Introduction
Ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende vorm van dementie en treft ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd 1. De neuropathologische kenmerken van de ziekte algemeen aangenomen in de kern van de pathogenese van AD te liggen zijn intracellulaire tangles van hypergefosforyleerd tau-eiwit 2 en extracellulaire plaques bestaande uit geaggregeerde amyloid-beta (Aß) peptiden 3. In lijn hiermee heeft de beoordeling van plaque pathologie in vivo door biomarkers onlangs opgenomen in het onderzoek diagnostische criteria voor AD 4. Voor CSF metingen van AB 1-42, verschillende immunoassays zijn beschikbaar en worden gebruikt in vele klinische laboratoria 5. De concentratie van Ap 1-42 in CSF is in AD patiënten ongeveer 50% lager dan in het cognitief normale ouderen, als gevolg van de afzetting van het peptide in plaques in de brain 6, 7.
Deze biomarkers zijn voornamelijk geanalyseerd met immunoassays (bijvoorbeeld op antilichaam gebaseerde technieken), maar deze assays worden beïnvloed door matrixeffecten 8. Het gebruik van immunoassays op verschillende technologische platforms en het gebrek aan standaardisatie assay 9, 10 maakt de invoering van globale cut-off concentraties moeilijk 11, 12. Een analytisch gevalideerd RMP zou de uniforme kalibratie van verschillende assay platforms toe te staan, idealiter resulteert in een betere vergelijkbaarheid tussen de analytische platforms en in een betere controle van de factoren die bijdragen aan de totale meting variabiliteit.
De absolute kwantificering van Aß 1-42 met behulp van de ontwikkelde LC-MS / MS methode overwint veel van de kwesties in verband met antilichamen gebaseerde techniques. De methode, vermeld als een RMP door het Gemengd Comité voor Traceerbaarheid in Laboratory Medicine (JCTLM databank identificatienummer C11RMP9), zullen worden gebruikt om de absolute concentratie van Aß 1-42 te bepalen in een Certified Reference Material (CRM) te harmoniseren CSF AB 1 -42 metingen over technieken en analyse-platforms. De beschreven workflow moet relevant zijn voor de ontwikkeling van kandidaat referentiemethoden voor peptiden en eiwitten in andere gebieden van de geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol vereist aliquots van ten minste 50 uL, met een concentratie van 50 ug / ml voor elk Aß peptide, als uitgangsmateriaal. De Aß peptiden worden opgelost in 20% acetonitril (ACN) en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) en bewaard bij 80 ° C.
Let op: Zie tabel 1 voor informatie over veiligheid.
1. Bereiding van de oplossingen
- Bereid 100 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) door het verdunnen van 20 ml ACN en 4 ml geconcentreerde ammoniak (~ 25%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 100 ml met gedeïoniseerd water. Maak dagelijks vers.
- Bereid 50 ml van 5 M guanidine-hydrochloride door het oplossen van 26,08 g guanidine-hydrochloride in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 20 ° C en maak verse maandelijks.
- Bereid 200 ml 4% fosforzuur in gedemineraliseerd water (v /v) door het verdunnen van 9,4 ml geconcentreerd fosforzuur (~ 85%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 200 ml met gedeïoniseerd water. Bewaar in de koelkast en maak verse wekelijks.
- Bereid 50 ml 75% ACN en 10% geconcentreerde ammonia (v / v) in gedeïoniseerd water door het verdunnen 37,5 ml ACN en 5 ml geconcentreerde ammonia (~ 25%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 50 ml met gedeïoniseerd water. Maak dagelijks vers.
- Dooi ten minste 2,5 ml van het menselijk CSF voor de kalibrators, verkregen uit-de geïdentificeerde overgebleven monsters uit routine klinische analyse.
- Bereid kunstmatige CSF bevattende 150 mM Na, K 3,0 mM, 1,4 mM Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P en 155 mM Cl in gedeïoniseerd water en voeg runderserumalbumine tot een eindconcentratie van 4 mg / ml. Slechts 1 mL nodig per analyse, maar stelt een groot volume, hoeveelheid, en opslag voor later gebruik.
2. Voorbereiding van de Calibrators
- Bereid 0,5 ml 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 peptide door toevoeging van 40 ul van 50 ug / ml 15 NAβ 142-,46 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
- Bereid 2 ml 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 peptide door toevoeging van 50 pi van de 4 ug / ml 15 NAβ 142-1,95 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
- Neem zes kalibrator oplossingen (AF) door mengen van de volumes van elk van de in tabel 2 oplossing. Gebruik 0,5, 1,5 en 2 ml microcentrifugebuizen. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
- Bereid de uiteindelijke kalibrators (in tweevoud) in 0,5 ml microcentrifugebuizen door het toevoegen van de bijbehorende ijkoplossingen en menselijke CSF volgens tabel 3. Meng op een vortex mixer gedurende 1 min.
3. Voorbereiding van de interne standaard
- Bereid 2 mL 0,8 ug / mL 13 CAβ 1-42 peptide door toevoeging van 32 ul van 50 ug / ml 13 CAβ 142-1,968 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
- Bereid 5 ml 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptide door toevoeging van 0,1 ml 0,8 ug / ml tot 4,9 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
4. Voorbereiding van de Response Factor Sample
OPMERKING: De responsfactor (RF) bepaling wordt uitgevoerd om de concentratie van het gemerkte eiwit gebruikt voor kalibratie (15 NAβ 1-42) te bepalen. Dit vereist dat de concentratie van het natieve 1-42 Aß peptide werd bepaald met aminozuuranalyse (AAA). Zo is het volume en de concentratie van natuurlijk Ap-peptide 1-42 aliquotsmoeten de eisen van de AAA voldoen.
- Bereid 0,5 ml 4 ug / ml natuurlijke (ongemerkt) Aß 1-42 door toevoeging van 40 ul van 50 ug / ml natief Aß 1-42 0,46 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
- Bereid een 2-mL 40 ng / mL mengsel van natief en 15 NAβ 1-42 door toevoeging van 20 ul van 4 ug / ml natief Aß 1-42 en 20 pi van 4 ug / mL 15 NAβ 1-42 tot 1,96 ml 20% ACN en 4% geconcentreerd ammonia in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
- Voeg 20 ul van 40 ng / mL mix 0,38 ml kunstmatige CSF in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Bereid duplicaten en mix op een vortex mixer gedurende 1 min.
5. Monstervoorbereiding
OPMERKING: Ontdooi de te meten monsters bij kamertemperatuur op een roller.
- Voeg 0,18 ml van elke calibrator, responsfactor en onbekende monster (inclusief kwaliteitscontrole [QC] samples, indien gebruikt) tot een 1 mL eiwit 96 diepe putjes, volgens figuur 1 (uitgaande van een volledige plaat wordt gebruikt). Zorg ervoor dat de monsters voegen, of dicht bij, de bodem van de putjes.
- Voeg 20 ul van interne standaard aan elk putje (dat wil zeggen, kalibratoren, reactie factoren, QCs en onbekenden); is het cruciaal om de druppel op de kant van de bron dicht bij het oppervlak van het monster vrij te dompelen de pipetpunt.
- Voeg 0,2 ml van 5 M guanidine-waterstofchloride aan elk putje.
- Het monster plaat op een microplaat schudinrichting en meng de monsters gedurende 45 minuten bij 1100 rpm. De optimale frequentie kunnen verschillen afhankelijk van de instrumentatie. De frequentie en amplitude van de mixer, zodat de oplossingen grondig gemengd en geen druppels interne standaard of CSF ongemengde gelaten aan de zijde van de putjes.
- Voeg 0,2 ml 4% fosforzuuraan elk putje. Vortex meng kort.
6. Solid Phase Extraction
Opmerking: In alle was-, laad- en elutiestappen, passen de laagst mogelijke vacuüm na het toevoegen van de oplossing en geleidelijk naar behoefte te laden of te elueren de oplossing. Schakel het vacuüm tussen elke laad- en elutiestap.
- Zet een reservoir tray voor afvalstoffen in het kader van een mixed-mode, kation-uitwisseling, 96-well vaste fase extractie (SPE) plaat in de winning plaat verdeelkamer.
- Conditioneer de SPE sorptiemiddel door toevoeging van 0,2 ml methanol aan elk putje.
- Het sorptiemiddel evenwicht door toevoeging van 0,2 ml 4% fosforzuur aan elk putje.
- Breng alle monsters (ongeveer 0,62 ml in elk putje) uit de diepe-wells plaat aan de SPE plaat. Gebruik een acht-kanaals pipet bij het overbrengen van de monsters van de deep-well plaat om de SPE plaat; Het is niet cruciaal voor de gehele of gelijk volumina van monsters dragen, aangezien de monsters stage bevattenal standaard die zal compenseren voor variaties.
- Was het sorptiemiddel nadat de monsters door middel van toevoeging van 0,2 ml 4% fosforzuur aan elk putje gepasseerd.
- Na het wassen oplosmiddel uitgewassen uit het sorptiemiddel, vervangt het reservoir dienblad met een verzameling plaat of tubes.
- Elueer het monster van het sorptiemiddel met tweemaal toevoegen van 50 ui 75% ACN / 10% geconcentreerde ammonia en merk op dat deze oplossing vereist een zeer laag vacuüm door het sorbens te passen. Vergeet niet om het vacuüm tussen elke toevoeging te schakelen.
- OPTIE: Sluit de collectie plaat of tubes en vries ze bij -80 ° C. Haal de afdichting uit de collectie plaat of tubes voordat u verder met stap 6.8.2.
- Droog de eluaten met vacuümcentrifugatie (zonder toepassing van warmte); Dit kan van de ene tot enkele uren, afhankelijk van het vacuüm centrifuge.
- Verzegel de containers en bevriezen bij -80 ° C.
7. Liquid Chromatografie
- Bereid mobiele fase A (5% ACN en 0,3% geconcentreerde ammoniak in gedemineraliseerd water [v / v]), B (4% gedemineraliseerd water en 0,1% geconcentreerde ammoniak in ACN [v / v]), en de naald was (50% ACN en 4% geconcentreerd ammoniak in gedemineraliseerd water [v / v]).
- Voor 500 ml mobiele fase A, voeg 25 ml ACN en 1,5 ml geconcentreerde ammoniak in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 500 ml met gedeïoniseerd water.
- Voor 500 ml mobiele fase B, voeg 500 ul van geconcentreerde ammonia en 25 ml gedeïoniseerd water ACN. Pas het uiteindelijke volume tot 500 ml met ACN.
- Bereid 250 ml naald wassen door toevoeging van 120 ml ACN en 10 ml geconcentreerde ammoniak in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 250 ml met gedeïoniseerd water.
- Zet de mobiele fasen A en B en naald wasflessen wordt in een bad sonicatie gedurende 20 minuten voor gebruik met het systeem LC
- Ontbinden elk monster met 25 ul van 20% ACN en 4% concentrated ammoniakoplossing en plaats ze op een schudder gedurende 20 min. Centrifugeer beneden de monsters en plaats ze in de autosampler (houden bij 7 ° C).
- Injecteer 20 uL monster op een 1 x 250 mm 2 polystyreen-divinylbenzeen (omgekeerde fase) monolithische kolom gehandhaafd op 50 ° C.
- Gebruik de LC gradiënt in tabel 4 met een debiet van 0,3 ml / min. Doorschakelen de eerste twee en de laatste vijf minuten naar afval (post-kolom) met een omleiding klep om de verontreiniging van de massaspectrometer verminderen.
8. massaspectrometrische analyse
LET OP: Deze parameters werden gebruikt voor een quadrupool-orbitrap hybride massaspectrometer uitgerust met aheated elektrospray ionisatie bron.
- Stel de parameters voor de ionenbron volgens tabel 5.
- Stel de MS instrument om de 4+ lading staten van inheemse Aß 1-42 te isoleren (1,129.48 massa-ladingsverhouding [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), en 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) in de quadrupool massa-analysator met een isolatie breedte van 2,5 m / z.
- Versnippering van de geïsoleerde peptiden in de botsing cel met een genormaliseerd botsingsenergie (NVU) van 17,0. Dit zou moeten worden afgestemd op elk instrument, zelfs van hetzelfde type (en in het bijzonder als het gebruik van andere soorten instrumenten, zoals een triple quadrupool MS).
- Noteer het fragment spectra met een resolutie van 17.500, met een automatische versterkingsregeling Doelwit van 2 x 10 5 kosten en een maximale injectietijd van 250 ms.
9. Data Processing
- Gebruik de som van het product ionen (met een massatolerantie van ± 250 milli gewichtseenheden [mmu]) in tabel 6 de chromatografische gebieden berekeningen voor elke peptide. Merk op dat de types ion en cijfers alleen worden getoond voor inheemse AP
- Bepaal de gemiddelde responsfactor van beide responsfactor monsters door het oppervlak te delen onder de curve (chromatografische piek) van 15 NAβ 1-42 waarbij het gebied onder de curve van natieve Aß 1-42.
- Dient de concentratie van de 15 NAβ 1-42 voor kalibratie met de responsfactor berekend in stap 9.2 vermenigvuldigen.
- Construeer een ijkcurve door het gebied verhoudingen van 15 tot 13 NAβ 1-42 CAβ 1-42 van de twee kalibrators tegen de concentratie.
- Bereken de helling en intercept van de ijklijn met behulp van lineaire regressie.
- Bereken de oppervlakte verhouding van inheemse Aß 1-42 om de interne standaard (13 CAβ 1-42) voor unbekende monsters.
- Extrapoleren concentratie van onbekende monsters uit de ijkcurve door de helling en intercept verkregen in stap 9.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De plaat opstelling in figuur 1 wordt gebruikt voor een volledige plaat van monsters. Als er minder onbekende monsters moeten worden geanalyseerd, de tweede kalibrator, RF, en QC sets moet worden geplaatst na de eerste helft van de onbekende monsters.
Zoals blijkt uit figuur 2, de kalibrators dicht bij de regressielijn met lage standaarddeviaties. Deze methode heeft een lager kwantificering van 150 pg / ml en een bovengrens van kwantificering van 4000 pg / ml. De residuele standaarddeviatie van de kalibratie moet natuurlijk zo laag mogelijk. Als de kalibratie niet lineair, dient de run worden verwijderd (afhankelijk van de ernst), en de afwijking is meestal het gevolg van onjuiste pipetteertechniek en / of fouten in de verdunning van kalibrators. De variatiecoëfficiënt (CV) van replicaatbepalingen dan 20%, maar bij voorkeur beneden 10% zijn.
ogether.within-page = "1"> De inheemse 15 N- en 13 CAβ 1-42 elueren uit de LC-kolom tegelijkertijd (aangezien ze alleen verschillen van mening over de isotopen-niveau), met bijna symmetrische pieken en zonder significante tailing (figuur 3 ). Ten minste tien metingen worden uitgevoerd voor elke chromatografische piek en kan worden ingesteld met de maximale injectietijd in het instrument methode. Alle drie peptiden kunnen gelijktijdig worden gemeten voor alle metingen (kalibratie, RF en onbekenden) tijdens de MS analyse. Indien de gevoeligheid van de methode niet optimaal zijn, maar peptides plaats worden gemeten voor elke injectie (bijv., Meten alleen N- 15 en 13 CAβ 1-42 voor kalibrators, natieve en 15 NAβ 1-42 voor RF monsters, en inheemse en 13 CAβ 1-42 voor onbekende monsters).
Figuur 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Figuur 1: Lay-outs van de SPE en deep-well platen. Typische lay-out van kalibratoren (AF), response factor monster (RF), kwaliteitscontrole monsters (QC), en onbekenden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: IJkcurve. IJkcurve gebouwd met behulp van 15 NAβ 1-42 bij 172, 572, 1144, 2287, 3431 en 4574 pg / ml (gecorrigeerd met behulp van de respons factor) en 13 CAβ 1-42 als de interne standaard in de menselijke CSF (n = 2) . De oppervlakteverhouding van 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 is uitgezet (y-as)tegen de concentratie (X-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Chromatogram. Chromatogram van 0.500 ng / mL inheemse (endogene) Aß 1-42 (bovenste paneel) en 1,6 ng / mL 13 CAβ 1-42 (onderste paneel) in de menselijke CSF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van onbekende Aß 1-42 in onbekende monsters <./ strong> is de piek gebied verhouding berekend door de inheemse Aß 1-42 chromatografiepiek gebied te delen met de interne standaard (13 CAβ 1-42) chromatografiepiek omgeving. De concentratie van de inheemse Aß 1-42 in het monster wordt geëxtrapoleerd uit de kalibratiecurve. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Veiligheidsvoorschriften. Veiligheidsinformatie voor de chemicaliën die worden gebruikt voor dit protocol.
| Calibrator oplossing | Volume van 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 oplossing (ml) Volume van 20% ACN en 4% ammonia (ml) | Uiteindelijk volume (ml) | Laatste 15 NAβ 1-42 concentratie (ng / ml) | |
| EEN | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| B | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20.00 |
| D | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1.50 |
Tabel 2: Calibrator oplossingen. Calibrator oplossingen bereid in 20% ACN en 4% geconcentreerd ammoniagebruikt voor spiking CSF kalibrators.
| Calibrator | Volume van de overeenkomstige calibrator oplossing (ml) | Volume van de menselijke CSF (ml) | Uiteindelijk volume (ml) | Definitieve 15N-Aβ1-42 concentratie (ng / ml) |
| EEN | 0,02 (A) | 0.18 | 0.20 | 4.00 |
| B | 0.02 (B) | 0.18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0,02 (C) | 0.18 | 0.20 | 2.00 |
| D | 0,02 (D) | 0.18 | 0.20 | 1.00 |
| E | 0,02 (E) | 0.18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0,02 (F) | 0.18 | 0.20 | 0.15 |
Tabel 3: Calibrators. Calibrators bereid in menselijk CSF.
| Tijd (min) | % Mobiele fase B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabel 4: LC gradiënt. De LC gebruikte gradiënt met een constante stroomsnelheid van 300 pL / min.
| Parameter | Waarde |
| schede gas | 50 |
| Auxiliary gas | 6 |
| Spray voltage | 4,4 kV |
| S-lens RF | 61 |
| heater temperatuur | 190 ° C |
| capillaire temperatuur | 350 ° C |
Tabel 5: Ion bron instellingen. Parameters voor de ionenbron wordt in het instrument tune software.
| precursorion | product ionen |
| Inheemse Aβ1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (B334 +), 943,21 (b344 +), 975,98 (b354 +), 1.000,74 (b364 +), 1.029,51 (b384 +), 1054.03 (b394 +), 1.078,79 (B404 +), 1.107,06 (B414 +), 1.163,23 (B313 +), 1.200,25 (b323 +), 1.257,29 (b343 +), 1.300,96 (b353 +), 1.333,66 (b363 +), 1.372,00 (b383 +), 1.405,02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1.012,71, 1.041,22, 1.066,99, 1.091,75, 1.120,28, 1.177,18, 1.215,55, 1.272,58, 1.316,92, 1.349,94, 1.388,63, 1.422,31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1.019,37, 1.045,14, 1.074,65, 1.100,67, 1.126,69, 1.156,40, 1.253,43, 1.313,14, 1.358,50, 1.393,19, 1.432,21, 1.466,90 |
Tabel 6: Ionen gebruikt voor de kwantificering. De 4+ ladingstoestanden van de precursor ionen die in de quadrupool massa-analysator, met een isolatie breedte van 2,5 m / z. Het product ionen (met een massatolerantie van ± 250 mmu) worden gebruikt voor de chromatografische gebieden berekeningen voor elke peptide. Ion soorten en aantallen zijn ONLy getoond voor inheemse Aß 1-42 product ionen, omdat ze hetzelfde zijn voor zowel 15 NAβ 1-42 en 13 CAβ 1-42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de beschreven werkwijze, in plaats van een surrogaat matrix gebruikten we de surrogaat analyt benadering 13, 14, 15, 16, die ijking in menselijke CSF maakt. Het surrogaat analyt benadering omvat twee verschillende isotopisch gelabelde standaards. On (15 NAβ 142) wordt gebruikt om de kalibratiekromme in menselijk CSF genereren, terwijl andere (13 CAβ 142) wordt gebruikt als interne standaard. Unknown endogene Aß 142 concentraties geëxtrapoleerd uit de ijkkromme geconstrueerd met de 15 NAβ 142/13 CAβ 142 verhouding van de berekende endogene Aß 142/13 CAβ 142 ratio. Het surrogaat analyt benadering werd gebruikt omdat er geen analyt vrij CSF beschikbaar en lage Aß 142 herstelwerd waargenomen bij het gebruik van inheemse Ap-142 in een surrogaat matrix tijdens de methode-ontwikkeling.
Aangezien 15 NAβ 142 en inheemse AB 142 kunnen verschillende reacties geven in de MS, de concentratie van 15 NAβ 142 wordt afgesteld door een RF sample-kunstmatig CSF monster dat gelijke concentraties van 15 NAβ 142 en inheemse Aß 142, met een bekende concentratie bepaald door AAA.The respons factor kunnen verschillen tussen de verschillende massaspectrometers vanwege mogelijke variaties in de isotopische zuiverheid van het 15N-gemerkt peptide tussen batches. Daarom moet het antwoord factor worden bepaald voor elke meting dag.
De meest kritische stappen in dit protocol zijn de voorbereiding van de kalibratoren en de RF-samples. Ap-peptiden, in het bijzonder Aß 1-42, zijn zeer hydrofoob en gemakkelijk vasthouden aan pipetpunten eennd buizen oppervlakken 8, 17, 18. Om het verlies van Ap peptiden tijdens pipetteren minimaliseren, is het uiterst belangrijk om de pipetpunten voor de levering verzadigen. Bij voorkeur dient drie delen peptide oplossing weggegooid voor aflevering naar een nieuwe buis bevattende oplossing. Afhankelijk van het volume en de concentratie van de voorraadoplossing, dit is niet altijd mogelijk. De op een na beste benadering is natuurlijk aan het peptide-oplossing op en neer drie keer voorafgaand aan de levering pipet. Om dezelfde reden is het belangrijk om de juiste maten te gebruiken voor buizen, het vermijden van grote leegte volumes.
Eerder gepubliceerde gegevens voor de werkwijze tonen dat herstel binnen 100% (15%) 15. De relatieve fouten bij de terugberekende kalibratoren waren dan 15% van het volledige bereik gedefinieerd door de kalibrator 19 curve.
een obvious beperking van deze techniek is dat het een lage doorvoer vergeleken met geautomatiseerde immunoassays. Echter, het doel van de beschreven werkwijze is een hoge nauwkeurigheid en niet doorvoer. Deze werkwijze kan eveneens worden uitgebreid met Aß 1-38 en Aß 1- 40, die korter 19 omvatten. Een andere beperking van deze methode is dat de operator massaspectrometrie uitgebreide training voor het uitvoeren van de analyse van het instrument nodig.
Kwantificering immunoassays gebruikt is afhankelijk van de interactie tussen het antilichaam en het antigeen. Deze interactie kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van monstercomponenten die kunnen interfereren of concurreren met de interactie. Daarnaast kan de interactie worden beïnvloed door de conformatie van het antigeen. Deze effecten zijn moeilijk te controleren en worden verondersteld om de belangrijkste reden waarom het moeilijk is geweest om de resultaten tussen immunoassay platforms en tussen laboratoria te harmoniseren. BecAGebruik kwantificering met MS is gebaseerd op direct tellen van de doelmoleculen opzichte van een stabiele isotoop gemerkte standaard, absolute kwantificering en algemeen inert dergelijke matrix effecten. Bovendien moet diagnostisch eiwit metingen van immunoassays worden ondersteund door een ononderbroken keten van procedures en materialen hogere orde meting van gevalideerde LC-MS / MS en stabiele isotoop gelabelde interne standaarden RMPs en CRM, waardoor de vergelijkbaarheid verbeteren en betrouwbaarheid van de resultaten 20, 21.
Kortom, de beschreven RMP voor de meting van Ap 142 in CSF is een belangrijke stap in de ontwikkeling van een CRM die zullen helpen om de algemene cut-off concentratie vast te stellen voor Ap 142 in CSF. Exact cut-offs zijn van groot belang voor het nauwkeurig diagnose van AD vroeg en zijn van het grootste belang als er nieuwe vormen van disease-modifying drugs de kliniek te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E.
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Buchhave, P., et al. Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia. Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).
- Bjerke, M., et al. Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid. Int J Alzheimers Dis. , (2010).
- Dumurgier, J., et al. Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting. Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).
- Mattsson, N., et al. CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program. Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).
- Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers. Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).
- Mattsson, N., et al. Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42. Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).
- Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach. Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).
- Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).
- Leinenbach, A., et al. Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid. Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).
- Li, W., Cohen, L. H. Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix. Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).
- Perret-Liaudet, A., et al. Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis. Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).
- Lewczuk, P., et al. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).
- Pannee, J., et al. Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET. J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).
- Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).
- Vesper, H. W., Thienpont, L. M.
