Introduction
알츠하이머 병 (AD)은 치매의 가장 흔한 형태이며, 전 세계적으로 한 약 35 만명에 영향을 미친다. 널리 AD의 발병 기전의 핵심 거짓말을 믿고 병의 신경 병리학 적 특징은 집계 아밀로이드 - 베타 (Aβ) 펩타이드 3 구성된 hyperphosphorylated 타우 단백질이 세포 내 신경 섬유 엉킴 및 세포 외 플라크 있습니다. 이에 맞춰, 바이오 마커에 의해 생체 내에서 플라크 병리의 평가는 최근에 AD 4에 대한 연구 진단 기준에 포함되었습니다. Aβ 1-42의 CSF 측정을 위해 여러 가지 면역 사용할 수 있으며 많은 임상 실험실 (5)에 사용됩니다. CSF에서 Aβ 1-42의 농도는 BR에 플라크의 펩티드의 침착을 반영인지 정상 노인보다 AD 환자의 약 50 % 낮다아인 (6, 7).
이러한 생체는 주로 면역 (예를 들어, 항체 - 기반 기술)을 사용하여 분석하지만, 이러한 분석은 매트릭스의 효과 (8)에 의해 영향을받을 수있다. 다른 기술 플랫폼의 면역 분석 및 표준화 9의 부재의 사용은 10 11 12 어려운 글로벌 컷오프 농도로 도입한다. 해석 적 검증 RMP는 이상적으로 분석 플랫폼에서 더 나은 비교와 전체 측정 변동에 기여하는 요인의 더 나은 제어의 결과로, 다른 분석 플랫폼의 균일 보정을 허용합니다.
현상 된 LC-MS / MS 방법을 사용하여 Aβ 1-42의 절대 정량 항체 기반 TECHN와 관련된 많은 문제들을 극복iques. 실험 의약 추적을위한 합동위원회 (JCTLM 데이터베이스 식별 번호 C11RMP9)에 의해 RMP로 나열있어서, CSF Aβ 한 조화하는 인증 표준 물질 (CRM)에서 Aβ 1-42의 절대 농도를 결정하는 데 사용될 기술 및 분석 플랫폼에서 -42 측정. 설명 된 워크 플로는 의학의 다른 영역에서 펩타이드 및 단백질 후보 참조 방법의 개발을위한 관련이 있어야한다.
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Protocol
주 :이 프로토콜은 출발 물질로서 각각 Aβ 펩타이드를 50㎍ / ㎖의 농도에서 50 μL의 분취 량을 필요로한다. Aβ 펩타이드의 탈 이온수 중 20 % 아세토 니트릴 (ACN) 및 4 % 진한 암모니아 용액 (V / V)에 용해시키고, 80 ℃에서 보관해야한다.
주의 : 안전 정보는 표 1을 참조하십시오.
솔루션 1. 준비
- ACN 20㎖의 탈 이온수에서 농축 암모니아 4 ㎖ (~ 25 %)을 희석하여 20 % ACN과 4 % 100 ㎖를 탈 이온수 (v / v)로 농축 암모니아 용액을 제조 하였다. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. 신선한 매일 확인합니다.
- 50 ㎖의 최종 부피의 탈 이온수에 구아니딘 염산염 26.08 g을 용해하여 5 M 구아니딘 히드로 클로라이드 50 ㎖를 준비한다. 20 ° C에서 보관하고 신선한 매월합니다.
- (탈 이온수 4 % 인산 200㎖를 준비 V /V)의 탈 이온수에서 농축 인산 (~ 85 %) 9.4 mL로 희석. 탈 이온수 200 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. 냉장고에 저장하고 신선한 주간을합니다.
- ACN 37.5 mL의 탈 이온수에서 농축 암모니아 5 ㎖ (~ 25 %)를 희석하여, 탈 이온수 50 75 % ACN ㎖의 10 % 진한 암모니아 용액 (V / V)를 준비한다. 탈 이온수로 50 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. 신선한 매일 확인합니다.
- 일상적인 임상 분석 드 식별 남은 샘플에서 얻은 교정기, 인간 CSF의 적어도 2.5 mL로 녹여.
- 150 mM의 나트륨, 3.0 mM의 K, 1.4 mM의 CA, 0.8mm의 마그네슘, 1.0 mM의 P, 및 탈 이온수 155 mM의 CL을 포함하는 인공 CSF를 준비하여 4 mg / ml의 최종 농도로 우 혈청 알부민을 추가한다. 단 1 mL의 향후 사용을 위해 분취 량을, 저장, 분석 당 필요하지만, 많은 양을 준비한다.
구경 2. 준비
- 4 μg의 0.5 mL의 준비 / mL의 10.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 20 % ACN과 4 % 진한 암모니아 용액을 0.46 / ㎖ 15 142 NAβ 50 μg의 40 μL를 첨가하여 5 NAβ 1-42 펩티드. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
- 2 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN과 4 % 진한 암모니아 1.95 mL의 4 μg의 / ㎖ 15 NAβ 142 50 μL를 첨가하여 100 NG / ㎖ 15 NAβ 1-42 펩티드이 용액을 준비한다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
- 표 2에 나타낸 각각의 용액의 양을 혼합하여 용액 여섯 교정기 (AF)를 준비한다. 0.5, 1.5, 2 ML의의 microcentrifuge 튜브를 사용합니다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
- 해당 교정 솔루션 및 1 분을위한 와류 믹서 표 3. 믹스에 따라 인간의 CSF를 추가하여 0.5 ML의의 microcentrifuge 튜브 (중복)에 최종 교정기를 준비합니다.
내부 표준 3. 준비
- 2 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN 4 % 농축 암모니아 1.968 mL의 / mL의 13 CAβ (142) 50 μg의 32 μL를 추가하여 / mL의 13 CAβ 1-42 펩타이드 0.8 μg의 2 용액을 준비합니다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
- 5 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN과 4 % 진한 암모니아 용액 4.9 μg의 0.8 / mL의 0.1 mL를 첨가하여 16 NG / ㎖ 13 CAβ 1-42 펩티드 5 ㎖를 준비한다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
응답 인자 샘플 4. 준비
참고 : 응답 팩터 (RF) 결정은 교정 (15 NAβ 1-42)에 사용되는 표지 된 펩타이드의 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이것은 천연 Aβ 1-42 펩티드의 농도는 아미노산 분석 (AAA)를 사용하여 측정 된 것을 필요로한다. 따라서, 체적 고유 Aβ 1-42 펩티드 분취 농도AAA의 요구 사항을 충족해야합니다.
- 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN 4 % 농축 암모니아 0.46 mL의 / mL의 기본 Aβ 1-42 50 μg의 40 μL를 추가하여 (레이블이 지정되지 않은) 4 μg의 / ML의 기본 Aβ 1-42 0.5 mL로 준비합니다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
- 20 %의 1.96 mL의 4 μg의의 / mL의 기본 Aβ 1-42 및 4μg 20 μL / mL의 15 NAβ 1-42을 20 μL를 추가하여 기본 15 NAβ 1-42의 2 mL의 40 NG / ML의 믹스를 준비 ACN과 4 %는 2 ML의 microcentrifuge 관 암모니아를 농축시켰다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다.
- 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 인공 CSF의 0.38 mL의 40 NG / ML의 믹스의 20 μL를 추가합니다. 중복을 준비하고 1 분 동안 와류 믹서에 혼합한다.
5. 샘플 준비
주의 : 샘플을 해동은 롤러 실온에서 측정한다.
- 그림 1 항에있어서, 1 mL의 단백질 96 깊은 웰 플레이트에 각 교정기, 응답 계수, 및 (사용 된 경우 품질 관리 [QC] 샘플 포함) 미지 시료의 0.18 mL를 넣고 (전체 판을 가정하는 데 사용됩니다). 에 샘플을 추가해야하거나, 우물의 바닥에 근접합니다.
- 각 웰 (즉, 교정기, 응답 인자, QCS, 그리고 미지수)에 내부 표준의 20 μL를 추가; 이는 피펫 팁을 침지하지 않고 시료 표면에 충분히 가까운 측의 방울을 방출하는 것이 중요하다.
- 각 웰에 0.2 ㎖의 5 M 구아니딘 염산염을 추가합니다.
- 마이크로 통에 샘플 플레이트를 배치하고 1,100 rpm에서 45 분 동안 샘플을 섞는다. 최적의 주파수는 기기에 따라 다를 수 있습니다. 혼합기의 주파수 및 진폭을 설정 용액 철저히 혼합하고, 내부 표준 또는 CSF의 어떠한 방울을 웰의 측면에 섞이지 남지 않도록.
- 4 % 인산 0.2 mL를 넣고또한 각. 소용돌이 간략하게 섞는다.
6. 고체 단계 추출
참고 : 모든 세척,로드 및 용출 단계에서는 솔루션을 추가 한 후 가장 낮은 진공을 적용하고로드하거나 솔루션을 용출 필요에 따라 점차적으로 증가한다. 각각의로드 및 용출 단계 사이의 진공을 해제합니다.
- 혼합 모드에서 폐기물 저장소 트레이를 넣고 추출 플레이트 매니 폴드 챔버 내에서 양이온 교환, 96 웰 고체상 추출 (SPE) 판.
- 각 웰에 0.2 ㎖의 메탄올을 첨가하여 SPE 흡착제를 조정.
- 각 웰에 4 % 인산 0.2 mL를 첨가하여 흡착 평형.
- 특수 목적 판에 깊은 웰 플레이트에서 모든 샘플 (각 웰 약 0.62 ㎖)에 전송합니다. 특수 목적 판에 깊은 웰 플레이트에서 샘플을 전송할 때 8 채널 피펫을 사용하여; 샘플이 인턴 포함 이래로, 모든 시료의 전체 또는 같은 부피를 전송하는 것이 중요하지 않다변화를 보상합니다 알 표준입니다.
- 샘플을 각 웰에 4 % 인산 0.2 mL를 첨가하여 통과 한 후 흡착제를 세척한다.
- 세정 용매 흡착제에서 용출 한 후, 컬렉션 플레이트 또는 튜브 저수지 트레이를 교체합니다.
- 배 75 % ACN / 10 % 농축 암모니아 50 μL를 첨가하여 흡착제로부터 시료를 용출하고,이 용액이 흡착제를 통과하는 매우 낮은 진공을 요구주의. 각 추가 사이의 진공을 해제해야합니다.
- 선택 사항 : 컬렉션 플레이트 또는 튜브를 밀봉하고 -80 ° C에서 그들을 고정. 6.8.2 단계로 진행하기 전에 수집 판 또는 튜브에서 씰을 제거합니다.
- (열을 가하지 않고) 진공 원심 분리를 이용하여 용출액을 건조; 이것은 진공 원심 분리기에 따라 몇 시간이 하나로부터 취할 수있다.
- 용기를 밀봉하고 -80 ° C에서 그들을 고정.
7. 액체 크로마토 그래피에그래피로
- , 바늘 세척 (50 % ACN (ACN [V / V]에서 4 % 탈 이온수와 0.1 % 농축 암모니아), B (탈 이온수 [V / V] 5 % ACN 0.3 % 농축 암모니아) 모바일 A 상을 준비 4 %가 탈 물에 암모니아를 집중 [V / V]).
- 이동상 A의 500 ㎖를 들어, ACN 25 mL의 탈 이온수에 집중 암모니아 1.5 mL를 넣어. 탈 이온수 500 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다.
- 이동상 B의 500 ㎖를 들어, 진한 암모니아 500 μL와 ACN을 증류수 25 mL를 첨가. ACN 500 mL의에 최종 볼륨을 조정합니다.
- ACN 120 mL의 탈 이온수에 집중 암모니아 10 ㎖를 추가하여 바늘 세척 250 mL로 준비합니다. 탈 이온수 250 mL의에 최종 볼륨을 조정합니다.
- 액정 시스템을 사용하기 전에 20 분 동안 초음파 욕조에서 열린 이동상 A와 B와 바늘 세척 병을 넣어
- 25 μL 집중하고 % ACN 20 %의 4 각 샘플을 녹여테드 암모니아 용액을 20 분 동안 진탕에 배치합니다. 샘플 아래 원심 분리기 및 자동 시료 주입기에 배치 (7 ° C로 유지).
- 50 ° C로 유지 된 1 × 250mm이 폴리스티렌 - 디 비닐 벤젠 (역상) 모노리스 컬럼 시료 20 μL를 주입한다.
- 0.3 mL / 분의 유속으로 표 4에 나타낸 LC 구배를 사용한다. 질량 분광계 오염을 감소시키기위한 전환 밸브를 사용하여 (이후 열) 낭비 처음 두 개의 지난 5 분 전환.
8. 질량 분석
주의 : 이러한 파라미터 aheated 전기 분무 이온화 소스를 구비 한 하이브리드 orbitrap 극자 질량 분광계를 사용 하였다.
- 표 5에 따라 이온 소스의 매개 변수를 설정합니다.
- (네이티브 Aβ 1-42의 4+ 충전 상태를 분리 1,129.48 질량을 MS 악기를 설정2.5 m / z의 분리 폭을 갖는 사중 극 질량 분석 장치에 충전 비율 [의 m / z), 1-42 15 NAβ (1,143.00 m / z), 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z).
- 17.0의 충돌 에너지 정규화 (NCE)에 충돌 셀의 격리 펩타이드 조각. (예를 들면, 삼중 사중 MS와 같은 악기의 다른 형태를 사용하여, 특히 경우)에도 동일한 형태의 이것은 각 기기 조율 할 필요가 있습니다.
- 2 × 5 요금 자동 이득 제어 대상 및 250 ms의 최대 분사 시간과, 17.500의 해상도 단편 스펙트럼을 기록한다.
9. 데이터 처리
- 각 펩티드에 대한 크로마토 그래피 영역을 계산하기 표 6 (± 250 밀리 질량 부 [MMU]의 질량 공차) 생성물 이온의 합을 사용한다. 이온의 종류와 숫자가 네이티브 Aβ에 대해 표시되어 있습니다
- 천연 Aβ 1-42의 곡선 아래 영역 (15) NAβ 1-42 곡선 (크로마토 그래피 피크) 아래의 영역을 분할하여 두 응답 인자 샘플들의 평균 응답 인자를 결정한다.
- 단계 9.2에서 계산 된 반응 인자를 곱하여 보정에 사용 된 15 NAβ 1-42의 농도를 조정한다.
- 농도 대 구경 두 세트에서 13 CAβ 1-42에 NAβ 1-42 (15)의 면적비를 플로팅하여 교정 곡선을 구축.
- 선형 회귀를 사용하여 보정 곡선의 기울기 및 절편을 계산한다.
- 해제에 대한 내부 표준 (13 CAβ 1-42) 네이티브 Aβ 1-42의 면적 비율을 계산알려진 샘플.
- 단계 9.5에서 얻어진 기울기 및 절편을 이용하여 검량선으로부터 미지 시료의 농도를 추정.
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Representative Results
그림 1의 판 설치 샘플의 전체 판에 사용됩니다. 이하 미지 시료를 분석 할 경우, 제 교정기는 RF 및 QC 세트는 미지 시료의 전반부 뒤에 배치한다.
도 2에 도시 된 바와 같이, 구경이 낮은 표준 편차와, 회귀 직선에 가깝다. 이 방법은 150 pg / ml 인 4,000 pg / ml 인의 정량의 상위 레벨의 정량의 낮은 수준을 보유하고 있습니다. 교정의 잔존 표준 편차는 물론 가능한 한 낮아야한다. 보정이 비선형 인 경우, 런 (정도)에 따라 폐기되어야하고, 편차 때문에 구경 희석 잘못된 피펫 기술 및 / 또는 오류 가능성이있다. 복제의 변동 (CV)의 계수가 20 % 이하이지만, 바람직하게는 10 % 미만이어야한다.
ogether.within 페이지 = "1"> 대칭 피크 부근에 상당한 테일링없이와 동시에 LC 컬럼에서 네이티브 15 N- 13 CAβ 1-42 용출 (그들은 단지 동위 원소 수준에 차이가 있기 때문에), (그림 3 ). 적어도 열 측정은 각 크로마토 그래피 피크에 대해 수행되어야하며 장비에있어서의 최대 분사 시간 조절 될 수있다. 세가지 펩티드는 MS 분석에서 모든 측정 (캘리브레이션 RF 및 미지수) 동시에 측정 할 수있다. 방법의 감도가 만족스럽지 못한 경우에는, 관심의 펩티드 (각각 주입 측정되어야 즉. 만 RF 샘플 네이티브 구경 15 N- 13 CAβ 1-42, 1-42, 15 NAβ를 측정 ) 및 네이티브 및 미지 시료 13 CAβ 1-42.
그림 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
그림 1 : SPE과 깊은 웰 플레이트의 레이아웃. 구경의 일반적인 레이아웃 (AF), 응답 인자 샘플 (RF), 품질 관리 샘플 (QC)를 미지수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 교정 곡선. 검량선 172 15 NAβ 1-42, 572, 1,144, 2,287, 3,431 및 4,574 pg / ml 인 (반응 인자를 이용하여 조정) 인간 CSF에서 내부 표준으로서 13 CAβ 1-42를 이용하여 구성 (N = 2) . 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42의 면적 비가 플롯 (Y 축)농도 (X 축)에 대한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 크로마토 그램. 0.500 NG / ML의 기본 (내인성) Aβ 1-42 (상단 패널) 및 인간 CSF 1.6 NG / mL의 13 CAβ 1-42 (아래 패널)의 크로마토 그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 미지 시료에 알 수없는 Aβ 1-42의 정량화 <./ 강해> 피크 면적비는 내부 표준 (13 CAβ 1-42) 크로마토 그래피의 피크 면적과 천연 Aβ 1-42 크로마토 그래피의 피크 면적을 나누어 계산한다. 샘플의 천연 Aβ 1-42의 농도를 검량선으로부터 추정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 안전 정보. 이 프로토콜에 사용되는 화학 물질에 대한 안전 정보를 제공합니다.
| 교정기 솔루션 | 100 NG의 볼륨 / mL의 15 NAβ 1-42 용액 (㎖) ACN 20 % 및 4 %의 암모니아의 양 (mL) 중 | 최종 부피 (㎖) | 최종 농도 15 NAβ 1-42 (NG / ㎖) | |
| 에이 | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| 비 | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| 기음 | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20.00 |
| 디 | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| 이자형 | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| 에프 | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1.50 |
표 2 : 캘리브레이터 솔루션을 제공합니다. 캘리브레이터 솔루션은 20 % ACN으로 제조 된 4 % 암모니아를 농축CSF 교정기를 급상승에 사용됩니다.
| 교정기 | 교정 액을 대응하는 체적 (mL) 중 | 인간 CSF의 양 (㎖) | 최종 부피 (㎖) | 최종 15N-Aβ1-42 농도 (NG / ㎖) |
| 에이 | 0.02 (A) | 0.18 | 0.20 | 4.00 |
| 비 | 0.02 (B) | 0.18 | 0.20 | 3.00 |
| 기음 | 0.02 (C) | 0.18 | 0.20 | 2.00 |
| 디 | 0.02 (D) | 0.18 | 0.20 | 1.00 |
| 이자형 | 0.02 (E) | 0.18 | 0.20 | 0.50 |
| 에프 | 0.02 (F) | 0.18 | 0.20 | 0.15 |
표 3 : 구경. 인간 CSF에서 제조 구경.
| 시간 (분) | % 이동상 B |
| 0 | (5) |
| 1 | (5) |
| 6 | (20) |
| (7) | (90) |
| 9 | (90) |
| (10) | (5) |
| (15) | (5) |
표 4 : LC 구배. 300 μL / 분의 일정한 유속에서 사용되는 LC 구배.
| 매개 변수 | 값 |
| 시스 가스 | (50) |
| 보조 가스 | 6 |
| 스프레이 전압 | 4.4 kV의 |
| S-렌즈 RF | (61) |
| 히터 온도 | 190 ° C |
| 모세관 온도 | 350 ° C |
표 5 : 이온 소스 설정. 이온 소스의 매개 변수는 악기의 튜닝 소프트웨어에서 설정합니다.
| 전구체 이온 | 제품 이온 |
| 기본 Aβ1-42 (m / z 1129.58, 4+) | 915.19 (b334의 +), 943.21 (b344의 +), 975.98 (b354의 +), 1000.74 (b364의 +), 1029.51 (B384의 +), (10)54.03 (B394의 +), 1078.79 (보 간부 B (404)의 +), 1107.06 (b414의 +), 1163.23 (b313의 +), 1200.25 (b323의 +), 1257.29 (b343의 +), 1300.96 (b353의 +), 1333.66 (b363의 +), 1372.00 (B383의 +), 1405.02 (b393의 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1143.00, 4+) | 926.41, 954.68, 987.95, 1012.71, 1041.22, 1066.99, 1091.75, 1120.28, 1177.18, 1215.55, 1272.58, 1316.92, 1349.94, 1388.63, 1422.31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1179.50, 4+) | 955.33, 985.11, 1019.37, 1045.14, 1074.65, 1100.67, 1126.69, 1156.40, 1253.43, 1313.14, 1358.50, 1393.19, 1432.21, 1466.90 |
표 6 : 정량에 사용되는 이온. 전구체 이온 4+ 전하 상태는 2.5 m / z의 분리 폭은 사중 극자 질량 분석기로 분리된다. (± 250 MMU의 질량 공차) 생성물 이온은 각각의 펩타이드에 대한 크로마토 그래피 영역을 계산하는 데 사용된다. 이온 종류와 숫자이다 ONLY는 15 NAβ 1-42 13 CAβ 1-42 모두 동일하기 때문에, 원시 Aβ 1-42 제품 이온 도시.
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Discussion
상술 한 방법 대신 대용 행렬을 이용하여, 우리는 인간 CSF의 교정을 가능하게 대리 분석 방법 13, 14, 15, 16을 사용 하였다. 대리 분석 방법은 두 가지 동위 원소 표지 된 표준을 포함한다. 또 (13 CAβ 142) 내부 표준으로 사용되는 동안 온 (15 NAβ 142), 인간 CSF의 보정 곡선을 생성하는데 사용된다. 교정 곡선이 계산 내인성 Aβ 13분의 142 CAβ (142)의 비율로 15 NAβ 13분의 142 CAβ 142 비율을 사용하여 구성에서 알 수없는 내인성 Aβ (142) 농도는 추정하고 있습니다. 142 복구 아무 검체없는 CSF를 사용할 수 없으며, 낮은 Aβ 때문에 대리 분석 방법을 사용 하였다방법 개발 과정에서 대리 매트릭스에서 네이티브 Aβ (142) 사용시 관찰되었다.
NAβ 142 천연 Aβ 142 15 이후 공지 농도 15 NAβ 142 천연 Aβ (142)의 동일한 농도를 함유하는 RF 샘플 - 인공 CSF 시료의 측정에 의해 조절되면, MS 15 NAβ (142)의 농도가 서로 다른 응답을 제공 할 수있다 때문에 15의 동위 원소 순도 가능한 변화에 다른 질량 분석기 사이에 다를 수 있습니다 AAA.The 응답 인자에 의해 결정 일괄 사이에 펩티드를 N 표지. 따라서, 응답 인자를 각각의 측정 일에 대해 결정되어야한다.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 구경 및 RF 샘플들의 준비이다. 특히 Aβ 1-42 Aβ 펩타이드는, 매우 소수성 쉽게 피펫 팁에 충실ND 튜브 8, 17, 18면. 피펫 중에 Aβ 펩타이드의 손실을 최소화하기 위해서는 전송 이전 피펫 팁을 포화 매우 중요하다. 바람직하게는, 펩티드 용액의 세 권 전에 새로운 튜브 함유 용액에 배달 폐기해야합니다. 원액의 부피 및 농도에 따라, 이는 항상 가능한 것은 아니다. 두 번째로 가장 좋은 방법은 가입 전에 배달 3 배 아래로 펩타이드 솔루션을 피펫하는 과정이다. 동일한 이유로, 큰 공극 부피를 방지 튜브에 적합한 크기를 사용하는 것이 중요하다.
방법에 대해 이전에 게시 된 데이터는 복구가 100 % (15 %) 15 내 것을 보여준다. 백 계산 교정기에 대한 상대 오류는 교정 곡선 (19)에 의해 정의 된 전체 범위의 15 % 이하였다.
하나 오이 기술의 bvious 한계는 낮은 스루풋 자동 면역 비교되는 점이다. 그러나, 상술 한 방법의 목적은 높은 정확도 아니라 처리량이다. 이 방법은도 19 짧다 Aβ 1-38 및 Aβ -1- (40)를 포함하도록 확장 될 수있다. 이 방법의 또 다른 제한은 운영자가 악기의 분석을 실행하기 전에 광범위한 질량 분석 훈련이 필요 것입니다.
면역 분석법을 사용하여 정량은 항체 및 항원 사이의 상호 작용에 의존한다. 이 상호 작용을 방해하거나 상호 작용과 경쟁 할 수 시료 성분의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 또한, 상호 작용은 또한, 항원의 형태에 의해 영향을받을 수있다. 이러한 효과의 제어가 곤란하며,이 면역 플랫폼 사이의 실험실 결과 사이의 조화 어려웠다 주된 이유가 될 것으로 생각된다. 벡MS와 ause 정량 직접 안정 동위 원소 표지 표준을 기준으로 대상 분자를 계산에 기반, 정량는 매트릭스 효과에 의해 절대 일반적으로 영향을받지 않습니다. 따라서 비교 향상, LC-MS / MS 및 RMPS 안정 동위 원소 표지 된 내부 표준 물질과 CRM을 검증에서 또한 면역 의한 진단용 단백질 측정은, 고차의 측정 절차 및 재료 깨지지 체인에 의해지지되어야하며 결과 20, 21의 신뢰성.
결론적으로, CSF에서 Aβ (142)의 측정에 대한 설명 RMP는 CSF에서 Aβ (142)의 일반 컷오프 농도를 설정하는 데 도움이됩니다 CRM 개발에 중요한 단계이다. 정확한 컷 - 오프 정확하게 초기 AD의 진단에 매우 중요하며 질병 변경 약물의 새로운 유형이 병원에 도달했을 때 가장 중요합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
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