Introduction
مرض الزهايمر (م) هو الشكل الأكثر شيوعا من الخرف ويصيب حوالي 35 مليون شخص في جميع أنحاء العالم 1. بصمات عصبية مرضية من مرض يعتقد على نطاق واسع تكمن في جوهر م المرضية هي التشابك الليفي العصبي بين الخلايا من hyperphosphorylated بروتين تاو 2 ولويحات خارج الخلية التي تتكون من (Aβ) الببتيد 3 المجمعة اميلويد بيتا. وتماشيا مع هذا، وقد تم مؤخرا شملت تقييم أمراض الترسبات في الجسم الحي من المؤشرات الحيوية في المعايير البحوث التشخيصية لمدة 4 م. لقياس السائل النخاعي من Aβ 1-42، هي عدة المناعية المتاحة وتستخدم في العديد من المختبرات السريرية 5. تركيز Aβ 1-42 في السائل النخاعي هو أقل ما يقرب من 50٪ في المرضى ميلادي مما كانت عليه في كبار السن الطبيعي معرفيا، مما يعكس ترسب الببتيد في لويحات رعين 6 و 7.
ويتم تحليل هذه المؤشرات الحيوية بشكل رئيسي باستخدام المناعية (أي التقنيات المعتمدة الضد)، ولكن قد تتأثر هذه المقايسات من الآثار مصفوفة 8. استخدام المناعية على منصات التكنولوجيا المختلفة وعدم وجود فحص التقييس 9، 10 يجعل إدخال العالمية تركيزات قطع الصعبة 11 و 12. ومن شأن RMP التحقق من صحة تحليلي تسمح معايرة موحدة للمنصات فحص مختلفة، مما أدى مثالي في المقارنة أفضل عبر منصات التحليلية وفي تحسين السيطرة على العوامل التي تساهم في تقلب قياس العام.
الكمي المطلق للAβ 1-42 باستخدام ضعت طريقة LC-MS / MS يتغلب على العديد من القضايا المرتبطة ميتاليك القائم على الأجسام المضادةiques. سيتم استخدام طريقة، على النحو الوارد في الشرطة العسكرية الملكية من قبل اللجنة المشتركة للتتبع في طب المختبرات (JCTLM قاعدة بيانات تحديد عدد C11RMP9)، لتحديد تركيز المطلق للAβ 1-42 في المراجع معتمد (CRM) لتنسيق CSF Aβ 1 قياسات -42 عبر تقنيات ومناهج تحليلية. وينبغي أن يكون سير العمل وصفه ذات الصلة لتطوير أساليب مرشح مرجعية لالببتيدات والبروتينات داخل مناطق أخرى من الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب قسامات لا يقل عن 50 ميكرولتر، مع تركيز 50 ميكروغرام / مل لكل الببتيد Aβ، في بدء المواد. يجب حل الببتيد Aβ في 20٪ الأسيتونتريل (إيه سي) و 4٪ محلول الأمونيا المركزة في الماء منزوع الأيونات (ت / ت) وتخزينها في 80 درجة مئوية.
تحذير: انظر الجدول رقم 1 لمعلومات السلامة.
1. إعداد حلول
- إعداد 100 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ محلول الأمونيا المركزة في الماء منزوع الأيونات (ت / ت) عن طريق تمييع 20 مل من إيه سي و 4 مل من الأمونيا المركزة (~ 25٪) في الماء منزوع الأيونات. ضبط الحجم النهائي إلى 100 مل مع الماء منزوع الأيونات. جعل الطازجة يوميا.
- تجهيز 50 مل من 5 M-غوانيدين هيدروكلوريد عن طريق إذابة 26.08 غرام من غوانيدين-هيدروكلوريد في الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي من 50 مل. متجر في 20 درجة مئوية، وجعل شهرية جديدة.
- إعداد 200 مل من 4٪ حامض الفوسفوريك في الماء منزوع الأيونات (ت /ت) عن طريق تمييع 9.4 مل من حمض الفوسفوريك المركز (~ 85٪) في الماء منزوع الأيونات. ضبط الحجم النهائي إلى 200 مل مع الماء منزوع الأيونات. تخزينها في الثلاجة وجعل أسبوعية جديدة.
- تجهيز 50 مل من 75٪ ACN و 10٪ من محلول الأمونيا المركز (ت / ت) في الماء منزوع الأيونات عن طريق تمييع 37.5 مل من إيه سي و 5 مل من الأمونيا المركزة (~ 25٪) في الماء منزوع الأيونات. ضبط الحجم النهائي إلى 50 مل مع الماء منزوع الأيونات. جعل الطازجة يوميا.
- ذوبان الجليد لا يقل عن 2.5 مل من السائل النخاعي البشري للمعايرة، تم الحصول عليها من التي تم تحديدها دي عينات متبقية من التحليل السريري الروتيني.
- تحضير السائل النخاعي الاصطناعي تحتوي على 150 ملي نا، 3.0 ملي K، 1.4 ملي الكالسيوم، و 0.8 ملي المغنيسيوم، 1.0 ملم P، و 155 ملي الكلورين في الماء منزوع الأيونات وإضافة الزلال المصل البقري إلى تركيز النهائي من 4 ملغ / مل. وهناك حاجة فقط 1 مل في التحليل، ولكن إعداد حجم كبير، قسامة عليه، وتخزينها لاستخدامها في المستقبل.
2. إعداد أجهزة القياس
- إعداد 0.5 مل من 4 ميكروغرام / مل 15 NAβ 1-42 الببتيد بإضافة 40 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل 15 NAβ 142-0،46 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ الأمونيا المركزة في أنبوب microcentrifuge 0.5 مل. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
- إعداد 2 مل من 100 نانوغرام / مل 15 NAβ 1-42 الببتيد بإضافة 50 ميكرولتر من 4 ميكروغرام / مل 15 NAβ 142 وإلى 1.95 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ الأمونيا المركزة في أنبوب microcentrifuge 2 مل. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
- إعداد ستة حلول تدريج (AF) عن طريق خلط كميات كل حل هو مبين في الجدول 2. استخدام 0.5، 1.5، و 2 مل أنابيب microcentrifuge. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
- إعداد معايرة النهائية (في نسختين) في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge بإضافة حلول المعايرة المقابلة وCSF الإنسان وفقا للجدول 3. ميكس على خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
3. إعداد معيار الداخلية
- إعداد 2 مل من 0.8 ميكروغرام / مل 13 CAβ 1-42 الببتيد بإضافة 32 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل 13 CAβ 142-1،968 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ الأمونيا المركزة في أنبوب microcentrifuge 2 مل. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
- إعداد 5 مل من 16 نانوغرام / مل 13 CAβ 1-42 الببتيد بإضافة 0.1 مل من 0.8 ميكروغرام / مل و 4.9 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ الأمونيا المركزة في أنبوب microcentrifuge 5 مل. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
4. إعداد نموذج استجابة عامل
ملاحظة: عامل استجابة يتم تنفيذ (RF) تقرير لتحديد تركيز الببتيد المسمى تستخدم لمعايرة (15 NAβ 1-42). وهذا يتطلب أن تركيز الأصلي Aβ 1-42 الببتيد وقد تم تحديد باستخدام تحليل الأحماض الأمينية (AAA). وهكذا، فإن حجم وتركيز الأم قسامات الببتيد Aβ 1-42تحتاج للوفاء بمتطلبات AAA.
- إعداد 0.5 مل من 4 ميكروغرام / مل مواليد (تحمل اسما) Aβ 1-42 بإضافة 40 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل الأصلي Aβ 1-42 إلى 0.46 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ الأمونيا المركزة في أنبوب microcentrifuge 0.5 مل. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
- إعداد 2 مل 40 نانوغرام / مل مزيج من مواليد و15 NAβ 1-42 بإضافة 20 ميكرولتر من 4 ميكروغرام / مل الأصلي Aβ 1-42 و 20 ميكرولتر من 4μg / 15 مل NAβ 1-42 إلى 1.96 مل من 20٪ إيه سي و 4٪ تتركز الأمونيا في أنبوب مل microcentrifuge 2. خلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 20 ميكرولتر من مزيج 40 نانوغرام / مل إلى 0.38 مل من السائل النخاعي الاصطناعي في أنبوب مل microcentrifuge 0.5. إعداد التكرارات وخلط في خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
إعداد 5. عينة
ملاحظة: ذوبان الجليد في العينات المراد قياسها في درجة حرارة الغرفة على الأسطوانة.
- إضافة 0.18 مل من كل تدريج، عامل ردا على ذلك، وعينة غير معروفة (بما في ذلك مراقبة الجودة [QC] عينات، في حال استخدامها) إلى 1 بروتين مل 96 لوحة في آبار عميقة، وفقا لشكل 1 (يتم استخدام افتراض لوحة كاملة). تأكد من إضافة العينات في، أو بالقرب من، والجزء السفلي من الآبار.
- إضافة 20 ميكرولتر من معيار الداخلية إلى كل بئر (أي معايرة، والعوامل ردا على ذلك، حلقات الجودة، والمجاهيل)؛ لا بد من الافراج عن انخفاض على جانب إغلاق البئر إلى السطح من العينة دون غمر طرف ماصة.
- إضافة 0.2 مل من 5 M-غوانيدين هيدروكلوريد إلى كل بئر.
- وضع لوحة عينة على شاكر صفيحة ومزج العينات لمدة 45 دقيقة في 1100 دورة في الدقيقة. قد تختلف وتيرة الأمثل اعتمادا على الأجهزة. ضبط التردد والسعة في خلاط حتى يتسنى للحلول مختلطة تماما وتترك أي قطرات من معيار داخلي أو CSF غير مخلوط على جانب الآبار.
- إضافة 0.2 مل من 4٪ حامض الفوسفوريكإلى كل بئر. مزيج دوامة لفترة وجيزة.
6. الصلبة المرحلة استخراج
ملاحظة: في كل غسل، وتحميل، والخطوات شطف، وتطبيق أدنى فراغ محتمل بعد إضافة الحل وتزيد تدريجيا حسب الحاجة إلى تحميل أو أزل الحل. تعطيل فراغ بين كل تحميل وخطوة شطف.
- وضع علبة خزان للنفايات في ظل وضع مختلط، الموجبة لتبادل، 96-جيدا استخراج المرحلة الصلبة (SPE) لوحة في غرفة متعددة استخراج لوحة.
- شرط الماصة SPE بإضافة 0.2 مل من الميثانول إلى كل بئر.
- تتوازن الماصة بإضافة 0.2 مل من 4٪ حامض الفوسفوريك إلى كل بئر.
- نقل جميع العينات (حوالي 0.62 مل في كل بئر) من لوحة في آبار عميقة لوحة SPE. استخدام ماصة ثماني قنوات عند نقل عينات من لوحة في آبار عميقة لوحة SPE. ليس حاسما لنقل كميات بأكملها أو المتساوية لجميع العينات، منذ العينات تحتوي على المتدربآل المعيار الذي سوف تعوض عن الاختلافات.
- غسل الماصة بعد مرور العينات خلال بإضافة 0.2 مل من 4٪ حامض الفوسفوريك إلى كل بئر.
- بعد غسل المذيبات ومزال من المواد الماصة، استبدال علبة خزان مع لوحة جمع أو الأنابيب.
- أزل عينة من المواد الماصة عن طريق إضافة مرتين 50 ميكرولتر من 75٪ ACN / 10٪ الأمونيا المركزة، ونلاحظ أن هذا الحل يتطلب فراغ منخفض جدا لتمرير من خلال الماصة. تذكر أن تعطيل فراغ بين كل إضافة.
- اختياري: ختم لوحة جمع أو الأنابيب وتجميدها في -80 درجة مئوية. إزالة ختم من لوحة جمع أو الأنابيب قبل الانتقال إلى الخطوة 6.8.2.
- تجفيف eluates باستخدام فراغ الطرد المركزي (بدون تطبيق الحرارة)؛ هذا يمكن أن يستغرق من واحد إلى عدة ساعات، اعتمادا على أجهزة الطرد المركزي فراغ.
- ختم الحاويات وتجميدها في -80 درجة مئوية.
7. السائل Chromatography
- إعداد الطور المتحرك ألف (5٪ إيه سي و 0.3٪ الأمونيا المركزة في الماء منزوع الأيونات [ت / ت])، B (منزوع الأيونات الماء 4٪ و 0.1٪ الأمونيا المركزة في إيه سي [ت / ت])، وغسل إبرة (50٪ ACN و 4٪ تتركز الأمونيا في الماء منزوع الأيونات [ت / ت]).
- 500 مل من مرحلة الأجهزة المحمولة، إضافة 25 مل من إيه سي و 1.5 مل من الأمونيا المركز إلى الماء منزوع الأيونات. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات.
- 500 مل من المرحلة المحمول B، إضافة 500 ميكرولتر من الأمونيا المركزة و 25 مل من الماء منزوع الأيونات إلى إيه سي. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل مع إيه سي.
- إعداد 250 مل من غسل إبرة بإضافة 120 مل من إيه سي و 10 مل من الأمونيا المركز إلى الماء منزوع الأيونات. ضبط الحجم النهائي إلى 250 مل مع الماء منزوع الأيونات.
- وضع مراحل المحمول ألف وباء وغسل إبرة زجاجات مفتوحة في حمام صوتنة لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام مع نظام LC
- حل كل عينة مع 25 ميكرولتر من 20٪ إيه سي و 4٪ concentraتيد محلول الأمونيا ووضعها على شاكر لمدة 20 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لأسفل العينات ووضعها في الاوتوماتيكى (نضع في 7 درجة مئوية).
- ضخ 20 ميكرولتر من العينة على 1 × 250 مم 2 البوليسترين-divinylbenzene (عكس المرحلة) عمود متجانسة حافظت على 50 درجة مئوية.
- استخدام التدرج LC هو مبين في الجدول رقم 4 مع معدل تدفق 0.3 مل / دقيقة. تحويل الأولين ودقيقة الخمس الماضية أن تضيع (بعد العمود) باستخدام صمام تحويل للحد من تلوث مطياف الكتلة.
تحليل 8. قداس الطيف
ملاحظة: تم استخدام هذه المعلمات لمطياف الكتلة الهجين-رباعي orbitrap مجهزة aheated مصدر تأين بالإرذاذ الإلكتروني.
- تعيين المعلمات لمصدر ايون وفقا للجدول 5.
- تعيين أداة MS لعزل الدول تهمة 4+ من الأصلي Aβ 1-42 (1،129.48 تجاريا،لتهمة نسبة [م / ض])، 15 NAβ 1-42 (1،143.00 م / ض)، و 13 CAβ 1-42 (1،179.50 م / ض) في محلل كتلة رباعي مع عرض العزلة من 2.5 م / ض.
- تفتيت الببتيدات المعزولة في الخلية الاصطدام مع طاقة الاصطدام تطبيع (NCE) من 17.0. قد تحتاج هذه إلى ضبطها لكل أداة، حتى من نفس النوع (وخاصة في حالة استخدام أنواع أخرى من الصكوك، مثل رباعي الثلاثي MS).
- تسجيل أطياف جزء مع قرار من 17.500، مع هدف السيطرة التلقائي من 2 × 10 5 الاتهامات والحد الأقصى لوقت حقن 250 مللي ثانية.
9. معالجة البيانات
- استخدام مبلغ من الأيونات المنتج (مع التسامح الشامل لل± 250 وحدة كتلة ملي [MMU]) في الجدول رقم 6 لحساب المناطق الكروماتوغرافي عن كل الببتيد. لاحظ أن أنواع أيون وأرقام تظهر فقط لAβ الأصلي
- تحديد متوسط معامل استجابة العينتين عامل استجابة بتقسيم المنطقة تحت المنحنى (الذروة الكروماتوغرافي) المؤرخ 15 NAβ 1-42 مع المنطقة تحت المنحنى الأصلي Aβ 1-42.
- ضبط تركيز 15 NAβ 1-42 تستخدم لمعايرة بضرب مع عامل ردود الفعل المحسوبة في الخطوة 9.2.
- بناء منحنى المعايرة من قبل المتهم بالتآمر في نسب مساحة 15 NAβ 1-42 إلى 13 CAβ 1-42 من مجموعتي معايرة ضد الاعتقال.
- حساب المنحدر واعتراض من منحنى المعايرة باستخدام الانحدار الخطي.
- حساب نسبة مجال الأصلي Aβ 1-42 لمعيار داخلي (13 CAβ 1-42) للامم المتحدةعينة معروفة.
- استقراء تركيز العينات المجهولة من منحنى المعايرة باستخدام المنحدر واعتراض حصلت عليه في الخطوة 9.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم استخدام الإعداد لوحة في الشكل رقم 1 لوحة كاملة من العينات. إذا ليتم تحليلها أقل عينات غير معروفة، وتدريج الثاني، ينبغي أن توضع مجموعات الترددات اللاسلكية، ومراقبة الجودة بعد نهاية الشوط الأول من العينات غير معروف.
كما رأينا في الشكل 2، ومعايرة قريبة من خط الانحدار، مع الانحرافات المعيارية منخفضة. هذا الأسلوب لديه مستوى أدنى من تقدير حجم 150 غ / مل ومستوى أعلى من تقدير من 4000 جزء من الغرام / مل. الانحراف المعياري المتبقي من معايرة ينبغي بالطبع أن يكون في أدنى مستوى ممكن. إذا المعايرة غير الخطية، يجب التخلص المدى (اعتمادا على شدة)، والانحراف هو على الأرجح بسبب تقنية pipetting لغير صحيحة و / أو أخطاء في التخفيف من معايرة. يجب أن يكون معامل الاختلاف (CV) من مكررات أقل من 20٪، ولكن يفضل أن يكون أقل من 10٪.
ogether.within الصفحات = "1"> والأم 15 N- و 13 CAβ 1-42 أزل من العمود LC في وقت واحد (لأنها تختلف فقط على مستوى النظائر)، مع ما يقرب من قمم متماثلة ودون المخلفات كبير (الشكل 3 ). يجب أن يتم تنفيذ لا يقل عن عشرة قياسات لكل الذروة الكروماتوغرافي ويمكن تعديلها مع الوقت حقن الأقصى في طريقة الصك. ويمكن قياس كل الببتيدات ثلاثة في وقت واحد لجميع القياسات (المعايرة، RF، والمجاهيل) خلال تحليل MS. ومع ذلك، إذا حساسية الطريقة هي دون المستوى الأمثل، وينبغي قياس الببتيدات فقط التي تهم كل حقنة (أي، فقط قياس 15 N- و 13 CAβ 1-42 للمعايرة، وأصلي و15 NAβ 1-42 لعينات الترددات اللاسلكية، وأصلي و13 CAβ 1-42 للعينات غير معروفة).
الرقم 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
الشكل 1: تخطيط من SPE وفي آبار عميقة لوحات. تخطيط نموذجي من معايرة (AF)، عامل استجابة عينة (RF)، وعينات مراقبة الجودة (QC)، والمجاهيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منحنى المعايرة. منحنى المعايرة شيدت باستخدام 15 NAβ 1-42 في 172، 572، 1144، 2287، 3431، و 4574 جزء من الغرام / مل (معدلة باستخدام عامل الاستجابة) و 13 CAβ 1-42 كمعيار الداخلي في السائل النخاعي البشري (ن = 2) . يتم رسم نسبة مساحة 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 (العمودي)ضد تركيز (المحور السيني). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المخطط الاستشرابي. اللوني من 0.500 نانوغرام / مل مواليد (الذاتية) Aβ 1-42 (لوحة العليا) و 1.6 نانوغرام / مل 13 CAβ 1-42 (اللوحة السفلية) في السائل النخاعي البشري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكمي للمجهول Aβ 1-42 في عينات مجهولة <./ قوي> يتم احتساب نسبة الذروة منطقة بقسمة الأم Aβ 1-42 الذروة الكروماتوغرافي المنطقة مع المعيار الداخلي (13 CAβ 1-42) ذروة منطقة الكروماتوغرافي. ومن استقراء تركيز الأصلي Aβ 1-42 في عينة من منحنى المعايرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: معلومات السلامة. معلومات السلامة للمواد الكيميائية المستخدمة لهذا البروتوكول.
| حل تدريج | حجم 100 نانوغرام / مل 15 NAβ 1-42 حل (مل) حجم 20٪ إيه سي و 4٪ الأمونيا (مل) | الحجم النهائي (مل) | النهائي 15 NAβ تركيز 1-42 (نانوغرام / مل) | |
| ا | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| ب | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20.00 |
| د | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1.50 |
الجدول 2: حلول المعاير. حلول تدريج أعدت في 20٪ إيه سي و 4٪ تتركز الأمونياتستخدم لمعايرة ارتفاعه CSF.
| تدريج | حجم محلول المعاير المقابلة (مل) | حجم السائل النخاعي البشري (مل) | الحجم النهائي (مل) | 15N-Aβ1-42 النهائي تركيز (نانوغرام / مل) |
| ا | 0.02 (A) | 0.18 | 0.20 | 4.00 |
| ب | 0.02 (B) | 0.18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0.02 (C) | 0.18 | 0.20 | 2.00 |
| د | 0.02 (D) | 0.18 | 0.20 | 1.00 |
| E | 0.02 (E) | 0.18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0.02 (F) | 0.18 | 0.20 | 0.15 |
الجدول 3: أجهزة القياس. معايرة أعد CSF البشري.
| الوقت (دقيقة) | الطور المتحرك٪ B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
الجدول 4: LC التدرج. التدرج LC المستخدمة مع معدل تدفق ثابت من 300 ميكرولتر / دقيقة.
| معامل | القيمة |
| الغاز غمد | 50 |
| الغاز المساعد | 6 |
| رذاذ الجهد | 4.4 كيلو فولت |
| S-عدسة RF | 61 |
| درجة حرارة سخان | +190 ° C |
| درجة الحرارة الشعرية | +350 ° C |
الجدول 5: ضبط مصدر ايون. المعلمات لمصدر أيون التي سيتم تحديدها في البرنامج أداة ضبط.
| السلائف أيون | أيونات المنتج |
| Aβ1-42 الأصلية (م / ض 1129.58، 4+) | 915.19 (b334 +)، 943.21 (b344 +)، 975.98 (b354 +)، 1000،74 (b364 +)، 1029،51 (b384 +)، 1054.03 (b394 +)، 1078،79 (B404 +)، 1107،06 (b414 +)، 1163،23 (b313 +)، 1200،25 (b323 +)، 1257،29 (b343 +)، 1300،96 (b353 +)، 1333،66 (B363 +)، 1372،00 (b383 +)، 1405،02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (م / ض 1143.00، 4+) | 926.41، 954.68، 987.95، 1012.71، 1041.22، 1066.99، 1091.75، 1120.28، 1177.18، 1215.55، 1272.58، 1316.92، 1349.94، 1388.63، 1422.31 |
| 13C-Aβ1-42 (م / ض 1179.50، 4+) | 955.33، 985.11، 1019.37، 1045.14، 1074.65، 1100.67، 1126.69، 1156.40، 1253.43، 1313.14، 1358.50، 1393.19، 1432.21، 1466.90 |
الجدول 6: الأيونات المستخدمة لتقدير. يتم عزل الدول تهمة 4+ من أيونات السلائف في محلل كتلة رباعي، مع عرض العزلة من 2.5 م / ض. وتستخدم أيونات المنتج (مع التسامح الشامل لل± 250 MMU) لحساب المناطق الكروماتوغرافي عن كل الببتيد. أنواع أيون والأرقام ONLذ تعرض لالأم Aβ 1-42 أيونات المنتج، لأنها هي نفسها من أجل كل 15 NAβ 1-42 و 13 CAβ 1-42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للتعرف على طريقة وصفها، بدلا من استخدام مصفوفة البديلة، استخدمنا نهج بديل تحليلها 13، 14، 15، 16، والتي تمكن المعايرة في السائل النخاعي البشري. ينطوي على نهج تحليلها البديل مختلفين معايير المسمى isotopically. واحد (15 NAβ 142) يستخدم لتوليد منحنى المعايرة في السائل النخاعي البشري، في حين يتم استخدام (13 CAβ 142) آخر كمعيار داخلي. ثم يتم استقراء مجهولة الذاتية Aβ 142 تركيزات من منحنى المعايرة شيدت باستخدام 15 NAβ 142/13 CAβ 142 نسبة من الذاتية Aβ 142/13 CAβ نسبة 142 المحسوبة. وقد تم استخدام المنهج تحليلها بديلة، حيث لا يوجد CSF خالية من تحليلها المتاحة، وانخفاض Aβ 142 الانتعاشوقد لوحظ عند استخدام الأصلي Aβ 142 في مصفوفة البديلات خلال تطوير الأسلوب.
منذ 15 NAβ 142 و أصلي Aβ 142 قد تعطي استجابات مختلفة في مرض التصلب العصبي المتعدد، وتركيز 15 NAβ 142 يتم تعديل قياس عينة، وRF عينة السائل النخاعي الاصطناعية التي تحتوي على تركيزات متساوية من 15 NAβ 142 و أصلي Aβ 142، مع تركيز معروف بواسطة AAA.The عامل استجابة العزم قد تختلف بين الطيف الإعلام المختلفة بسبب الاختلافات المحتملة في نقاء النظائر من 15 الببتيد N-وصفت بين دفعات. وبالتالي، ينبغي تحديد عامل استجابة لكل يوم قياس.
الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي إعداد معايرة والعينات الترددات اللاسلكية. الببتيدات Aβ، خصوصا Aβ 1-42، هي مسعور جدا وتلتصق بسهولة إلى نصائح ماصة لأنابيب ND أسطح 8 و 17 و 18. لتقليل الخسائر من الببتيدات Aβ خلال pipetting ل، فمن المهم للغاية لتشبع نصائح ماصة قبل التسليم. ويفضل أن يتم تجاهل ثلاثة مجلدات من الحل الببتيد قبل تسليمها إلى الأنبوب الذي يحتوي الحل الجديد. اعتمادا على حجم وتركيز المحلول، وهذا ليس من الممكن دائما. نهج ثاني أفضل بالطبع إلى ماصة الحل الببتيد صعودا وهبوطا ثلاث مرات قبل التسليم. لنفس السبب، من المهم أن تستخدم الأحجام المناسبة للأنابيب، وتجنب كميات كبيرة باطلة.
وتشير البيانات التي تم نشرها مسبقا لطريقة بان الانتعاش ضمن 100٪ (15٪) (15). كانت الأخطاء النسبية للمعايرة محسوبة إلى أقل من 15٪ من مجمل يحددها منحنى تدريج 19.
واحد سالحد bvious من هذه التقنية هو أن يكون المنخفض للالإنتاجية مقارنة المناعية الآلي. ومع ذلك، فإن الغرض من الطريقة الموصوفة هي عالية الدقة وعدم الإنتاجية. ويمكن أيضا أن يتم توسيع هذه الطريقة لتشمل Aβ 1-38 وAβ 1- 40، والتي هي أقصر 19. الحد آخر من هذا الأسلوب هو أن المشغل سوف يحتاجون إلى تدريب قياس الطيف الكتلي واسعة النطاق قبل تشغيل التحليل على الصك.
الكمي باستخدام المناعية يتوقف على التفاعل بين الجسم المضاد والمستضد. يمكن أن تتأثر هذا التفاعل من خلال وجود مكونات العينة التي قد تتداخل أو تتنافس مع التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا التفاعل تتأثر التشكل للمستضد. وهذه الآثار هي من الصعب السيطرة عليها ويعتقد أن السبب الرئيسي كان من الصعب التوفيق بين النتائج بين منصات المناعية وبين المختبرات. بيكويستند تقدير ause مع MS على عد مباشرة الجزيئات المستهدفة بالنسبة إلى مستقر، ومعيار المسمى النظير، الكمي مطلق ويتأثر عموما من قبل هذه الآثار المصفوفة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون معتمدة من القياسات بروتين التشخيص من قبل المناعية عن طريق سلسلة متصلة من إجراءات القياس العليا والمواد، من التحقق من صحة LC-MS / MS والمعايير الداخلية مستقرة المسمى النظير لخطط إدارة المبردات وإدارة علاقات العملاء، وبالتالي تحسين القابلية للمقارنة و موثوقية النتائج 20 و 21.
في الختام، فإن الشرطة العسكرية الملكية وصفه لقياس Aβ 142 في السائل النخاعي هو خطوة هامة في تطوير إدارة علاقات العملاء التي من شأنها أن تساعد على إرساء العام تركيز النهائي لAβ 142 في السائل النخاعي. بالضبط قطع العرضية مهمة للغاية لتشخيص بدقة م في وقت مبكر وذات أهمية قصوى عندما أنواع جديدة من الأدوية المعدلة للمرض تصل إلى العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E.
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Buchhave, P., et al. Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia. Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).
- Bjerke, M., et al. Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid. Int J Alzheimers Dis. , (2010).
- Dumurgier, J., et al. Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting. Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).
- Mattsson, N., et al. CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program. Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).
- Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers. Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).
- Mattsson, N., et al. Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42. Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).
- Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach. Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).
- Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).
- Leinenbach, A., et al. Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid. Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).
- Li, W., Cohen, L. H. Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix. Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).
- Perret-Liaudet, A., et al. Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis. Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).
- Lewczuk, P., et al. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).
- Pannee, J., et al. Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET. J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).
- Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).
- Vesper, H. W., Thienpont, L. M.
