Summary
I hjertet, molekylære begivenheder koordinere elektrisk og kontraktile funktion af organet. Et sæt lokale felt fluorescensmikroskopi teknikker præsenteres her muliggør optagelsen af cellulære variabler i intakte hjerter. Identifikation mekanismer definerer hjertefunktion er kritisk i at forstå, hvordan hjertet fungerer under patologiske situationer.
Abstract
I hjertet, er molekylære signalering undersøgelser udføres sædvanligvis i isolerede myocytter. Men mange patologiske situationer såsom iskæmi og arrhytmier kan kun forstås fuldt ud i hele organniveau. Her præsenteres den spektroskopiske teknik lokale felt fluorescensmikroskopi (LFFM), der tillader måling af cellulære signaler i den intakte hjerte. Teknikken er baseret på en kombination af en Langendorff perfunderet hjerte og optiske fibre til at optage fluorescerende signaler. LFFM har forskellige anvendelser inden for kardiovaskulær fysiologi for at studere hjertet under normale og patologiske tilstande. Flere kardiale variabler kan overvåges ved hjælp af forskellige fluorescerende indikatorer. Disse omfatter cytosolisk [Ca2 +], intra-reticulum [Ca2 +] og membranpotentialer. De eksogene fluorescerende prober er begejstrede og den udsendte fluorescens detekteres med tre forskellige arrangementer af LFFM epifluorescens tekniks præsenteret i dette papir. De centrale forskelle mellem disse teknikker er den type lyskilde anvendes til excitation og på måde excitationslyset er moduleret. Den pulserende LFFM (PLFFM) anvender laser lysimpulser mens kontinuert bølge LFFM (CLFFM) anvender kontinuerlig laserlys til excitation. Endelig blev lysemitterende dioder (LED) anvendes som en tredje lyskilde. Denne ikke-kohærent arrangement kaldes pulseret LED fluorescensmikroskopi (PLEDFM).
Introduction
Hjertet er det centrale organ i det kardiovaskulære system. Hjertets kontraktion initieres af en stigning i intracellulær [Ca2 +]. Forholdet mellem elektrisk ophidselse og ændringer i intracellulær Ca2 + frigivelse er blevet historisk undersøgt i enzymatisk dissocierede celler 1, 2. Men hjerteceller er elektrisk, metabolisk og mekanisk koblet 3, 4. Når isoleret, myocytterne er ikke kun fysisk frakoblet, men myocytter fra forskellige lag blandes under dissociation fem. På trods af de enorme fordele, der er opstået fra studiet af isolerede celler under spænding clamp betingelser, 6, 7, 8 iboende karakter af hjertet som en elektrisk syncytium always rejser spørgsmålet om, hvordan funktionelt forskellige dissocieres celler fra de tilstedeværende i vævet 3.
I dette manuskript, beskriver vi de fremskridt, der er opnået i viden om hjerte-fysiologi ved brug af lokal felt fluorescens mikroskopi (LFFM) teknikker i ubeskadiget hjerte. LFFM bruger fluorescerende indikatorer til at måle flere fysiologiske variable såsom cytosolisk Ca2 +, reticulum (SR) intra Ca 2+ og membranpotentialet. Disse målinger kan opnås samtidigt og sammen med ventrikel tryk 9, 10, elektrokardiogrammer 9, elektriske aktionspotentialer (APS), ioniske aktuelle optagelser og flash fotolyse af bur forbindelser 4, 11. Desuden kan disse målinger opnås ved pacing det intakte hjerte ved højere frekvenser tætr til fysiologiske satser. Selvom flere artikler 9, 11, 12, 13, 14 er blevet offentliggjort af vores gruppe ved hjælp LFFM teknikker har formodning om tekniske kompleksitet, der er forbundet med denne teknik forhindret sin massive brug i at studere ex vivo fysiologiske fænomener i hjertet og andre organer.
Den LFFM teknik (figur 1) er baseret på epifluorescens målinger foretaget under anvendelse af en multimode optisk fiber i kontakt med vævet. Som enhver kontakt fluorescensimagografi teknik, den optiske opløsning afhænger af diameteren og den numeriske apertur (NA) af fiberen. En højere NA og mindre diameter af fiberen vil øge den rumlige opløsning af målingerne. NA'er og fiberdiametre kan variere fra 0,22 til 0,66, og fra 50 um til 1 mm. Ikrøl NA vil forbedre signal-støjforholdet (S / N) ved at acceptere fotoner ankommer fra et større rumvinkel. For at kunne fungere som en epifluorescens enhed, er lysstrålen fokuseret ind i den optiske fiber med en asfærisk linse eller et epifluorescens mål, hvor NA af linsen og fiberen kamp. Denne matching maksimerer energioverførsel for excitation og til opsamling tilbage fotonerne udsendes af fluoroforen.
For at ophidse de eksogene fluorescerende indikatorer indlæst i vævet, kan forskellige lyskilder og belysning modes udnyttes. Vores banebrydende undersøgelser under anvendelse af pulseret lokale område fluorescensmikroskopi 3, 12 (PLFFM) anvendte en billig picosekund laser (figur 1a, PLFFM). Denne type af lyskilde har den store fordel, spændende en stor brøkdel af fluoroforen molekyler under belysningen område uden væsentligt blegning farvestoffet grundden korte pulsvarigheder 12. Derudover er brugen af ultrakorte impulser muligt at vurdere fluorescenslevetiden af farvestoffet 12. Fluorescenslevetiden er en egenskab, der kan anvendes til at kvantificere den del af farvestofmolekyler bundet til Ca2 +. Desværre er den tidsmæssige rysten af impulserne og variationer i amplitude fra puls-til-puls begrænse anvendelsen af denne eksperimentelle strategi til tilfælde, hvor ændringen i fluorescens produceret af ligandbinding til farvestoffet er stor.
Kontinuerlig Wave (CW) lasere er normalt anvendes som den vigtigste lyskilde i LFFM (figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan løbende belyse væv eller kan ferroelectrically moduleres. Det ferroelektriske modulation af strålen at der genereres et mikrosekund lysimpulser. Denne modulation kan styres af ekstern hardware. Denne procedure reducerer ikke kun dramatisk than tidslige jittering af lysimpulser men tillader også blande bjælker af forskellige bølgelængder. Blandingen af bjælker gøres ved multipleksing stråler fra forskellige lasere. Som følge heraf kan flere farvestoffer med forskellige spektrale egenskaber exciteres til at udføre målinger af en række fysiologiske variable, for eksempel Rhod-2 for cytosolisk Ca2 +, MagFluo4 til intra-SR Ca2 + og di-8-ANEPPS for membranpotentiale.
Selvom lasere stede forskellige fordele som lyskilde i LFFM, kan andre typer af lyskilder anvendes, herunder lysemitterende dioder (LED). I dette tilfælde excitationslyskilden bestod af en InGaN LED (figur 1c, PLEDFM). I lysdioder, er fotoner spontant udsendes, når elektroner fra ledningsbåndet rekombinere med huller i valensbåndet. Forskellen med faststoflasere, er, at emissionen ikke er stimuleret af andre fotoner. Dette resulterer i en ikke-kohærent stråle oget bredere spektral emission til LED'er.
Der kan anvendes forskellige typer af høj LED'er. For AP optagelser med Di-8-ANEPPS og for Ca indspillet 2 + transienter hjælp Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, anvendte vi en LED, der har en typisk topemission ved 485 nm (blå) og en halv bredde på 20 nm (figur 1d). For Ca2 + transienter optaget med Rhod-2, LED havde en typisk peak emission ved 540 nm (grøn) og en halv bredde 35 nm (figur 1d). Lysdioder udsender i et band bølgelængde og derfor kræver filtre til at indskrænke deres spektrale emission. Desuden kan pulseret lys genereres ved en hastighed på 1,6 kHz med en varighed på 20 mikrosekunder. LED'erne blev pulseret med en hurtig effekt-MOSFET felteffekttransistor. Samtidige optagelser med forskellige indikatorer kan udføres ved tid-multipleksing lysdioderne. Desværre, lys udsendt af LED'erne er vanskeligere at fokusere på en fiberoptisk sammenlignet med en laserstråle. Således største ulempe ved osing lysdioder er, at deres emissionsprofiler har kantede forskydninger (± 15 °) fra hovedaksen, og en ekstra optik skal bruges til at rette det.
I alle de optiske konfigurationer tidligere beskrevne, er ekscitationslyset reflekteres ved hjælp af et dikroisk spejl. Strålen efterfølgende fokuseret af en asfærisk linse og en mikroskopobjektiv på en multimode fiber optik, der er placeret på vævet. Som i enhver epifluorescens arrangement, det dikroiske spejl tjener også til at adskille excitering fra det udsendte lys. Den udsendte lysspektrum rejser tilbage gennem en barriere filter til fjernelse af eventuelt reflekteret excitation. Endelig er det udsendte lys fokuseret med et mål på en fotodetektor (figur 1).
Transduktionen fra lys til elektrisk strøm udføres ved silicium avalanche fotodioder. Disse dioder har en hurtig respons og en høj følsomhed tillader detektering svagt lys. Detfotostrøm fremstillet af avalanche fotodioder kan amplificeres på to måder: a overføringsimpedansforstærker har en resistiv feedback-element (figur 1e) eller ved en integrator til at konvertere den nuværende til en spænding (fig 1f). Anvendelse af den første fremgangsmåde, udgangsspændingen er proportional med fotostrøm og feedback modstand. Et typisk eksempel på den resistive påvisning af picosekund laserimpulser er vist i figur 2a, 2b og 2c. Panel 2a viser outputtet af overføringsimpedansforstærker og panel 2b viser en tidsekspansion af intervallet angivet med en stjerne (*). En top sporing algoritme blev gennemført til påvisning af top (rød) og bunden (grøn) til de fluorescerende responser 12. Målingen af basen fluorescens giver oplysninger om både den mørke strøm af avalanche-fotodiode og interferenser indført ved omgivelsernes light og elektromagnetisk kobling. En repræsentation af toppe og baser er vist i figur 2c. Denne figur illustrerer fluorescens udsendt af farvestoffet (Rhod-2) bundet til Ca2 + under hjertecyklussen af et bankende parakit hjerte.
Ved den anden metode, udgangsspændingen af integratoren er en funktion af strømmen og kapacitive feedback (fig 2d, 2e og 2f). Figur 2f viser to på hinanden følgende integration cyklusser: den første med ingen ekstern belysning og den anden med påsat lysimpulser fra en pulseret LED. En detaljeret beskrivelse er vist i figur 2g og 2h. Denne fremgangsmåde, selv om mere besværlig, tilvejebringer et større S / N på grund af fraværet af termiske støj i feedback kondensator. Instrumentet har en timing fase, der genererer al den kontrol og multiplexing af excitationslyset og kommandoer hovedtrin integration og resET perioder. Dette er normalt udført med et digitalt signalbehandlingskredsløb, der også udfører en digital differentiering af det integrerede udgangssignal ved at beregne en on-line regression af data. I tilfælde af anvendelse af en resistiv feedback kan enhver A / D erhvervelse board anvendes.
Endelig vores LFFM teknik er meget alsidigt og kan tilpasses til at optage fra mere end én region. Tilføjelse af en stråledeler ind i strålegangen tillader os at spalte lyset i to optiske fibre. Hver optisk fiber kan derefter placeres på forskellige områder af et væv til, uafhængigt, excite og optage emission fra de eksogene fluorescerende prober. Denne modifikation tillader os at vurdere, hvor anatomiske regionale forskelle påvirke fysiologiske variable. Figur 3 viser en stråledeler, der anvendes til at opdele CW excitationslyset, således at to optiske fibre anvendes til at måle transmural elektrisk eller intracellulært [Ca2 +] niveauer with minor-invasiv. Transmurale signaler kan optages ved at anbringe én fiber på endokardiet og den anden på epicardiet lag af den ventrikulære væg. Derfor LFFM teknik har evnen til at måle tidsforløbet af cellulære signaler i forskellige regioner og kan anvendes til at teste om forekomme regionale ændringer under patologiske situationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol og alle musene håndtering blev godkendt af UC Merced Institutional Animal Care og brug Udvalg (nr 2008-201). Forsøg med parakitter blev gennemført i 1999 i henhold til de generelle politikker for brug af dyr oprettet af videnskabelige kommission af den venezuelanske Institut for Videnskabelig Forskning (Ivic).
1. Langendorff Set Up Forberedelse
- Forbered Tyrode-opløsning indeholdende følgende koncentrationer af opløst stof i mM: 140 NaCl, 5,4 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucose, 10 HEPES. Indstil pH af Tyrode-opløsning til 7,4 med NaOH og filtreres gennem et 0,22 um filter.
- Indlæse Tyrode-opløsning i 60 ml sprøjter og alle slanger af den vandrette Langendorff set-up 11, 12 er illustreret i figur 4. Sørg for at fjerne alle luftbobler.
- Tilslut plastrør til en O 2 tank.
- Tilføj en plastik Tee-adapter til at sænke en 5 "rør i Tyrode opløsningen i 60 ml sprøjte.
- Vedhæfte en plastik luft sten til slutningen af den 5 "rør så O 2 vil boble ud i Tyrode-opløsning.
- Placer en ikke-absorberbar kirurgisk sutur omkring en nål anvendt som en kanyle. Nålen er koblet til manifolden (se figur 4), der tillader retro-perfusion med forskellige løsninger. Endelig vil hjertets aorta være kanylerede ind i nålen.
2. Animal Forberedelse og Heart Dissection
- Afvejes og injicere mus med heparin (tidl. Mouse vægt 20 g, injicere med 20 enheder eller 200 ul) 15 min før euthanizing ved cervikal dislokation. Bedøver parakitter henhold to Benyttelsen dyr guider for dit IACUC protokollen og derefter fortsætte med cervikal dislokation.
BEMÆRK: Brug 8 uger gamle mus eller 20 g parakitter. - Tag hjertet fra brysthulen efter euthanization. Uddrag parakeet hjerter på nøjagtig samme måde som beskrevet for mus.
- Rengør musen brystet med ethanol.
- Brug af dissektion saks, lave et snit i underlivet og derefter skåret op i siderne mod halsen.
- Træk snittet væv og pin det ned.
- Skær membranen. Vær forsigtig, når der skæres membranen for at undgå at beskadige hjertet.
- Fjern lungerne og omgivende væv.
- Brug en pincet til at øse hjertet uden at klemme den. Skær aorta så længe som muligt.
- Transportere hjertet på en lille vejebåd med ca. 1 ml Tyrode-opløsning.
- Ved hjælp af en ikke-absorberbar kirurgisk sutur, binde aorta på den vandrette Langendorff apparatet via ennål. Bind hjerte aorta ved hjælp af to fine pincet. Begynd retro-perfusion ved at åbne ventilen beliggende i serie med 60 ml sprøjter indeholdende Tyrode-opløsning.
- Tillad hjertet til at stabilisere i 10 minutter. Brug denne tid til at rense blodet og fedtvævet omgiver hjertet, før du lægger farvestoffet. Træk fedtvævet nær bunden af hjertet med pincet og skæres ved hjælp af små dissektion saks. Sørg for at gøre dette under visningen af et dissektionsmikroskop.
3. Cytosoliske Ca 2 + Mål: Forberedelse Dye Rhod-02:00
- Tilsæt 20 pi af 20% pluronic (et ikke-ionisk overfladeaktivt middel) i DMSO til en særlig emballeret plast hætteglas leveres af farvestoffet fabrikanten indeholdende 50 ug af farvestoffet.
- Bland ved pipettering op og ned, så man undgår bobler.
- Overfør den blandede DMSO med ikke-ioniske overfladeaktive middel og farvestoffet fra den særlige emballerede plast hætteglas i et klart hætteglas. Tilsæt 1 ml af Tyrode Solution til den klart hætteglas.
- Sonikeres i 15-20 min i et bad-sonikator.
- Perfundere farvestoffet ved hjælp peristaltiske pumper i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Placer farvestoffet i farvestoffet kammeret.
- En mekanisk klemme til at komprimere alle de andre tubing, der er tilsluttet til manifolden. Klemmen er placeret over manifolden. Dette vil forhindre enhver tilbagestrømning i rørledningen forbundet til de 60 ml sprøjter.
- Tænd perfusion peristaltisk pumpe til at begynde cirkulerende farvestoffet. Umiddelbart lukke 3-vejs ventil under 60 ml sprøjte.
- Placere et lille rør, der er forbundet til suge- peristaltisk pumpe ud for hjertet at recirkulere farvestoffet, der er blevet perfunderet ind i hjertet.
4. Intra-SR Ca 2 + Mål: Forberedelse Dye Mag-Fluo4AM
- Forbered Mag-Fluo4AM på samme måde som Rhod-02:00. Se afsnit 3 for trinvise instruktioner.
- after indlæsning af farvestoffet, åbne ventilen placeret i serie med de 60 ml sprøjter indeholdende Tyrode løsning til at begynde retro-perfusion. Sørg for at fjerne klemmen over manifolden.
- Tilføj Tyrode-opløsning til det vandrette kammer og varme op til 37 ° C.
- Retro-perfundere med Tyrode-opløsning i 45 minutter til fjernelse af cytosoliske farvestof.
5. membranpotentialet Mål: Forberedelse Dye Di-8-ANEPPS
- Der tilsættes 5 ml 99% ethanol til farvestoffet hætteglas, der indeholder 5 mg af farvestoffet.
- Alikvot 10 pi i 500 individuelle 1 ml plastik hætteglas ved anvendelse af en repeater pipette.
- Tørre ud i en fart vakuum og opbevares ved -20 ° C.
- Tilsæt 20 pi 20% pluronic i DMSO til en plastik hætteglas med 10 ug af den udtørrede farvestof.
- Bland ved pipettering op og ned, så man undgår bobler.
- Overfør blandingen indeholdende DMSO med pluronic og farvestof fra plasten hætteglas til en gradueret cylinder (10 ml). Tilføj Tyrode-opløsning til en endelig voLume på 5 ml.
- Sonikeres for 20-25 min i et bad sonikator.
- Perfundere ind i hjertet i 30 minutter under anvendelse af peristaltiske pumper. Se trinvise instruktioner i afsnit 3.5.
6. Optagelse Epikardielle Signaler
- Efter indlæsning farvestoffet, retro-perfundere hjertet med Tyrode løsning ved at fjerne klemmen over manifolden. Åbn ventilen beliggende i serie med 60 ml sprøjte indeholdende Tyrode opløsning. Retro-perfundere Tyrode-opløsning i 10 minutter for at stabilisere hjertet.
- Fyld den vandrette kammer med Tyrode-opløsning og tænd for peltier enhed for at bringe badtemperaturen til 37 ° C.
- Placer optiske fibre på overfladen af hjertet.
- Placer fiberoptiske inde i en 2 ml pipette og derefter vedhæfte pipetten til en mikromanipulator.
- Brug mikromanipulator til lidt tryk på optiske fiber mod overfladen af LV.
- Eksternt pace heart med en stimulator styres af en bølgegenerator.
- Programmere bølgegeneratoren at tilvejebringe en firkantet impuls med en bredde på 1 ms.
- Indstil stimulator skal eksternt synkroniseret og tilslut den eksterne indgang til den bølge generator.
- Til hver udgang af stimulatoren, tilslutte en ledning med en akupunktur nål loddet i slutningen.
- Placere begge akupunktur nåle i hjertespidsen ca. 3 mm fra hinanden.
- Først efter at nålene er placeret i vævet, tænde for produktionen af stimulatoren for at forhindre elektrisk stød.
- I købet software, justere erhvervelse frekvens til 10 kHz.
7. Optagelse endokardial Signaler
- Se trin 6.1 og 6.2 for at stabilisere hjertet efter indlæsning farvestoffet.
- Ved hjælp af en skarp 23Ga punkt om størrelsen af den fiberoptiske, lave et lille hul i overfladen af hjertet på LV nær septum. <li> Placer en intravitrealt kirurgi sklerotomi adapter til at hjælpe med at placere den første fiberoptiske i endokardiet ved hjælp af en mikromanipulator.
- Eksternt tempo hjertet. Se trin 6.4.
- I erhvervelse software, justere erhvervelse frekvens til 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AP og Ca2 + transienter i endokardiet og epicardium
For at sammenligne signaler på tværs af ventrikulære væg, er en fiberoptisk beliggenhed i endokardiet og den anden i epicardiet. Sammenligning morfologien af en AP registreret fra endokardiet med en fra epicardiet er den bedste måde at vurdere transmural funktion. Den ventrikulære væg er stærkt heterogen og således, morfologien af APs er meget forskellige i disse to regioner. Det er velkendt, at endokardiet har mindre I end epicardiet 17, 18, 19. Jo mindre jeg til gør repolarisering af fase 1 langsommere i endokardium 18, 20. Figur 5b shOWS en typisk optisk registrering af AP fra endokardiet og epicardiet. For at udføre disse optagelser blev mus hjerter fyldt med de potentiometrisk farvestof di-8-ANEPPS og fluorescens blev målt under anvendelse af CLFFM teknik. Morfologien af det optisk registreres AP, navnlig i fase 1, viser en langsommere tidsforløb for endokardiet (aktionspotentialets varighed (APD) 30 er 8,01 ms ± 2,5) i forhold til epikardiet (3,4 ms ± 0,59) (figur 5b). I almindelighed kan APD beskrives som den tid det tager AP at repolarisere en vis procentdel 30., 70 eller 90 (figur 5a). Disse spor er blevet normaliseret, og skiftede til at have overlappende fase 0. Ved sammenligning af APD (figur 5c), ser vi, at endokardiet og epicardium er signifikant forskellige i fase 1. Selv om disse APs er fluorescens-signaler, de kan kalibreres til en specifik membranpotentiale ved samtidig måling AP med enskarp mikroelektrode fyldt med 3M KCI 13.
Foruden membranpotentiale, kan exogene fluorescerende indikatorer anvendes til at overvåge intracellulært [Ca2 +]. Typisk anvender vi Rhod-02:00 til måling intracellulære Ca2 + transienter på grund af sin høje dynamikområde og dets evne til at forblive i cytosolen selv ved fysiologiske temperaturer. Figur 6b viser en typisk registrering af de intracellulære Ca2 + transienter i endokardiet og epicardium lag. Disse resultater er blevet delvist offentliggjort 15. For at kunne sammenligne regionale forskelle i det intracellulære [Ca2 +] niveauer, kinetikken af Ca2 + transienter blev vurderet (figur 6a). Samlet analyse af Ca 2+ forbigående kinetik (Figur 6C) viser, at de Ca 2 + transienter fra endokardiet havde signifidet, der kendes langsommere kinetik end dem optaget fra epicardium.
Ca 2 + dynamik i SR lumen
I hjertet, storhed og fald af intracellulært [Ca 2+] niveauer er afgørende at definere mange fysiologiske variabler, herunder tryk, kontraktilitet, og handling potentiale varighed (APD). Det foregående afsnit beskrev vores evne til at måle cytosoliske Ca 2 + transienter. Ca2 + frigivet fra SR er i høj grad ansvarlig for stigningen i intracellulære cytosoliske Ca 2+. Således for hver stigning i intracellulær Ca2 + der er en Ca2 + udtynding i SR. Imidlertid cytosoliske Ca2 + transienter er ikke udelukkende skyldes SR Ca2 + release, men også omfatte Ca 2+ kommer ind i cellen gennem plasmamembranen. vores laboratorium16 har været i stand til at vurdere SR Ca2 + indhold ved anvendelse af et fluorescerende farvestof, Mag-Fluo-04:00. Selv om dette farvestof er de-esterificeres i myoplasm og SR, kan myocytterne ekstrudere den cytosoliske fraktion. Dette farvestof ekstrudering kan fremmes ved blot at forøge temperaturen til 37 ° C. Ved denne temperatur er den cytosoliske farvestof fjernet ved en ATP-bindende kassette som membranprotein. Heldigvis er dette protein er ikke til stede i SR-membran. Derfor, efter forøgelse af temperaturen til 37 ° C, fluorescensen optaget med PLFFM teknik er hovedsagelig et resultat af Ca2 + binding til farvestoffet i SR. For at teste specificiteten af organel måling blev en koffein impuls, stimulere Ca2 + udslip gennem RyR. Det er muligt at observere, at signalet er faktisk et resultat af SR depletion (figur 7). Den koffein inducerede SR Ca 2+ frigivelse (Figur 7a) Producerer både et fald i diastolisk niveau af Mag-Fluo-4-fluorescens (92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012)) og et fald i amplituden af Ca2 + transienter (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Intra SR spor optaget før og efter koffein stimulus er repræsenteret nedad i figur 7b-7d. Som tiden skrider frem fra koffein stimulus, amplitude af SR depletion er mindre. Figur 7e viser, at SR depletion ikke kun inducerer et fald i amplituden af Ca2 + signal, men sinker SR Ca2 + release proces også. Fluorescensen spor i figur 7a er tidligere blevet offentliggjort 15..
Pulserende LED: Action potentialer
I figur 5 viste vi, at Di-8-ANEPPS kan indberette ændringeri membranpotentialet når det exciteres ved 532 nm. Under denne excitation tilstand, der er et fald af den udsendte fluorescens ved bølgelængder på over 590 nm. Interessant, når denne potentiometrisk farvestof er spændt tæt på sin maksimale excitationsbølgelængde (~ 476 nm), fluorescensemissionen af farvestoffet skifter til lavere bølgelængder når membranen depolariserer. Derfor er dette spektrale skift tillader os at optage den udsendte fluorescens ved to forskellige bølgelængder. Denne spektrale egenskab af Di-8-ANEPPS tillader rationering af den udsendte fluorescens måles i to forskellige bølgelængder, en funktion, der normalt er af stor værdi, fordi den endelige beregnede optagelse vil være uafhængigt af koncentrationen farvestoffet i membranen. For at drage fuld fordel af Di-8-ANEPPS spektral skift, vi brugte pulserede lysdioder som lyskilde. Vi brugte pulserende blå lys til at ophidse fluoroforen. Excitation blev udført ved 485 nm, tæt på toppen absorptionsbølgelængde af Di-8-ANEPPS (~ 476 nm). Erhvervelse i to forskellige emission spektroskopiske bands giver forholdet dannelse og evnen til at øge S / N og afvise common mode støj ligesom omgivende lys og bevægelse artefakt i ordregivende hjerter, hvor den mekaniske afkobler Blebbistatin ikke har været anvendt. Denne situation er meget vigtigt for eksperimentelle betingelser, hvor både mekaniske aktivitet i hjertet og kinetikken for Ca2 + transienter skal måles samtidigt.
Timingen diagram af PLEDFM er illustreret i figur 8a. Diagrammet omfatter styrelogikken for integration og nulstilling af fotodetekteringsorganet hovedtrin, on-off timingen af LED og analog-til-digital konvertering. Under tidsforløbet for en AP, den detekteret i det grønne bølgelængdebånd fluorescens viser en stigning i intensitet, medens detekteret i det røde bånd fluorescens reduceres. Figur 8B viserat ændringen af fluorescenssignalet produceret af membrandepolarisering bevæger sig i forskellige retninger. Imidlertid er bevægelsesartefakter produceres af hjertet sammentrækning altid orienteret i samme retning, uafhængigt af emissionsbølgelængden. Som forklaret før, skal data fra begge kanaler (grøn og rød) være software-condition før beregning af forholdet. Konditionering omfatter offset og få rettelser. Udvælgelsen af offset og vinde niveau korrektioner er ikke automatisk. Brugeren af software har til at vælge de variabler til konditionering af spor, før forholdet. Den resulterende forhold i panel 8b (figur 8) viser, at artefakt indført ved myocardial bevægelse har annulleret.
Den relative ændring af di-8-ANEPPS fluorescens under en AP er normalt meget lille (~ 8% pr 100 mV). Denne di-8-ANEPPS fluorescensændring er meget mindre end den produceret af Ca2 + binding eng til Rhod-2 (<200%). Således, for at forøge signal-støjforholdet af di-8-ANEPPS, flere optagelser kan beregnes.
Pulserende LED: Samtidige optagelser af Ca 2+ og membranpotentiale
Den sidste mål ved hjælp af denne eksperimentelle tilgang består i at udføre samtidige optagelser af Ca 2 + transienter og AP'er. Samtidige optagelser af multiple fysiologiske signaler kræver løsning af tekniske vanskeligheder i forbindelse med forskellige aspekter af systemet herunder: kobling af lyskilden med den optiske fiber, der matcher absorptionsspektret af farvestoffet med emissionen af LED'erne, designe analoge og digitale elektroniske kredsløb til generere timingen og erhvervelse samt udviklingen af hurtige software til at analysere data online.
I our undersøgelse, udvælgelse af farvestoffer afhang af deres spektrale karakteristika. Flourophores bruges til at måle forskellige signaler skal absorbere i forskellige spektrale bånd. Denne betingelse er vigtigt at skelne mellem signalkilder. Hver gang en LED har en forskellig bølgelængde anvendes til at excitere vævet, fluorescensen detekteret svarer til signalet relateret med farvestoffet, der absorberer i nævnte bølgelængde. På denne måde fluorescensemission fra forskellige farvestoffer, men i samme bølgelængdebånd, kan skelnes ved det tidspunkt, hvor hver enkelt er spændt.
Ikke desto mindre er krydstale mellem farvestof spektre kan ikke helt undgås. Dette skyldes de spektrale absorptionsegenskaber farvestofferne gør dem absorbere lys med bølgelængder langt i forhold til toppunktet absorption. I vores forsøg blev krydstale frembragt på begge måder: (1) Rhod-2 bliver exciteret af den blå lysdiode, der tilføjer en Ca2 + signal til den røde Channel AP spor, og (2) Di-8-ANEPPS bliver ophidset af den grønne LED, der vises på Ca 2 + forbigående signal (figur 9f). Denne krydstale kan korrigeres on-line, som illustreret i figur 9. Proceduren virker, fordi den indtrængende signal er en lille procentdel af det signal, der skal måles. Endelig giver denne type af algebraisk bearbejdning af -fluorescens fra farvestofferne tilladt os at separere AP (fig 9d) danner Ca2 + transienter (figur 9H). En detaljeret oversigt over denne behandling er beskrevet i figuren legende. Det er vigtigt at bemærke, at alle de Pulserende LED forsøg udførtes en 28 ° C.
Figur 1: Lokal Field Fluorescens mikroskopi (LFFM). Det LFFM består af et epifluorescens arrangementanvendelse af en multimode optisk fiber, der er i kontakt med vævet at registrere fluorescens udsendt fra exogene farvestoffer perfunderet ind i hjertet. Den LFFM set-up kan bruge tre forskellige lyskilder, herunder (a) PLFFM, hvor excitationslys leveres af en pulserende pico Nd-Yag laser; (B) CLFFM, hvor kontinuert-bølge-lasere anvendes og lysimpulser genereres af en ferroelektrisk modulator tillader multiplexing af lasere med forskellige bølgelængder; og (c) PLEDFM, hvor lysdioder har bredere emission spektre med peak emissioner af (d) 485 nm og 540 nm for blå og grønne lysdioder henholdsvis elektronisk pulserende. Når der anvendes laserkilder, er strålen defocused af en stråleudvider. Endelig dikroiske spejle og objektive linser fokuserer strålen på fiberoptiske distale ende, som er lidt presses mod vævet. Det udsendte lys bevæger tilbage gennem samme fiberoptiske, dikroisk spejl, emission filtre, og fokuseres på en avalanche-fotodiode, hvor fotoner omdannes til en elektrisk strøm. Den nuværende kan forstærkes af to metoder (e) overføringsimpedansforstærker, hvor den resulterende udgangsspænding er proportional med fotostrøm og feedback modstand; (F) integrator, hvor udgangsspændingen er en funktion af strømmen og kapacitive feedback. Endelig er det signal erhvervet af en A / D-konverter og vises på en computer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Resistive og Kapacitive konvertering. (A) Et typisk eksempel på den resistive påvisning af picosekund laserimpulser er vist. Stjernen (b)viser en tid ekspanderet interval, hvor en peak sporing algoritme blev gennemført til påvisning af top (rød) og bunden (grøn). (C) En repræsentation af spor beregnet fra toppe og baser optagelser er vist for Rhod-2 fluorescerende responser i et bankende hjerte parakit eksternt tempo på 7 Hz og badtemperaturen indstilles til 37 ° C. d til h) fotostrøm omdannes ved en integrator ved anvendelse af en kapacitiv tilbagekobling. Typiske optagelser af intakt muse hjerte Ca2 + transienter er vist i to forskellige tidsskalaer (D og E). (F) Integrationen af to på hinanden følgende cyklusser med og uden LED-belysning vises. Integralet af signalet stiger lineært som fotostrømmen oplader feedback kondensator. Hældningen af den tidsafhængige integral (tan (Ɵ)) er proportional med antallet af fotoner der påvirker lavine junction foruden den elektron-hul rekombination induceret af phononic aktivitet, når den lavine diode registrerer ikke nogen fotoner. De digitale signaler styrer hovedtrin integration og reset perioder er vist i panelet g. Signaler fundet under ikke- lysende (DC) og LED lysende periode (F) fremgår panel h. Den subtraktion af F og DC giver den faktiske måling af fluorescens detekteret Ca2 + transienter fra mus hjerter eksternt paced 9 Hz ved 37 ° C (h). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: LFFM for epicardium og endokardium Målinger. Den CLFFM opsætning blev anvendt til at måle fluorescens udsendt fra exogene fluorescerende farvestoffer er til stede i epicardiet end endocardium lag. Tilsætningen af en stråledeler lettet optagelsen af forskellige fysiologiske variable i epicardium og endokardium. To fiber optik blev brugt med deres individuelle headstages at opdage fra epicardium og endokardium. En lille rund snit blev lavet i ventriklen og en fiberoptisk blev ført gennem at optage fra endokardiet. Denne opsætning bruges en strøm-til-spænding konverter med en resistiv feedback. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Vandret kammer med Temperature Control. Et diagram, der viser Langendorff opsætningen hvor intakte hjerter opretholdes funktionelle for timer. Hjertet er bundet til en nål, gennem hvilken alle opløsninger og farvestofferer retro-perfunderet ind i hjertet via blodpropper forgrening aorta. Kammeret er placeret over en peltier enhed at bibeholde temperaturen af badet, som læses af en temperaturføler forbundet til et voltmeter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Transmural Action Potentielle Målinger i intakte hjerter. (A) Action potentiel varighed (APD) er vurderet som den tid, det tager at fuldføre 30%, 70%, eller 90% af AP repolarisering. (B) Di-8-ANEPPS fluorescens fra epicardiet (sort) og endokardiet (grå) viser AP morfologiske forskelle i repolarisering mellem de to lag af den ventrikulære væg. (C) Efter at have vurderet than APD 30, 70, og 90 i endokardium og epicardium, viste resultaterne kun signifikante forskelle forekom i APD 30 (8 ± 2,5 ms endokardium vs 3 ± 0,6 ms epicardium). Hjerter blev pacet ved 6 Hz og temperaturen indstilles til 37 ° C. Data er gennemsnit ± SEM af 5 hjerter. * P <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Transmural Ca 2+ Transiente Målinger i intakte hjerter. (A) Parametre af Ca 2 + forbigående kinetik måles, er: den tid, det tager at nå maksimum, tid til at toppe (TP); den tid det tager at gå fra 10% til 90% af stigningen, stigetid (RT); den tid det tager at gå fra 10% til 90% af henfald, henfaldstid (DT); ogtid, det tager at gennemføre 50% af transienten, halv varighed (HD). (B) fluorescens udsendt af Rhod 2 efter excitation med en grøn CW laser Vis epikardium (sort) og endocardium (grå) Ca2 + transienter med forskelle i afslapning. c) Ca 2 + transienter fra endokardiet havde signifikant langsommere kinetik i RT, TP, HD, og DT end optaget fra epicardium. Hjerter blev pacet ved 6 Hz og temperaturen indstilles til 37 ° C. Data er gennemsnit ± SEM af 5 hjerter. * P <0,05. Modificeret fra Mattiazzi et al. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Intra SR Ca 2+ Målinger i intakte hjerter.(A) Den udsendte fluorescens fra Mag-Fluo-4 farvestof dråber over tid, hvilket afspejler et fald i SR Ca2 + -koncentration intra. (B) Den udvidede afbildning af faldet i Mag-Fluo 4 fluorescens indikerer Ca2 + depletion induceret af Ca 2+ frigivelse fra SR. (C) et ekspanderet billede af faldet i forbigående amplitude fra Mag-Fluo 4 fluorescens repræsenterer Ca 2+ frigivelse modificeret ved perfusion hjerter med 20 mM koffein. (D) Efter en lang anvendelse af koffein, et fald i både det diastoliske niveau af Mag-Fluo-4-fluorescens og i amplituden af Ca2 + transienter [ned til 92 ± 0,05% (N = 4, P = 0,012) og observeres 51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003) af de oprindelige værdier, henholdsvis],. Som mere tiden skrider frem fra koffein, jo mindre bliver amplituden af SR depletion. (E) Normaliserede spor i bd viser, at SR udtynding ikke kun fremkaldes aftager af Ca2 + signal, men også sinker SR Ca2 + genopfyldning. Hjerter blev pacet ved 4 Hz og temperaturen indstilles til 37 ° C. Fluorescens spor er fra Kornyeyev et al. 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: ratiometrisk Målinger af APs i intakte hjerter med Pulserende LED. (A) Timingen diagram herunder integration og reset af hovedtrin, on-off tidspunkter af LED og en egentlige optagelse er illustreret. (B) spor fra de to kanaler har forskellige hvilende værdier og forskydningen korrigeres ved at bevæge håndtagene, indtil hver AP forudgås af en hvilende værdi. Gevinst på hver kanal er også adjusted. Bemærk, at en meget stor bevægelsesartefakt vises på begge kanaler mellem de to depolariseringer. Når softwaren bearbejder signalerne ratiometrically, er resultatet en AP uden mærkbare artefakter (blå). Hjerter blev pacet ved 3 Hz og temperaturen indstilles til 28 ° C. Alle de viste poster er et gennemsnit af 10 spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Samtidige Ca 2 + transienter og AP Målinger i intakte hjerter med Pulserende LED. Den krydstale forurening af signaler, når du optager både Ca 2+ og AP kan korrigeres online. Den potentiometrisk farvestof, di-8-ANEPPS, er begejstret med 20 mikrosekunder blå LED pulser (a). Signaler er split, filtreret med bandpass røde og grønne filtre. Disse signaler detekteres af to forskellige avalanche fotodioder angivet som den røde (b) og grønne kanal (c). Det er muligt at observere, at begge signaler, rød og grøn, præsentere en mærkbar bevægelse artefakt, der vises som en nedadgående afbøjning. Begge signaler, rød og grøn, er offseted og derefter forstærkes. De konditionerede signaler anvendes til at beregne forholdet mellem dem og resultatet er vist i d. Det er muligt at observere, at i forholdet mellem de to signaler (d) de bevægelige artefakter der annulleres. Panel e illustrerer sekvensen af logiske impulser, der styrer en grøn emitterende LED anvendes til at excitere Ca2 + indikator Rhod-2. Fluorescerende signaler opnået ved hjælp af denne procedure er vist i f. Selv spor i f viser hovedsagelig en stigning i fluorescenssignalet grund Ca2 + binding eng til Rhod-2, er det også muligt at observere en negativ afbøjning i sporet på grund af en fluorescens detekteret signal fra Di-8-ANEPPS, når dette farvestof exciteres med grønt lys. Dette problem kan afhjælpes ved at subtrahere potentiometrisk signal vist i g. Resultatet af subtraktionen er vist i panel h, hvor en Ca2 + signalere fri for opnås en AP forurening. Hjerter blev pacet ved 3 Hz og temperaturen indstilles til 28 ° C. Alle de viste poster er et gennemsnit af 10 spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir er centreret i beskriver lokale område fluorescensteknikker at evaluere funktionen af hjertemyocytter ex vivo. Undersøgelsen af disse celler i en koblet miljø er ikke kun mere fysiologisk, men er også meget egnet til vurdering orgel-level patologier. De cellulære begivenheder underliggende excitation-kontraktion kobling (ECC) kan evalueres ved hele organniveau med anvendelsen af molekylære prober, der overvåger intracellulær Ca2 + dynamics (Rhod 2 cytosoliske Ca2 +, Mag-Fluo4 SR Ca2 +) og elektriske aktivitet (di-8-ANEPPS). Her har vi præsenteret tre LFFM epifluorescens teknikker, både begejstrer og indsamle emissionen fra fluorescerende indikatorer anvender optiske fibre. De varierer baseret på den anvendte lyskilde og typen af lys modulation. Den PLFFM bruger en laser, der pulser lys, CLFFM anvender fortløbende laserlys, mens LEDFM anvender lysdioder, der også kan pulseret i PLEDFM. Alle disseer præsenteret i figur 1 som et sæt, men kan være konstrueret med kun en af de tre epifluorescens ordninger. Desuden kan det detekterede lys behandles på forskellige måder. For eksempel illustrerer figur 2 to forskellige situationer, hvor fotostrømmen kan være enten integreret eller omdannes direkte til en spænding ved hjælp af en strøm-til-spænding konverter. I almindelighed kan LFFM fremgangsmåde anvendes til samtidigt at måle flere anatomiske steder, som det ses for figur 3.
Fremgangsmåden præsenteres her til vurdering kardiale egenskaber ved den intakte organ niveau er mere hensigtsmæssig til at undersøge problemer, hvor koblingen mellem celler er kritisk i fastlæggelsen adfærd vævet. Den iboende heterogenitet af hjertet kan producere forskellige AP bølgeformer 13, 21, 22 baseret på den specifikke væv, hvorfra ceLLS stammer. Derfor helorgan undersøgelser giver mulighed for at vurdere den lokale fysiologiske funktion af cellen i forskellige anatomiske strukturer. Desuden har vi set, at intracellulære begivenheder som gnister og bølger har forskellige kinetik i dissocierede celler end i den intakte organ 15.
Langendorff set-up (figur 4) er kritisk for opretholdelsen hjertet i en situation, der er tættere på in vivo. Derudover giver det den retroperfusion af flere medikamenter og forskellige fluorescerende molekylære prober, der tillader målingen af adskillige fysiologiske variable. Ændring af exogene fluorescerende prober anvendt, øge størrelsen af den fiberoptiske, eller vælge en anden lyskilde kan dramatisk ændre anvendelsen af teknikken. Derudover kan peltier enhed under vandret kammer lette undersøgelsen af Ca2 + dynamik ved forskellige temperaturer. Tilføjelse tilbehørat LFFM såsom en stråledeler kan øge antallet af fiberoptik, der anvendes til at optage fra forskellige regioner i den intakte hjerte. Dette er en meget nyttig tilpasning at teste om forekommer regionale forskelle i patologiske situationer. Figur 3 viser endokardiet og epicardium blive vurderet på samme tid. Desuden perfusion af hjerte med forskellige agonister giver os mulighed for at forstå, hvordan de forskellige regioner i hele ventrikulære væg er reguleret. Den elektriske signalering (figur 5) og Ca 2+ kinetisk (figur 6) heterogene kan sammenlignes på epicardium og endokardium. Derudover kan flere farvestoffer med forskellige excitationsbølgelængder og emissionsfiltre anvendes. For eksempel ved anvendelse af Mag-Fluo-4, Ca2 + niveauer i lumen af SR kan optages (figur 7). At variere størrelsen af den fiberoptiske kan også udvide kapaciteten af denne metode ved at tillade den fluorescerende optagelse fra en larGER-regionen.
Dette papir viser også, at bortset fra dyre lasere, kan lysdioder anvendes som en excitationslyskilde i vores teknik. Figur 8 viser, at denne billige type lyskilde kan anvendes til ratiometrically måle AP'er. Den ratiometriske måling vist i figur 8 er fordelagtig ved fremstilling af en endelig optagelse uden eksperimentelle artefakter herunder dem forårsaget af bevægelse. Endelig kan endda Ca2 + forbigående og AP blive optisk registreres samtidigt ved at multiplekse forskellige bølgelængder og ved hjælp farvestoffer med samme emissionsspektre. Behandlingen af signaler skitseret i figur 9 er kritisk at fjerne intern kontaminering produceret af overlapningen i emissionsspektre af farvestofferne. Optagelse Ca 2 + transienter og AP'er, samtidigt, men som to selvstændige udgangssignaler er gavnligt i at studere ECC og Ca2 + -induceret Ca 2+
LFFM er en teknik med flere applikationer i cellulær fysiologi af intakte væv. , En stor begrænsning er imidlertid, at de registrerede fluorescens er et gennemsnit af emissionen fra de underliggende fluorescerende indikatorer i den lokale region, hvor den optiske fiber er i kontakt med vævet. Selv når der anvendes to optiske fibre, går LFFM ikke en subcellulær rumlige fordeling af de målte signaler. Optisk mapping er en bedre teknik til overvågning fysiologiske variable, som ændrer i rum og tid, såsom udbredelsen af AP, Ca 2 + transienter, og alternans 23, 24, 25. LFFM er også ude af stand til at tilvejebringe billeddannelse af strukturer, ligesom konfokal mikroskopi og andre optiske kortlægningsteknikker. Ikke desto mindre er dens brug af fiber optik gør det praktisk i rOptagelse lokale fluorescenssignaler fra endokardiet eller andre regioner, der er vanskelige eller umulige at adgang i en intakt hjerte med et konfokalt mikroskop.
Sammenligningen mellem fysiologiske variable opnået fra intakte hjerter og fra isolerede myocyt eksperimenter er udfordrende. Den største fordel ved at anvende isolerede hjertemyocytter er den unikke mulighed for at evaluere biofysiske egenskaber af cellerne under patch clamp betingelser. I modsætning hertil LFFM tillader studiet af fysiologiske og patologiske fænomen i en mere native miljø. For eksempel, i intakte hjerter kan vi vurdere transmurale forskelle 15, hjertefrekvens afhængighed af AP og Ca2 + ved fysiologisk spænder 13, som er uopnåelige i isolerede celler. Desuden kan vi undersøge virkningerne af en iskæmisk insult på funktionen af det intakte hjerte 9, 10. Hele hjerte exmenterne også tillade os at vurdere samspillet mellem andre celletyper og myocytter 11.
LFFM tillader visualisering af cellulære signaler ved det intakte hjerte niveau, hvor celler har fysiologisk kobling. LFFM tillader studiet af intracellulære aktivitet, mens celler er stadig i det intakte organ. I kombination med fluorescerende farvestoffer og epiluminescence kan LFFM overvåge to centrale hjerte-egenskaber: Ca 2+ dynamik og elektrisk aktivitet.
Endelig kan metoden præsenteres her har flere anvendelser i studiet af ECC. Det er et værktøj, der afslører, hvordan supramolekylær signaler påvirkes i patologiske situationer som arytmier 16 og iskæmi 9, 15. Denne teknik er et must at studere disse patologier, da de kun kan forstås på den intakte organ niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Alicia Mattiazzi for kritisk diskussion af det præsenterede arbejde. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01 HL-084.487) til ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
