Introduction
Alzheimers sykdom (AD) er den vanligste formen for demens, og rammer om lag 35 millioner mennesker over hele verden en. De nevropatologiske kjennetegn ved sykdommen antatt å ligge i kjernen av AD patogenesen er intracellulære neurofibrillary floker av hyperfosforylisert tau protein 2 og ekstracellulære plakk som består av aggregert amyloid-beta (Ap) peptider 3. I tråd med dette har vurderingen av plakk patologi in vivo av biomarkører nylig blitt inkludert i forsknings diagnostiske kriteriene for AD 4. For CSF målinger av Ap 1-42 rekke immunologiske analyser tilgjengelig og brukes i mange kliniske laboratorier 5. Konsentrasjonen av Ap 1-42 i CSF er omtrent 50% lavere i AD pasienter enn i de kognitivt normale eldre, reflekterer avsetning av peptidet i plakk i brain 6, 7.
Disse biomarkører er i hovedsak analysert ved hjelp av immunologiske analyser (dvs. antistoffbaserte teknikker), men disse analysene kan være påvirket av matrix effekter 8. Bruken av immunoassays på forskjellige teknologiplattformer og mangelen på analysen standardisering 9, 10 som gjør innføringen av globale cut-off-konsentrasjoner vanskelige 11, 12. En analytisk validert RMP ville tillate ensartet kalibrering av forskjellige analyse plattformer, helst noe som resulterer i bedre sammenlignbarhet på tvers analytiske plattformer og i bedre kontroll av faktorer som bidrar til den totale måle variabilitet.
Den absolutte kvantifisering av Ap 1-42 bruker den utviklede LC-MS / MS metode vinner mange av problemene forbundet med antistoff-baserte techniques. Metoden, som er oppført som en RMP av Fellesutvalget for sporbarhet i laboratoriemedisin (JCTLM database identifikasjonsnummer C11RMP9), vil bli brukt til å bestemme den absolutte konsentrasjonen av Ap 1-42 i en Certified Reference Material (CRM) for å harmonisere CSF Ap 1 -42 målinger på tvers av teknikker og analytiske plattformer. Den beskrevne arbeidsflyten bør være av relevans for utvikling av kandidaten referansemetoder for peptider og proteiner i andre områder av medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokoll krever alikvoter på minst 50 ul, med en konsentrasjon på 50 ug / ml for hvert Ap peptid, som utgangsmateriale. Ap peptider bør være oppløst i 20% acetonitril (ACN) og 4% konsentrert ammoniakk-oppløsning i avionisert vann (volum / volum) og lagret ved 80 ° C.
Advarsel: Se tabell 1 for sikkerhetsinformasjon.
1. Utarbeidelse av Solutions
- Fremstille 100 ml av 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk-oppløsning i avionisert vann (v / v) ved å fortynne 20 ml ACN og 4 ml konsentrert ammoniakk (~ 25%) i deionisert vann. Justere det endelige volum til 100 ml med avionisert vann. Gjør fersk daglig.
- Fremstille 50 ml av 5 M guanidin-hydroklorid ved å oppløse 26,08 g guanidin-hydroklorid i deionisert vann til et sluttvolum på 50 ml. Oppbevares ved 20 ° C og lage fersk månedlig.
- Fremstille 200 ml av 4% fosforsyre i avionisert vann (v /v) ved å fortynne 9,4 ml konsentrert fosforsyre (~ 85%) i deionisert vann. Justere det endelige volum til 200 ml med avionisert vann. Oppbevar i kjøleskapet og lage fersk ukentlig.
- Fremstille 50 ml av 75% ACN og 10% konsentrert ammoniakk-oppløsning (volum / volum) i avionisert vann ved å fortynne 37,5 ml ACN og 5 ml konsentrert ammoniakk (~ 25%) i deionisert vann. Justere det endelige volum til 50 ml med avionisert vann. Gjør fersk daglig.
- Tine minst 2,5 ml human CSF for kalibratorer, hentet fra avidentifiserte left prøver fra rutinemessig klinisk analyse.
- Fremstille kunstig CSF inneholdende 150 mM Na, 3,0 mM K, 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P, og 155 mM Cl i avionisert vann og tilsettes bovint serumalbumin til en sluttkonsentrasjon på 4 mg / ml. Bare 1 ml er nødvendig per analyse, men fremstille et stort volum, alikvoter det, og lager for fremtidig bruk.
2. Utarbeidelse av kalibratorer
- Forbered 0,5 ml 4 mikrogram / ml 15 NAβ 1-42 peptid ved å tilsette 40 ul av 50 ug / ml 15 NAβ 142 til 0,46 ml av 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i et 0,5-ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
- Forbered 2 ml 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 peptid ved å tilsette 50 ul av 4 mg / ml 15 NAβ 142 til 1,95 ml av 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i en 2-ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
- Forbered seks kalibreringsvæsker (AF) ved å blande de volumer av hver løsning angitt i tabell 2. Bruker 0,5, 1,5, og 2 ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
- Forbered de endelige kalibratorer (i to eksemplarer) i 0,5 ml Mikrosentrifugerør ved å legge de tilsvarende kalibreringsløsninger og menneskelig CSF i henhold til tabell 3. Bland på en vortex mixer i 1 min.
3. Klargjøring av intern standard
- Forbered 2 ml 0,8 ug / ml 13 CAβ 1-42 peptid ved å tilsette 32 ul av 50 ug / ml 13 CAβ 142 til 1,968 ml av 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i en 2-ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
- Forbered 5 ml 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptid ved å tilsette 0,1 ml 0,8 ug / ml til 4,9 ml av 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i en 5 ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
4. Klargjøring av Response Factor Sample
MERK: responsfaktor (RF) bestemmelse utføres for å bestemme konsentrasjonen av det merkede peptid som brukes for kalibrering (15 NAβ 1-42). Dette krever at konsentrasjonen av det native peptid Ap 1-42 har blitt bestemt ved hjelp av aminosyreanalyse (AAA). Således kan volum og konsentrasjonen av innfødte Ap 1-42 peptid-aliquotertrenger for å oppfylle kravene i AAA.
- Forbered 0,5 ml av 4 mg / ml native (umerket) Ap 1-42 ved tilsetning av 40 ul av 50 ug / ml naturlig Ap 1-42 til 0,46 ml av 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i et 0,5-ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
- Forbered en 2-ml 40 ng / ml blanding av innfødte og 15 NAβ 1-42 ved å legge til 20 mL av 4 mikrogram / ml innfødte Ap 1-42 og 20 pl 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 til 1,96 ml 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i et 2 ml mikrosentrifugerør. Bland på en vortex-blander i 1 minutt.
- Tilsett 20 mL av 40 ng / ml blanding til 0,38 ml av kunstig CSF i et 0,5 ml mikrosentrifugerør. Forbered duplikater og bland på en vortex mixer i 1 min.
5. Prøvepreparering
MERK: Tine prøvene som skal måles ved romtemperatur på en berg.
- Legg 0,18 ml av hver kalibrator, responsfaktor, og ukjent prøve (inkludert kvalitetskontroll [QC] prøver, hvis det brukes) til en 1 ml protein 96-deep-brønns plate, i henhold til figur 1 (forutsatt at en hel plate blir brukt). Sørg for å legge prøvene i, eller nær, bunnen av brønnene.
- Tilsett 20 mL av intern standard til hver brønn (dvs. kalibratorer, responsfaktorer, QCS og ukjente); det er avgjørende for å frigjøre slipp på den side av brønnen nær overflaten av prøven uten å senke pipettespissen.
- Legge til 0,2 ml av 5 M guanidin-hydroklorid til hver brønn.
- Plasser prøven platen på en mikroplaterister og blandes prøvene i 45 minutter ved 1100 rpm. Den optimale frekvens kan variere avhengig av instrumentering. Still frekvensen og amplituden av blanderen, slik at løsningene blandes grundig og noen dråper av intern standard eller CSF er igjen ublandet på siden av brønnene.
- Legg 0,2 ml 4% fosforsyretil hver brønn. Vortex blande kort.
6. fastfaseekstrahering
MERK: I alle vaske, lasting og elusjonstester trinn, gjelder den lavest mulig vakuum etter tilsette løsningen og gradvis øke etter behov for å laste eller eluere løsning. Deaktiver vakuum mellom hver lasting og eluering trinn.
- Sett et reservoar skuff for avfall under en mixed-mode, kation-utveksling, 96 brønner fast fase ekstraksjon (SPE) plate i utvinning plate manifoldkammeret.
- Kondisjonere SPE sorbenten ved tilsetning av 0,2 ml methanol til hver brønn.
- Ekvilibrere sorbenten ved å tilsette 0,2 ml av 4% fosforsyre til hver brønn.
- Overfør alle prøver (ca 0,62 ml i hver brønn) fra dype brønnen plate til SPE plate. Bruke et åtte-kanals pipette ved overføring av prøvene fra det dyp-brønners plate til den SPE plate; Det er ikke avgjørende for å overføre hele eller like volumer av alle prøvene, ettersom prøvene inneholder en internal standard som vil kompensere for variasjoner.
- Vask sorbenten etter at prøvene har passert gjennom ved å tilsette 0,2 ml av 4% fosforsyre til hver brønn.
- Etter vaskemiddelet har elueres fra sorbenten, erstatte reservoaret skuffen med en samling plate eller rør.
- Eluere prøven fra sorbenten ved to ganger å tilsette 50 ul 75% ACN / 10% konsentrert ammoniakk, og legg merke til at denne løsningen krever et meget lavt vakuum for å passere gjennom sorbenten. Husk å deaktivere vakuum mellom hver tilsetning.
- EKSTRA: Tett samleplaten eller rør og fryse dem ved -80 ° C. Fjern forseglingen fra samlingen plate eller rør før du går videre til trinn 6.8.2.
- Tørk eluatene ved hjelp av vakuum-sentrifugering (uten anvendelse av varme); Dette kan ta fra en til flere timer, avhengig av vakuumsentrifuge.
- Seal beholdere og fryse dem ved -80 ° C.
7. Flytende Chromatoggraphy
- Forbered mobil fase A (5% ACN og 0,3% konsentrert ammoniakk i deionisert vann [v / v]), B (4% deionisert vann og 0,1% konsentrert ammoniakk i ACN [v / v]), og nål vask (50% ACN og 4% konsentrert ammoniakk i deionisert vann [v / v]).
- Til 500 ml av mobil fase A, tilsett 25 ml ACN og 1,5 ml konsentrert ammoniakk til avionisert vann. Justere det endelige volum til 500 ml med avionisert vann.
- Til 500 ml mobil fase B, tilsett 500 ul konsentrert ammoniakk og 25 ml deionisert vann for å ACN. Justere det endelige volum til 500 ml med ACN.
- Fremstille 250 ml av nålen vask ved å tilsette 120 ml ACN og 10 ml konsentrert ammoniakk til avionisert vann. Justere det endelige volum til 250 ml med avionisert vann.
- Sett mobile faser A og B og nål vaskeflasker åpen i et ultralyd bad i 20 minutter før bruk med LC-systemet
- Løs opp hver prøve med 25 ul 20% ACN og 4% konsented ammoniakk og plassere dem på en shaker i 20 min. Sentrifuger ned prøvene og plassere dem i autosampler (holde ved 7 ° C).
- Injiser 20 ul av prøven på en 1 x 250 mm 2 polystyren-divinylbenzen (reversert fase) monolittisk kolonne holdt ved 50 ° C.
- Bruk LC-gradient er vist i tabell 4 med en strømningshastighet på 0,3 ml / min. Viderekoble de to første og de siste fem min å kaste bort (post-kolonne) med en viderekobling ventilen for å redusere forurensning av massespektrometer.
8. massespektrometrisk analyse
MERK: Disse parametrene ble brukt for en kvadrupol-orbitrap hybrid massespektrometer utstyrt med aheated electrospray ionisering kilde.
- Still inn parameterne for ion kilde ifølge tabell 5.
- Sett MS instrument for å isolere de 4 + ladetilstander innfødte Ap 1-42 (1,129.48 massetil-charge-forhold [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), og 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) i det kvadrupol masse analysator med en isolasjon bredde på 2,5 m / z.
- Fragmentere de isolerte peptider i kollisjon celle med en normalisert kollisjonsenergi (NCE) på 17,0. Dette må kanskje være innstilt for hvert instrument, selv av samme type (og spesielt hvis du bruker andre typer instrumenter, for eksempel en trippel kvadrupol MS).
- Spill fragmentet spektra med en oppløsning av 17,500, med en automatisk forsterkningskontroll mål på 2 x 10 5 kostnader, og en maksimal injeksjons tid på 250 ms.
9. Behandling av data
- Bruk summen av produktioner (med en masse toleranse på ± 250 milli masseenheter [nm]) i tabell 6 for å beregne de kromatografiske områdene for hvert peptid. Merk at ion typer og tallene er bare vist for innfødte Ap
- Bestemme den gjennomsnittlige responsfaktor av de to responsfaktor prøver ved å dividere arealet under kurven (kromatografisk topp) av 15 NAβ 1-42 med arealet under kurven av naturlig Ap 1-42.
- Juster konsentrasjonen av 15 NAβ 1-42 benyttes for kalibrering ved å multiplisere det med en responsfaktor beregnet i trinn 9.2.
- Konstruere en kalibreringskurve ved å avsette forholdene i området fra 15 til 13 NAβ 1-42 1-42 CAβ fra de to settene med kalibratorer mot konsentrasjon.
- Beregn helling og skjærings av kalibreringskurven ved hjelp av lineær regresjon.
- Beregne arealet forholdet mellom naturlig Ap 1-42 til den indre standard (13 CAβ 1-42) for unkjente prøver.
- Ekstrapolere konsentrasjonen av ukjente prøver fra kalibreringskurven ved hjelp av helling og skjærings oppnådd i trinn 9.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Platen oppsettet i figur 1 er brukt for en hel plate av prøver. Hvis færre ukjente prøvene skal analyseres, den andre kalibrator, RF, og QC sett bør plasseres etter første omgang av de ukjente prøvene.
Som vist i figur 2, kalibratorene er i nærheten av regresjonslinjen, med lave standardavvik. Denne fremgangsmåten har et lavere nivå av kvantifisering av 150 pg / mL og et øvre nivå på kvantifisering av 4000 pg / ml. Den gjenværende Standardavviket for kalibrering bør selvfølgelig være så lav som mulig. Hvis kalibreringen er ikke-lineær, bør løpe kastes (avhengig av alvorlighetsgraden), og avviket er mest sannsynlig på grunn av feil pipetteringsteknikk og / eller feil i den fortynning av kalibratorer. Variasjonskoeffisienten (CV) replikater bør være under 20%, men fortrinnsvis under 10%.
ogether.within-page = "1"> De innfødte 15 N- og 13 CAβ 1-42 eluere fra LC kolonnen samtidig (siden de bare skiller på isotoper nivå), med nær symmetriske topper og uten vesentlig tailing (figur 3 ). Minst ti målinger skal utføres for hver enkelt kromatografisk topp, og kan justeres med det maksimale injeksjons tid i instrumentet metoden. Alle tre peptidene kan måles samtidig for alle målinger (kalibrering, RF, og ukjente) i løpet av MS-analyse. Hvis imidlertid følsomheten av fremgangsmåten er suboptimal, bare peptider av interesse skal måles for hver injeksjon (f.eks., Bare måle 15 N- og 13 CAβ 1-42 for kalibratorer, native og 15 NAβ 1-42 for RF-prøver, og innfødte og 13 CAβ 1-42 for ukjente prøver).
Figur 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Figur 1: utforminger av SPE og dyp-brønnplater. Typisk layout av kalibratorer (AF), responsfaktor prøve (RF), kvalitetskontroll prøver (QC), og ukjente. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kalibreringskurve. Kalibreringskurve konstruert ved hjelp av 15 NAβ 1-42 på 172, 572, 1144, 2287, 3431, og 4574 pg / ml (justeres ved hjelp av responsfaktor) og 13 CAβ 1-42 som intern standard i menneskelig CSF (n = 2) . Arealforholdet av 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 er plottet (Y-aksen)mot konsentrasjonen (X-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kromatogram. Kromatogram av 0,500 ng / ml native (endogen) Ap 1-42 (øverst panel) og 1,6 ng / ml 13 CAβ 1-42 (nederst panel) i menneskelig CSF. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kvantifisering av ukjent Ap 1-42 i ukjente prøver <./ strong> er topparealforhold beregnet ved å dele den innfødte Ap 1-42 kromatografisk topp område med intern standard (13 CAβ 1-42) kromatografisk topp området. Konsentrasjonen av naturlig Ap 1-42 i prøven er ekstrapolert fra kalibreringskurven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Sikkerhetsinformasjon. Sikkerhetsinformasjon for kjemikalier som brukes til denne protokollen.
| kalibrator løsning | Volum på 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 løsning (ml) Volum av 20% ACN & 4% ammoniakk (ml) | Sluttvolum (ml) | Endelig 15 NAβ 1-42 konsentrasjon (ng / ml) | |
| EN | 0,20 | 0,30 | 0,50 | 40.00 |
| B | 0,15 | 0,35 | 0,50 | 30.00 |
| C | 0,20 | 0,80 | 1.00 | 20.00 |
| D | 0,10 | 0,90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0,05 | 0.95 | 1.00 | 5,00 |
| F | 0,03 | 1.97 | 2,00 | 1,50 |
Tabell 2: Kalibratoren løsninger. Kalibratoren løsninger utarbeidet i 20% ACN og 4% konsentrert ammoniakkbrukes for spiking CSF kalibratorer.
| kalibrator | Volum av tilsvarende kalibrator løsning (ml) | Volum av menneskelig CSF (ml) | Sluttvolum (ml) | Endelig 15N-Aβ1-42 konsentrasjon (ng / ml) |
| EN | 0,02 (A) | 0,18 | 0,20 | 4,00 |
| B | 0,02 (B) | 0,18 | 0,20 | 3,00 |
| C | 0,02 (C) | 0,18 | 0,20 | 2,00 |
| D | 0,02 (D) | 0,18 | 0,20 | 1.00 |
| E | 0,02 (E) | 0,18 | 0,20 | 0,50 |
| F | 0,02 (F) | 0,18 | 0,20 | 0,15 |
Tabell 3: Kalibratorer. Kalibratorer utarbeidet i menneskelig CSF.
| Tid (min) | % Mobil fase B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabell 4: LC gradient. LC-gradienten benyttet sammen med en konstant strømningshastighet på 300 mL / min.
| Parameter | Verdi |
| Kappe gass | 50 |
| hjelpe~~POS=TRUNC gass | 6 |
| spray spenning | 4,4 kV |
| S-objektiv RF | 61 |
| Heater temperatur | 190 ° C |
| capillary temperatur | 350 ° C |
Tabell 5: kildeinnstillinger Ion. Parametere for ion kilden til å bli satt i instrumentet melodi programvare.
| forløperion | produkt~~POS=TRUNC ioner |
| Native Aβ1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (b334 +), 943,21 (b344 +), 975,98 (b354 +), 1000,74 (b364 +), 1029,51 (b384 +), 1054.03 (b394 +), 1078,79 (B404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (B313 +), 1200,25 (b323 +), 1257,29 (b343 +), 1300,96 (b353 +), 1333,66 (b363 +), 1372,00 (b383 +), 1405,02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1012,71, 1041,22, 1066,99, 1091,75, 1120,28, 1177,18, 1215,55, 1272,58, 1316,92, 1349,94, 1388,63, 1422,31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1019,37, 1045,14, 1074,65, 1100,67, 1126,69, 1156,40, 1253,43, 1313,14, 1358,50, 1393,19, 1432,21, 1466,90 |
Tabell 6: Ioner som brukes for kvantifisering. 4 + ladnings tilstander av forløperioner er isolert i den kvadrupol masse analysator, med en isolasjon bredde på 2,5 m / z. De produktioner (med en masse toleranse på ± 250 nm) benyttes til å beregne de kromatografiske områdene for hvert peptid. Ion typer og tallene er only vist for native Ap 1-42 produktioner, siden de er de samme for både 15 NAβ 1-42 og 13 CAβ 1-42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den beskrevne fremgangsmåte, i stedet for å bruke et surrogat matrise, vi brukte surrogat analytten tilnærmingen 13, 14, 15, 16, som muliggjør kalibrering i humant CSF. Surrogat analytt tilnærming innebærer to forskjellige isotopisk merkede standarder. En (15 NAβ 142) blir brukt til å generere kalibreringskurven i human CSF, mens en annen (13 CAβ 142) blir anvendt som intern standard. Ukjente endogene Ap 142 konsentrasjoner deretter ekstrapolert fra kalibreringskurve konstruert med 15 NAβ 142/13 CAβ 142 andel av den beregnede endogene Ap 142/13 CAβ 142 forhold. Surrogat analytt tilnærmingen ble anvendt siden det er ingen analytt-fri CSF tilgjengelig, og lav 142 Ap utvinningble observert ved bruk av mors Ap 142 i en surrogat matrise under metodeutvikling.
Siden 15 NAβ 142 og native Ap 142 kan gi forskjellige responser i MS, konsentrasjonen av 15 NAβ 142 justeres ved å måle et RF prøve en kunstig CSF-prøve som inneholdt like konsentrasjoner av 15 NAβ 142 og native Ap 142, med en kjent konsentrasjon bestemmes av AAA.The responsfaktor kan variere mellom ulike massespektrometre grunn av mulige variasjoner i isotopisk renhet av 15 N-merket peptid mellom partier. Således bør responsfaktor bestemmes for hver måling dag.
De mest kritiske trinn i denne protokollen er utarbeidelsen av kalibratorer og RF-prøvene. Ap-peptider, spesielt Ap 1-42, er svært hydrofobe og enkelt holde seg til pipettespisser ennd rør overflater 8, 17, 18. For å minimere tapet av Ap-peptider under pipettering, er det ekstremt viktig å mette pipettespissene før levering. Fortrinnsvis bør tre volumer av peptid løsningen kastes før levering til et nytt rør inneholdende oppløsning. Avhengig av volumet og konsentrasjonen av stamløsningen, er dette ikke alltid mulig. Det nest beste er selvfølgelig å pipettere peptid løsningen opp og ned tre ganger før levering. Av samme grunn er det viktig å bruke riktig størrelse for rør, unngå store void volumer.
Tidligere publiserte data for fremgangsmåten viser at gjenvinningen lå innenfor 100% (15%) 15. De relative feil for ryggen beregnet kalibratorer var under 15% av hele området som er definert av kalibratoren kurve 19.
en obvious begrensning av denne teknikken er at det er lav gjennomstrømning i forhold til automatiserte immunoanalyser. Imidlertid er hensikten med den beskrevne metoden er høy nøyaktighet og ikke gjennomstrømming. Denne metoden kan også utvides til å omfatte Ap 1-38 og Ap 1- 40, som er kortere 19. En annen begrensning ved denne metoden er at operatøren vil trenge omfattende massespektrometri trening før kjører analysen på instrumentet.
Kvantifisering ved hjelp av immunologiske analyser er avhengig av interaksjon mellom antistoffet og antigenet. Denne interaksjon kan bli påvirket av tilstedeværelsen av prøvekomponenter som kan forstyrre eller konkurrerer med interaksjonen. I tillegg kan interaksjonen også bli påvirket av konformasjonen av antigenet. Disse effektene er vanskelig å kontrollere og antas å være den viktigste grunnen til at det har vært vanskelig å harmonisere resultater mellom immunologiske plattformer og mellom laboratorier. Because kvantifisering med MS er basert på direkte telling av målmolekylene i forhold til en stabil isotop-merket standard, er kvantifisering absolutt og generelt upåvirket av slike matriks-effekter. I tillegg bør diagnostiske proteinmålinger immunoanalyser være støttet av en ubrutt kjede av høyere orden måleprosedyrer og materialer, fra validert LC-MS / MS og stabile isotop-merkede interne standarder til RMPs og en CRM, og dermed forbedre sammenlignbarhet og påliteligheten av resultatene 20, 21.
I konklusjonen, beskrev RMP for måling av Ap 142 i CSF er et viktig skritt i utviklingen av et CRM som vil bidra til å etablere generell cut-off konsentrasjon for Ap 142 i CSF. Eksakt cut-offs er svært viktig for nøyaktig diagnostisere AD tidlig og er av den største betydning når nye typer sykdomsmodifiserende legemidler nå klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E.
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Buchhave, P., et al. Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia. Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).
- Bjerke, M., et al. Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid. Int J Alzheimers Dis. , (2010).
- Dumurgier, J., et al. Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting. Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).
- Mattsson, N., et al. CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program. Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).
- Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers. Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).
- Mattsson, N., et al. Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42. Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).
- Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach. Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).
- Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).
- Leinenbach, A., et al. Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid. Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).
- Li, W., Cohen, L. H. Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix. Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).
- Perret-Liaudet, A., et al. Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis. Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).
- Lewczuk, P., et al. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).
- Pannee, J., et al. Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET. J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).
- Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).
- Vesper, H. W., Thienpont, L. M.
