Introduction
Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz und betrifft etwa 35 Millionen Menschen weltweit 1. Die neuropathologischen Kennzeichen der Krankheit weit verbreitet in den Mittelpunkt der AD Pathogenese zu liegen glaubte , sind intrazelluläre Neurofibrillen von hyperphosphorylated Tau - Protein 2 und extrazellulären Plaques , bestehend aus aggregierten Amyloid-beta (Aß) Peptide 3. Im Einklang mit dieser Situation hat die Beurteilung der Plaque Pathologie in vivo durch Biomarker vor kurzem in den Forschungs diagnostischen Kriterien für AD 4 aufgenommen. Für CSF Messungen von Aß 1-42, sind mehrere Immunoassays zur Verfügung und werden in vielen klinischen Laboratorien 5 verwendet. Die Konzentration von A & bgr; 1-42 in CSF beträgt ungefähr 50% niedriger in AD - Patienten als in der kognitiv normalen älteren Personen, was die Abscheidung des Peptids in Plaques im br6 ain, 7.
Diese Biomarker sind hauptsächlich unter Verwendung von Immunoassays analysiert (dh Antikörper-basierte Techniken), aber diese Assays können durch Matrixeffekte 8 beeinflusst werden. Die Verwendung von Immuntests auf verschiedenen Technologieplattformen und den Mangel an Standardisierung Assay 9, 10 aufgrund der Einführung von globalen abgeschnittene Konzentrationen schwer 11, 12. Eine analytisch validierte RMP würde die einheitliche Kalibrierung von verschiedenen Assay-Plattformen ermöglichen, idealerweise in eine bessere Vergleichbarkeit zwischen den Analyseplattformen zurückgehen und in eine bessere Kontrolle der Faktoren, die die Gesamtmess Variabilität beitragen.
Die absolute Quantifizierung von Aß 1-42 des entwickelten LC-MS / MS - Verfahren überwindet viele der Probleme im Zusammenhang mit dem Antikörper-basierten techniques. Das Verfahren, aufgeführt als RMP durch den Gemischten Ausschuss für Rückverfolgbarkeit in der Labormedizin (JCTLM Datenbank - Identifizierungsnummer C11RMP9), werden verwendet , um die absolute Konzentration von Aß 1-42 in zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) , um zu bestimmen CSF Aß 1 zu harmonisieren -42 Messungen über Techniken und Analyseplattformen. Die beschriebene Workflow sollte für die Entwicklung der Kandidatenreferenzverfahren für Peptide und Proteine in anderen Bereichen der Medizin von Bedeutung sein.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll erfordert Aliquots von mindestens 50 & mgr; l, mit einer Konzentration von 50 ug / ml für jedes Aß-Peptid, als Ausgangsmaterial. Die Aß-Peptide sollten in 20% Acetonitril (ACN) und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) und gelagert bei 80 ° C aufgelöst werden.
Achtung: Siehe Tabelle 1 für Sicherheitshinweise.
1. Herstellung der Lösungen
- Herstellung von 100 ml 20% ACN und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) mit 20 ml ACN verdünnt und 4 ml konzentrierter Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit VE-Wasser. Machen Sie jeden Tag frisch.
- Vorbereitung 50 ml 5 M Guanidin-Hydrochlorid durch Auflösen von 26,08 g Guanidin-Hydrochlorid in deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL. Aufbewahren bei 20 ° C und frisch monatlich machen.
- Bereiten 200 ml 4% ige Phosphorsäure in deionisiertem Wasser (v /v) von 9,4 ml konzentrierter Phosphorsäure verdünnen (~ 85%) in destilliertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 200 ml mit VE-Wasser. Im Kühlschrank aufbewahren und wöchentlich frisch zu machen.
- Vorbereitung 50 ml 75% ACN und 10% konzentrierter Ammoniaklösung (v / v) in entionisiertem Wasser mit 37,5 ml ACN verdünnt und 5 ml konzentriertem Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml mit VE-Wasser. Machen Sie jeden Tag frisch.
- mindestens 2,5 ml menschlichen CSF für die Kalibratoren auftauen, von de-identifizierte übrig gebliebenen Proben aus der klinischen Routine-Analyse erhalten.
- Bereiten künstlichen CSF, enthaltend 150 mM Na, 3,0 mM K 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P, und 155 mM Cl in deionisiertem Wasser und fügen Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von 4 mg / mL. Nur 1 ml pro Analyse benötigt, sondern bereiten ein großes Volumen, aliquoten es und Speicher für den späteren Gebrauch.
2. Herstellung der Kalibratoren
- Bereiten 0,5 ml 4 & mgr; g / mL 15 NAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 40 & mgr; l von 50 & mgr; g / mL 15 NAβ 142 bis 0,46 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einer 0,5-ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
- Bereiten 2 ml 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 50 & mgr; l der 4 & mgr; g / mL 15 NAβ 142-1,95 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
- Bereiten Sie sechs Kalibratorlösungen (AF) durch die Volumina jeder Lösung in Tabelle 2 angegeben zu mischen. Verwenden Sie 0,5, 1,5 und 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
- Bereiten Sie die endgültige Kalibratoren (in zweifacher Ausfertigung) in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch die entsprechenden Kalibrierlösungen Hinzufügen und menschlichen CSF gemäß Tabelle 3. Mischen auf einem Vortex-Mischer für 1 min.
3. Vorbereitung des internen Standards
- Bereiten 2 ml von 0,8 & mgr; g / mL 13 CAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 32 & mgr; l von 50 & mgr; g / mL 13 CAβ 142 bis 1,968 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
- Bereiten 5 ml 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 0,1 ml von 0,8 ug / ml bis 4,9 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
4. Vorbereitung der Responsefaktor Probe
HINWEIS: Die Responsefaktor (RF) Bestimmung wird durchgeführt , um die Konzentration des markierten Peptids zur Kalibrierung (15 NAβ 1-42) verwendet zu bestimmen. Dies erfordert , dass die Konzentration des nativen Aß 1-42 Peptid wurde unter Verwendung von Aminosäureanalyse (AAA) bestimmt. Somit wird das Volumen und die Konzentration von nativen Aß 1-42 Peptid Aliquotsmüssen die Anforderungen der AAA zu erfüllen.
- Bereiten 0,5 ml 4 & mgr; g / mL nativen (unmarkiert) A & bgr; 1-42 durch Zugabe von 40 ul von 50 ug / ml nativem Aß 1-42 bis 0,46 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einer 0,5-ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
- Bereiten Sie eine 2-ml 40 ng / ml Mischung aus einheimischen und 15 NAβ 1-42 durch Zugabe von 20 & mgr; l von 4 ug / ml nativen Aß 1-42 und 20 & mgr; l von 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 bis 1,96 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
- In 20 ul der 40 ng / ml Mischung auf 0,38 ml künstlichem CSF in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie Duplikate und mischen auf einem Vortex-Mischer für 1 min.
5. Probenvorbereitung
HINWEIS: auftauen die Proben auf einer Walze bei Raumtemperatur gemessen werden.
- In 0,18 ml jeder Kalibrator, Responsefaktor und unbekannten Probe (einschließlich der Qualitätskontrolle [QC] Proben, falls verwendet) zu einem 1 ml Protein 96-Deep-Well - Platte, nach 1 (eine vollständige Platte unter der Annahme verwendet wird ). Achten Sie darauf, um die Proben in oder in der Nähe, der Boden der Vertiefungen hinzuzufügen.
- In 20 ul des internen Standards in jede Vertiefung (dh Kalibratoren, Responsefaktoren, QCs und Unbekannten); ist es entscheidend, den Tropfen an der Seite des Schachts nahe der Oberfläche der Probe zu lösen, ohne die Pipettenspitze eingetaucht.
- In 0,2 ml 5 M Guanidin-Hydrochlorid in jede Vertiefung.
- Platzieren Sie die Probenplatte auf einem Schüttler und mischen Sie die Proben für 45 Minuten bei 1100 Umdrehungen pro Minute. Die optimale Frequenz kann je nach Instrumentierung abweichen. Die Frequenz und Amplitude des Mischers so, dass die Lösungen gründlich gemischt und keine Tropfen des internen Standards oder CSF sind auf der Seite der Vertiefungen ungemischten gelassen.
- In 0,2 ml 4% Phosphorsäurezu gut jeder. Vortex kurz mischen.
6. Festphasenextraktion
HINWEIS: In jedem Waschen, Laden und Eluierungsschritte gelten die niedrigste mögliche Vakuum nach Zugabe der Lösung ist und schrittweise nach Bedarf erhöhen, um die Lösung zu laden oder zu eluieren. Deaktivieren Sie das Vakuum zwischen jedem Lade- und Elutionsschritt.
- Setzen Sie ein Vorratsfach für Abfall unter einem gemischten Modus, Kationenaustausch, 96-Well Festphasenextraktion (SPE) Platte in der Extraktionsplatte Verteilerkammer.
- Erhaltung der SPE Sorbens durch Zugabe von 0,2 ml Methanol zu jeder Vertiefung.
- Äquilibrieren das Sorbens durch Zugabe von 0,2 ml 4% ige Phosphorsäure zu jeder Vertiefung.
- Übertragen Sie alle Proben (etwa 0,62 ml in jeder Vertiefung) aus dem Deep-Well-Platte an der SPE-Platte. Verwenden Sie einen Acht-Kanal-Pipette, wenn die Proben aus dem Deep-Well-Platte an der SPE-Platte zu übertragen; es ist nicht entscheidend, um die gesamte oder gleiche Volumina aller Proben zu übertragen, da die Proben einen Praktikanten enthaltenal-Standard, der für Variationen kompensieren.
- Waschen des Sorbens, nachdem die Proben durch Zugabe von 0,2 ml 4% -iger Phosphorsäure in jede Vertiefung durchlaufen haben.
- Nach dem Waschlösungsmittels aus dem Sorbens eluiert wurde, mit einer Sammelplatte oder Rohre, die die Vorratsfach ersetzen.
- Eluieren der Probe aus dem Sorbens durch zweimalige Zugabe von 50 & mgr; l von 75% ACN / 10% konzentriertem Ammoniak, und beachten Sie, dass diese Lösung eine sehr niedrige Vakuum erfordert durch das Sorbens zu passieren. Denken Sie daran, das Vakuum zwischen jeder Zugabe zu deaktivieren.
- Optional: Verschließen Sie die Sammelplatte oder Rohre und sie bei -80 ° C einfrieren. Entfernen Sie die Dichtung von der Sammelplatte oder Rohre vor 6.8.2 zu Schritt fortfahren.
- Trocknen Sie die Eluate durch Verwendung von Vakuum-Zentrifugation (ohne Anwendung von Wärme); Dies kann von einem bis zu mehreren Stunden dauern, abhängig von der Vakuumzentrifuge.
- Verschließen Sie die Behälter und frieren sie bei -80 ° C.
7. Flüssige Chromatographie
- Vorbereitung der mobilen Phase A (5% ACN und 0,3% konzentriertem Ammoniak in entionisiertem Wasser [v / v]), B (4% deionisiertes Wasser und 0,1% konzentriertem Ammoniak in ACN [v / v]) und Nadelspülung (50% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in entsalztem Wasser [v / v]).
- Für 500 ml der mobilen Phase A, 25 ml ACN und 1,5 ml konzentrierter Ammoniak zu entionisiertem Wasser. Stellen Sie die endgültige Volumen auf 500 ml mit VE-Wasser.
- Für 500 ml der mobilen Phase B, 500 & mgr; l konzentrierter Ammoniak und 25 ml VE-Wasser zu ACN. Stellen Sie die endgültige Volumen auf 500 ml mit ACN.
- Bereiten 250 ml Nadelspülung durch Zugabe von 120 ml ACN und 10 ml konzentriertem Ammoniak zu entionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 250 ml mit entionisiertem Wasser.
- Setzen Sie den mobilen Phasen A und B und Nadelwaschflaschen öffnet in einem Ultraschallbad für 20 Minuten vor dem Gebrauch mit dem LC-System
- Man löst jede Probe mit 25 & mgr; l von 20% ACN und 4% KonzenAmmoniaklösung ted und legen Sie sie auf einem Schüttler für 20 min. Zentrifuge nach unten den Proben und legen Sie sie in den Autosampler (halten bei 7 ° C).
- Injizieren 20 ul der Probe auf einem 1 x 250 mm 2 Polystyrol-Divinylbenzol (Reversed Phase) monolithische Säule bei 50 ° C gehalten.
- Verwenden , um die LC - Gradienten in Tabelle 4 gezeigt mit einer Durchflussrate von 0,3 mL / min. Umleiten die ersten beiden und die letzten fünf Minuten zu verschwenden (post-Säule) unter Verwendung eines Umleitungsventil, um die Verunreinigung des Massenspektrometers zu reduzieren.
8. massenspektrometrische Analyse
HINWEIS: Diese Parameter für einen Quadrupol-Orbitrap Hybrid-Massenspektrometer mit aheated Elektrospray-Ionisierung Quelle ausgestattet verwendet wurden.
- Die Parameter für den Ionenquelle gemäß Tabelle 5.
- Stellen Sie das MS - Gerät die 4+ Ladungszustände von nativen Aß 1-42 (1,129.48 Massen zu isolierenLadungs-Verhältnis [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1.143,00 m / z) und 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) in der Quadrupol - Massenanalysator mit einer Isolationsbreite von 2,5 m / z.
- Fragment, das die isolierten Peptide in der Kollisionszelle mit einer normalisierten Kollisionsenergie (NCE) von 17,0. Diese müssen möglicherweise für jedes Instrument, selbst des gleichen Typs abgestimmt werden (und insbesondere dann, wenn andere Arten von Instrumenten, wie beispielsweise einem Triple-Quadrupol-MS).
- Notieren Sie sich die Fragmentspektren mit einer Auflösung von 17.500, mit einer automatischen Verstärkungsregelung Ziel von 2 x 10 5 Kosten und einem maximalen Einspritzzeit von 250 ms.
9. Datenverarbeitung
- Verwenden , um die Summe der Produkt - Ionen (mit einem Massentoleranz von ± 250 Millimasseneinheiten [MMU]) in Tabelle 6 die chromatographischen Bereiche für jedes Peptid berechnet. Beachten Sie, dass die Ionenarten und Zahlen werden nur für die native Aß gezeigt
- Bestimmen Sie die durchschnittliche Reaktionsfaktor der beiden Reaktionsfaktor Proben durch die Fläche unter der Kurve dividiert (chromatographischen Peak) von 15 NAβ 1-42 mit der Fläche unter der Kurve von nativen Aß 1-42.
- Stellen Sie die Konzentration des 15 NAβ 1-42 für die Kalibrierung verwendet , indem er mit dem Reaktionsfaktor in Schritt 9.2 berechnet multipliziert wird .
- Einer Eichkurve , die durch die Flächenverhältnisse von 15 NAβ 1-42 bis 13 CAβ 1-42 von den beiden Sätzen von Kalibratoren gegen die Konzentration aufgetragen ist .
- Berechnen der Steigung und Achsenabschnitt der Kalibrierungskurve lineare Regression verwendet wird.
- Berechnen Sie den Flächenverhältnis von nativen Aß 1-42 auf den internen Standard (13 CAβ 1-42) für unbekannten Proben.
- Extrapolation der Konzentration von unbekannten Proben aus der Kalibrierungskurve unter Verwendung der Steigung und Achsenabschnitt in Schritt 9.5.
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Representative Results
Die Platte Setup in Abbildung 1 für eine volle Platte der Proben verwendet. Wenn weniger unbekannte Proben zu analysieren, sollte der zweite Kalibrator, RF, und QC-Sets nach der ersten Hälfte der unbekannten Proben platziert werden.
Wie in Figur 2 zu sehen ist , sind die Kalibratoren nahe der Regressionslinie mit geringen Standardabweichungen. Diese Methode hat einen geringeren Grad an Quantifizierung von 150 pg / ml und einer oberen Ebene der Quantifizierung von 4000 pg / mL. Die Reststandardabweichung der Kalibrierung natürlich so gering wie möglich sein. Wenn die Kalibrierung nicht-linear ist, sollte der Durchlauf verworfen werden (je nach Schweregrad), und die Abweichung ist sehr wahrscheinlich durch falsche Pipettiertechnik und / oder Fehler in der Verdünnung von Kalibratoren. Der Variationskoeffizient (CV) der Replikate sollte unter 20% liegen, bevorzugt jedoch unter 10%.
ogether.within-page = "1"> Die native 15 N- und 13 CAβ 1-42 elute von der LC - Säule gleichzeitig (da sie nur auf der Isotopen - Ebene unterscheiden), mit der Nähe von symmetrischen Spitzen und ohne signifikante tailing (Abbildung 3 ). Mindestens zehn Messungen sollten für jeden chromatographischen Peaks durchgeführt werden und können mit der maximalen Einspritzzeit in dem Instrument Verfahren eingestellt werden. Alle drei Peptide können gleichzeitig für alle Messungen (Kalibrierung, RF, und Unbekannten) während der MS-Analyse gemessen werden. Wenn jedoch die Empfindlichkeit des Verfahrens suboptimal ist, nur Peptide von Interesse sollte für jede Injektion gemessen werden (dh., Messen nur 15 N- und 13 CAβ 1-42 für Kalibratoren, einheimische und 15 NAβ 1-42 für RF - Proben, und native und 13 CAβ 1-42 für unbekannte Proben).
Abbildung 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Abbildung 1: Die Pläne der SPE und Deep-Well - Platten. Typische Layout Kalibratoren (AF), Responsefaktor Probe (RF), Qualitätskontrollproben (QC), und Unbekannten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Eichkurve. Kalibrierkurve konstruiert 15 NAβ 1-42 bei 172 mit, 572, 1144, 2287, 3431 und 4574 pg / mL (bereinigt mit dem Responsefaktor) und 13 CAβ 1-42 als interner Standard in der menschlichen CSF (n = 2) . Das Flächenverhältnis von 15 NAβ 1-42 / 13 1-42 CAβ aufgetragen (Y-Achse)gegen die Konzentration (X-Achse). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3: Chromatogramm. Chromatogramm von 0,500 ng / ml nativen (endogen) Aß 1-42 (oben) und 1,6 ng / ml 13 CAβ 1-42 (unten) in der menschlichen CSF. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Quantifizierung unbekannter Aß 1-42 in unbekannten Proben <./ strong> Das Verhältnis Peakfläche wird berechnet, indem die native Aß 1-42 chromatographischen Peakfläche mit dem internen Standard (13 CAβ 1-42) chromatographische Peakfläche berechnet. Die Konzentration von nativem Aß 1-42 in der Probe wird aus der Eichkurve extrapoliert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Sicherheitshinweise. Sicherheitshinweise für Chemikalien für dieses Protokoll verwendet.
| Kalibratorlösung | Volumen von 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 - Lösung (ml) Volumen von 20% ACN & 4% Ammoniak (ml) | Endvolumen (ml) | Finale 15 NAβ 1-42 Konzentration (ng / ml) | |
| EIN | 0,20 | 0,30 | 0,50 | 40.00 |
| B | 0,15 | 0,35 | 0,50 | 30.00 |
| C | 0,20 | 0,80 | 1,00 | 20.00 |
| D | 0,10 | 0,90 | 1,00 | 10.00 |
| E | 0,05 | 0,95 | 1,00 | 5.00 |
| F | 0,03 | 1,97 | 2.00 | 1.50 |
Tabelle 2: Kalibrator - Lösungen. Kalibrator-Lösungen in 20% ACN hergestellt und 4% konzentriertem Ammoniakfür Spick CSF Kalibratoren verwendet.
| Calibrator | Volumen der entsprechenden Kalibratorlösung (ml) | Volumen des menschlichen CSF (ml) | Endvolumen (ml) | Endgültige 15N-Aß1-42 Konzentration (ng / ml) |
| EIN | 0.02 (A) | 0,18 | 0,20 | 4.00 |
| B | 0,02 (B) | 0,18 | 0,20 | 3,00 |
| C | 0,02 (C) | 0,18 | 0,20 | 2.00 |
| D | 0,02 (D) | 0,18 | 0,20 | 1,00 |
| E | 0,02 (E) | 0,18 | 0,20 | 0,50 |
| F | 0,02 (F) | 0,18 | 0,20 | 0,15 |
Tabelle 3: Kalibratoren. Kalibratoren in menschlichen CSF hergestellt.
| Zeit (min) | % Mobile Phase B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabelle 4: LC - Gradienten. Der Gradient LC verwendet, um mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 300 ul / min.
| Parameter | Wert |
| Sheathgas | 50 |
| Hilfsgas | 6 |
| Spray Spannung | 4,4 kV |
| S-Objektiv RF | 61 |
| Heizungstemperatur | +190 ° C |
| Kapillar-Temperatur | +350 ° C |
Tabelle 5: Ionenquellen - Einstellungen. Die Parameter für die Ionenquelle werden in der Instrumentenabstimmung Software eingestellt.
| Precursor Ion | Produkt - Ionen |
| Nativer Aß 1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (B334 +), 943,21 (B344 +), 975,98 (B354 +), 1000,74 (B364 +), 1029,51 (B384 +), 1054.03 (b394 +), 1078,79 (B404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (B313 +), 1200,25 (B323 +), 1257,29 (B343 +), 1300,96 (B353 +), 1333,66 (B363 +), 1372,00 (B383 +), 1405,02 (b393 +) |
| 15N-Aß1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1012,71, 1041,22, 1066,99, 1091,75, 1120,28, 1177,18, 1215,55, 1272,58, 1316,92, 1349,94, 1388,63, 1422,31 |
| 13C-Aß 1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1019,37, 1045,14, 1074,65, 1100,67, 1126,69, 1156,40, 1253,43, 1313,14, 1358,50, 1393,19, 1432,21, 1466,90 |
Tabelle 6: Ionen für die Quantifizierung verwendet. Die 4+ Ladungszustände der Vorläuferionen in der Quadrupol - Massenanalysator mit einer Isolationsbreite von 2,5 m / z isoliert. Die Produkt-Ionen (mit einem Masse-Toleranz von ± 250 MMU) verwendet, um die chromatographische Bereiche für jedes Peptid berechnet. Ion-Typen und Zahlen sind only für native Aß 1-42 Produkt - Ionen gezeigt, da sie die gleichen für beide 15 NAβ 1-42 und 13 CAβ 1-42 sind.
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Discussion
Für das Verfahren beschrieben, stattdessen eine Ersatzmatrix zu verwenden, haben wir den Surrogat - Analyt - Ansatz 13, 14, 15, 16, die Kalibrierung im menschlichen CSF ermöglicht. Der Ersatz Analyt Ansatz beinhaltet zwei verschiedene isotopenmarkierten Standards. Eine (15 NAβ 142) wird verwendet , um die Kalibrierungskurve in menschlichen CSF zu erzeugen, während eine andere (13 CAβ 142) als interner Standard verwendet wird. Unbekannt endogene Aß 142 Konzentrationen werden dann aus der Eichkurve extrapoliert , die 15 NAβ 142/13 CAβ 142 Verhältnis durch den berechneten endogene Aß 142/13 CAβ 142 Verhältnis unter Verwendung konstruiert. Der Ersatz Analyt Ansatz verwendet wurde , da es kein Analyt freie CSF zur Verfügung steht, und niedrige Aß 142 Erholungwurde beobachtet , wenn in einem Surrogat - Matrix während der Methodenentwicklung unter Verwendung von nativen Aß - 142.
Seit 15 NAβ 142 und native Aß 142 kann unterschiedliche Reaktionen in den MS geben, um die Konzentration von 15 NAβ 142 eingestellt , indem eine HF - Probe-eine künstliche CSF Probe gemessen , die gleiche Konzentrationen von 15 NAβ 142 und nativen Aß - 142, mit einer bekannten Konzentration durch AAA.The Ansprechfaktor bestimmt könnte zwischen verschiedenen Massenspektrometern durch mögliche Schwankungen in der Isotopenreinheit des 15 N-markierten Peptid zwischen den Chargen variieren. Somit sollte die Reaktionsfaktor für jede Messung Tag bestimmt werden.
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Vorbereitung der Kalibratoren und die RF-Proben. Aß - Peptide, insbesondere Aß 1-42, sind sehr hydrophob und haften leicht an Pipettenspitzen einnd Rohre Flächen 8, 17, 18. Um den Verlust von Aß-Peptiden während des Pipettierens zu minimieren, ist es extrem wichtig, um die Pipettenspitzen vor der Auslieferung zu sättigen. Vorzugsweise sollten drei Volumina Peptidlösung in ein neues Röhrchen enthaltenden Lösung vor der Auslieferung verworfen werden. Je nach dem Volumen und der Konzentration der Vorratslösung, ist dies nicht immer möglich. nach oben und unten dreimal vor der Auslieferung Der zweitbeste Ansatz ist natürlich die Peptidlösung zu pipettieren. Aus dem gleichen Grund ist es wichtig, geeignete Größen für die Rohre zu verwenden, vermeidet große Hohlraumvolumina.
Bisher veröffentlichte Daten für das Verfahren zeigen , dass die Erholung innerhalb von 100% betrug (15%) 15. Die relativen Fehler für die zurückgerechneten Kalibratoren waren weniger als 15% des gesamten Bereichs durch die Kalibratorkurve 19 definiert.
Ein obvious Einschränkung dieser Technik ist, dass es mit niedrigem Durchsatz Immunoassays im Vergleich zu automatisiert. Jedoch ist der Zweck der beschriebenen Verfahren eine hohe Genauigkeit und nicht den Durchsatz. Dieses Verfahren kann auch 1- 40 zu schließen Aß 1-38 und A & bgr; 19 erweitert werden , die kürzer sind. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass der Betreiber umfangreiche Massenspektrometrie Ausbildung benötigen, bevor die Analyse auf dem Gerät läuft.
Quantifizierung Immunoassays unter Verwendung hängt von der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und dem Antigen. Diese Wechselwirkung kann durch die Anwesenheit von Probenkomponenten beeinflusst werden, die mit der Wechselwirkung stören oder konkurrieren. Darüber hinaus kann die Wechselwirkung auch durch die Konformation des Antigens beeinflusst werden. Diese Effekte sind schwer zu kontrollieren und sind vermutlich der Hauptgrund, warum es schwierig war, Ergebnisse zwischen Immunoassay-Plattformen und zwischen den Laboratorien zu harmonisieren. BecAUSE Quantifizierung mit MS setzt direkt auf die Zielmoleküle zu einem stabilen, isotopenmarkierten Standard relativ zu zählen, Quantifizierung ist absolut und in der Regel nicht betroffen von solchen Matrixeffekte. Darüber hinaus sollten diagnostische Proteinmessungen von Immunoassays durch eine ununterbrochene Kette von höherer Ordnung Messverfahren und Materialien unterstützt werden, von LC-MS validiert / MS und stabil, isotopenmarkierten internen Standards zu RMPs und CRM, so dass die Vergleichbarkeit zu verbessern und Zuverlässigkeit der Ergebnisse 20, 21.
Abschließend ist die beschriebene RMP für die Messung von Aß 142 in CSF ein wichtiger Schritt in eine CRM - Entwicklung , die allgemeine Cut-off - Konzentration für Aß 142 in CSF zu etablieren helfen. Exakte cut-offs sind sehr wichtig für eine genaue Diagnose von frühen AD und sind von größter Bedeutung, wenn neue Arten von disease modifying Drogen in die Klinik erreichen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
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