk ström. Den nuvarande kan amplifieras med hjälp av två metoder (e) transimpedansförstärkare, där den resulterande utspänningen är proportionell mot fotoströmmen och återkopplingsmotståndet; (F) integrator, där utgångsspänningen är en funktion av strömmen och kapacitiv återkoppling. Slutligen är den signal som förvärvas av en A / D-omvandlare och visas på en dator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: resistiv och kapacitiv konvertering. (A) Ett typiskt exempel på den resistiva detektering av pikosekund laserpulser visas. Asterisken (b)visar en tidsexpanderade intervall, där en topp spårningsalgoritm genomfördes för att detektera toppen (röd) och basen (grön). (C) En representation av spår beräknas från toppar och baser inspelningar visas för Rhod-2 fluorescerande svar i en slående undulat hjärta externt tempo på 7 Hz och badtemperaturen inställd på 37 ° C. d till h) Den fotoström omvandlas av en integrator med hjälp av en kapacitiv återkoppling. Typiska inspelningar av intakt mus hjärta Ca2 + transienter visas i två olika tidsskalor (d och e). (F) Integrationen av två på varandra följande cykler med och utan LED-belysning visas. Integralen av signalen ökar linjärt som den fotoström laddar återkopplingskondensator. Lutningen på den tidsberoende gral (tan (Ɵ)) är proportionell mot antalet fotoner som påverkar den lavin korsningen förutom den elektron-hål rekombination inducerad av den phononic aktivitet när lavindiod inte upptäcka några fotoner. De digitala signalerna styra huvudsteg integration och återställningstider visas i panel g. Signaler som detekteras under den icke-lysande (DC) och LED belysning tid (F) visas i panelen h. Subtraktion av F och DC ger den verkliga mätningen av fluorescent detekteras Ca2 + transienter från möss hjärtan externt stimuleras vid 9 Hz vid 37 ° C (h). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: LFFM för epikardium och endokardium mätningar. Den CLFFM set-up användes för att mäta den fluorescens som emitteras från exogena fluorescerande färgämnen som är närvarande i epikardium end endokardium skikt. Tillsatsen av en stråldelare underlättas registrering av olika fysiologiska variabler i epikardium och endokardiet. Två fiberoptik användes med sina individuella headstages att upptäcka från epikardium och endokardiet. En liten cirkulär snitt gjordes i kammaren och en fiberoptisk träddes genom att spela in från endokardiet. Denna uppsättning används en ström-till-spänning-omvandlare med en resistiv återkoppling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: horisontell kammare med temperaturkontroll. Ett diagram som visar den Langendorff set-up där intakta hjärtan bibehålls funktionell i timmar. Hjärtat är bunden till en nål, genom vilken alla lösningar och färgämnenär retro perfusion in i hjärtat via kranskärlen förgrenar av aorta. Kammaren är placerad ovanför en peltier enhet för att hålla temperaturen hos badet, som läses av en temperatursensor som är ansluten till en voltmeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Transmural Action potentialmätningar i intakta hjärtan. (A) aktionspotentialens duration (APD) bedöms som den tid det tar att slutföra 30%, 70%, eller 90% av AP repolarisering. (B) Di-8-ANEPPS fluorescens från epikardium (svart) och endokardiet (grå) visar AP morfologiska skillnader i repolarisering mellan de två skikten av den ventrikulära väggen. (C) Efter att ha utvärderat than APD 30, 70, och 90 i endokardiet och epikardium, resultat visade endast signifikanta skillnader förekom i APD 30 (8 ± 2,5 ms endokardium vs 3 ± 0,6 ms epikardium). Hjärtan var stimuleras vid 6 Hz och temperatur inställd på 37 ° C. Data är medelvärde ± SEM av 5 hjärtan. * P <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Transmural Ca2 + Övergående Mätningar i intakta hjärtan. (A) Parametrar för Ca2 + gående kinetik mäts är: den tid det tar att nå maximal, tid till topp (TP); den tid det tar att gå från 10% till 90% av ökningen, stigtid (RT); den tid det tar att gå från 10% till 90% av det förfall, avklingningstid (DT); och dentid det tar att slutföra 50% av den övergående, halv varaktighet (HD). (B) fluorescens som emitteras av Rhod 2 efter excitering med en grön CW lasershow epikardium (svart) och endokardiet (grå) Ca 2 + transienter med skillnader i avkoppling. c) Ca 2 + transienter från endokardiet hade signifikant långsammare kinetik i RT, TP, HD, och DT än de som registrerats från epikardium. Hjärtan var stimuleras vid 6 Hz och temperatur inställd på 37 ° C. Data är medelvärde ± SEM av 5 hjärtan. * P <0,05. Modifierad från Mattiazzi et al. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Intra SR Ca2 + Mätningar i intakta hjärtan.(A) Den emitterade fluorescensen från Mag-Fluo-4 färgämne droppar över tiden, vilket återspeglar en minskning i den intra SR Ca2 + -koncentration. (B) expanderad vy av minskningen i Mag-Fluo 4 fluorescens indikerar Ca2 + utarmning inducerad av Ca2 + frisättning från SR. (C) En expanderad vy av minskningen av övergående amplitud från Mag-Fluo 4 fluorescens representerar Ca2 + frisättning modifieras genom perfusion hjärtan med 20 mM koffein. (D) Efter en lång applicering av koffein, en minskning i både diastoliskt nivån av Mag-Fluo-4 fluorescens och i amplituden av Ca 2 + transienter [ned till 92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012) och 51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003) av initialvärden, respektive], observeras. Som mer tid fortskrider från koffein, är den mindre amplituden hos SR utarmning. (E) Normaliserade spår i bd visar att SR utarmning inte bara framkallas minskar av Ca2 + signalen men saktar också ner SR Ca 2 + påfyllning. Hjärtan var stimuleras vid 4 Hz och temperatur inställd på 37 ° C. Fluorescens spår är från Kornyeyev et al. 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Propportionell Mätningar av AP i intakta hjärtan med Pulsed LED. (A) tidsdiagram inklusive integration och återställning av headstage, on-off tider på LED och en verklig inspelning visas. (B) Spår från de två kanalerna har olika vilovärden och förskjutningen korrigeras genom att förflytta hävarmarna tills varje AP föregås av en vilande värde. Förstärkningen för varje kanal är också justerted. Observera att en mycket stor rörelseartefakt visas på båda kanalerna mellan de två depolarisationer. Efter programmet bearbetar signalerna ratiometrically, är resultatet en AP utan märkbara artefakter (blå). Hjärtan var stimuleras vid 3 Hz och temperatur inställd på 28 ° C. Alla poster som visas är ett genomsnitt av 10 spår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Samtidig Ca2 + transienter och AP Mätningar i intakta hjärtan med Pulsed LED. Den överhörning kontaminering av signaler när båda inspelning Ca2 + och AP kan korrigeras on-line. Den potentiometrisk färg, di-8-ANEPPS, exciteras med 20 ps blå LED pulser (a). Signaler är sPlit, filtreras med bandpass röd och grön filter. Dessa signaler detekteras av två olika lavinfotodioder indikerade som den röda (b) och gröna kanalen (c). Det är möjligt att konstatera att båda signalerna, rött och grönt, presenterar en märkbar rörelse artefakt som visas som en nedåtgående böjning. Båda signalerna, rött och grönt, är offseted och förstärks sedan. De konditionerade signaler används för att beräkna förhållandet mellan dem och resultatet visas i d. Det är möjligt att observera att i förhållandet mellan de båda signalerna (d) de rörliga artefakter är inställda. Panel e illustrerar den sekvens av logiska pulser som styr en grön mitterande lysdiod används för att excitera Ca 2 + indikator Rhod-2. Fluorescerande signaler som erhålls med hjälp av denna procedur visas i f. Även om spåret i f visar mestadels en ökning av fluorescenssignalen på grund av den Ca2 + binding till Rhod-2, är det även möjligt att observera en negativ avböjning i spårnings grund av en fluorescens detekterad signal från Di-8-ANEPPS när detta färgämne exciteras med grönt ljus. Detta problem kan korrigeras genom att subtrahera den potentiometriska signalen som visas i g. Resultatet av subtraktionen är visad i panel h där en Ca 2 + signalera fri från en AP förorening erhålles. Hjärtan var stimuleras vid 3 Hz och temperatur inställd på 28 ° C. Alla poster som visas är ett genomsnitt av 10 spår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta papper är centrerad vid beskrivning lokala fält fluorescenstekniker för att utvärdera funktionen av hjärtmyocyter ex vivo. Studiet av dessa celler i en kopplad miljö är inte bara mer fysiologisk, men är också mycket lämpligt för att bedöma organnivå patologier. De cellulära händelser som ligger till grund excitation-kontraktion koppling (ECC) kan utvärderas på hela organnivå med hjälp av molekylära prober som övervakar intracellulära Ca2 + dynamik (Rhod 2 cytosoliskt Ca2 +, Mag-Fluo4 SR Ca 2 +) och elektriska aktivitet (di-8-ANEPPS). Här har vi presenterat tre LFFM epifluorescence tekniker som både väcka och samla utsläpp från fluorescerande indikatorer med hjälp av optiska fibrer. De skiljer sig åt beroende på ljuskällan som används och vilken typ av ljus modulering. Den PLFFM använder en laser att pulser ljus, använder CLFFM kontinuerlig laserljus, medan LEDFM använder lysdioder som även kan pulsade i PLEDFM. Alla dessapresenteras i figur 1 som ett set, men kan konstrueras med endast ett av de tre epifluorescence arrangemang. Dessutom kan det detekterade ljuset bearbetas på olika sätt. Till exempel, figur 2 visar två olika situationer där fotoströmmen kan vara antingen integrerad eller direkt omvandlas till en spänning medelst en ström-till-spänningsomvandlare. I allmänhet kan man använda LFFM tillvägagångssätt för att samtidigt mäta flera anatomiska ställen, såsom framgår för figur 3.
Den metod som presenteras här för att bedöma hjärt egenskaper på den intakta organnivå är lämpligare att studera problem där kopplingen mellan celler är avgörande för att definiera beteendet hos vävnaden. Den inneboende heterogenitet av hjärtat kan producera olika AP vågformerna 13, 21, 22 baserat på den specifika vävnad från vilken cells ursprung. Därför studier hela organ ger möjlighet att bedöma den lokala fysiologiska funktionen av cellen i olika anatomiska strukturer. Dessutom har vi sett att intracellulära händelser som gnistor och vågor har olika kinetik i dissocierade celler än i den intakta organ 15.
Langendorff set-up (figur 4) är kritisk för att bibehålla hjärtat i en situation som är närmare in vivo. Dessutom ger det retroperfusion av flera läkemedel och olika fluorescerande molekylära prober som tillåter mätning av flera fysiologiska variabler. Ändra de exogena fluorescerande sönder som används, att öka storleken på den fiberoptiska, eller att välja en annan ljuskälla kan dramatiskt förändra tillämpningen av tekniken. Dessutom kan peltier enheten under horisontalplanet kammaren underlätta studier av Ca2 + dynamik vid olika temperaturer. lägga till tillbehöratt LFFM såsom en stråldelare kan öka antalet av fiberoptik som används för att spela in från olika regioner i det intakta hjärtat. Detta är en mycket värdefull anpassning till testet, om regionala skillnader förekommer i patologiska scenarier. Figur 3 visar endokardiet och epikardium bedöms samtidigt. Dessutom perfusion av hjärtat med olika agonister tillåter oss att förstå hur de olika regioner i kammarväggen regleras. Den elektriska signal (Figur 5) och Ca2 + kinetisk (Figur 6) heterogeniteter kan jämföras vid epikardium och endokardiet. Dessutom kan multipla färgämnen med olika exciteringsvåglängder och emissionsfilter användas. Till exempel, genom att använda Mag-Fluo-4, Ca2 + nivåer i lumen av SR kan spelas in (figur 7). Att variera storleken av den fiberoptiska kan även sträcka sig kapaciteten hos denna metod genom att tillåta den fluorescerande inspelning från en larGER region.
Denna uppsats visar också att bortsett från dyra lasrar, kan lysdioder användas som en exciteringsljuskällan i vår teknik. Figur 8 visar att denna billig typ av ljuskälla kan användas för att ratiometrically mäta AP. Den kvotmetriska mätning som visas i figur 8 är fördelaktig genom att producera en slutlig inspelning utan experimentella artefakter inklusive de som orsakas av rörelse. Slutligen kan även den Ca2 + övergående och AP vara optiskt registreras, samtidigt, genom att multiplexera olika våglängder och med användning av färgämnen med samma emissionsspektra. Behandlingen av signaler beskrivs översiktligt i fig 9 är kritisk i att ta bort inre ytor och som produceras av överlappningen i emissionsspektra av färgämnena. Inspelning Ca 2 + transienter och APs, samtidigt, men som två självständiga utsignaler är fördelaktigt att studera ECC och Ca2 + inducerad Ca2 +
LFFM är en teknik med flera program i cellulär fysiologi intakta vävnader. Emellertid är en stor begränsning att den inspelade fluorescensen är ett genomsnitt av emissionen från de underliggande fluorescerande indikatorerna i den lokala regionen där den optiska fibern är i kontakt med vävnaden. Även när man använder två fiberoptik, inte LFFM inte en subcellulär rumsliga fördelningen av de uppmätta signalerna. Optisk kartläggning är en bättre teknik för övervakning av fysiologiska variabler som ändras i tid och rum, såsom utbredningen av AP, Ca2 + transienter och alternans 23, 24, 25. LFFM kan inte heller ge avbildning av strukturer, som konfokalmikroskopi och andra tekniker optisk kartläggning. Ändå gör det praktiskt i r användningen av fiberoptikInspelning lokala fluorescenssignaler från endokardiet eller andra regioner som är svåra eller omöjliga att åtkomst i en intakt hjärta med ett konfokalt mikroskop.
Jämförelsen mellan fysiologiska variabler som erhållits från intakta hjärtan och från isolerade myocyt experiment är en utmaning. Den största fördelen med att använda isolerade hjärtmyocyter är den unika möjligheten att utvärdera biofysikaliska egenskaper hos cellerna under patch clamp-betingelser. I motsats härtill tillåter LFFM studiet av fysiologiska och patologiska fenomen i en mer nativ miljö. Till exempel, i intakta hjärtan vi kan utvärdera transmurala skillnader 15, hjärtfrekvens beroendet för AP och Ca 2 + vid fysiologiskt intervall 13 som är ouppnåelig i isolerade celler. Dessutom kan vi studera effekterna av en ischemisk skada på funktionen av den intakta hjärtat 9, 10. Hela hjärtat experiments också tillåta oss att utvärdera samspelet mellan andra celltyper och myocyter 11.
LFFM tillåter visualisering av cellulära signaler vid intakta hjärtnivå i vilka celler har fysiologisk koppling. LFFM tillåter studiet av intracellulär aktivitet medan celler är fortfarande i det intakta organet. I kombination med fluorescerande färgämnen och epiluminescence kan LFFM övervaka två viktiga hjärt egenskaper: Ca2 + dynamik och elektrisk aktivitet.
Slutligen kan metoden som presenteras här har flera tillämpningar i studien av ECC. Det är ett verktyg som avslöjar hur supramolekylär signalerna påverkas på patologiska situationer såsom arytmier 16 och ischemi 9, 15. Denna teknik är ett måste för att studera dessa sjukdomar eftersom de endast kan förstås på intakta organnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Alicia Mattiazzi för kritisk diskussion av det presenterade arbetet. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (R01 HL-084.487) till ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
