Introduction
Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste formen av demens och drabbar cirka 35 miljoner människor i världen en. De neuropatologiska kännetecknen för sjukdomen allmänt anses ligga i centrum av AD patogenes är intracellulära neurofibrillära nystan av hyperfosforylerat tau-protein 2 och extracellulära plack som består av aggregerade amyloid-beta (Ap) peptider 3. I linje med detta har bedömningen av plack patologi in vivo av biomarkörer nyligen förts upp på forsknings diagnostiska kriterierna för AD 4. För CSF mätningar av Ap 1-42, flera immunologiska metoder tillgängliga och används i många kliniska laboratorier 5. Koncentrationen av A-beta 1-42 i CSF är cirka 50% lägre hos AD-patienter än i den kognitivt normala äldre, vilket återspeglar den avsättning av peptiden i plack i brain 6, 7.
Dessa biomarkörer främst analyseras med hjälp av immun (dvs. antikroppsbaserade tekniker), men dessa analyser kan påverkas av matriseffekter 8. Användningen av immun på olika teknikplattformar och bristen på analys standardisering 9, 10 gör införandet av globala cut-off halter svåra 11, 12. En analytiskt validerade RMP skulle tillåta en enhetlig kalibrering av olika analys plattformar, helst resulterar i bättre jämförbarhet mellan analytiska plattformar och i bättre kontroll av faktorer som bidrar till den totala variationen mätningen.
Den absoluta kvantifiering av Ap 1-42 genom att använda den utvecklade LC-MS / MS-metoden övervinner många av de frågor som är förknippade med antikroppsbaserad tekniques. Metoden, listad som en RMP av gemensamma kommittén för spårbarhet i laboratoriemedicin (JCTLM databas identifikationsnummer C11RMP9), kommer att användas för att bestämma den absoluta koncentrationen av Ap 1-42 i ett certifierat referensmaterial (CRM) för att harmonisera CSF Ap 1 -42 mätningar över och analys plattformar. Den beskrivna arbetsflöde bör vara av betydelse för utvecklingen av referens kandidat metoder för peptider och proteiner inom andra områden inom medicinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll kräver alikvoter av åtminstone 50 mikroliter, med en koncentration av 50 ^ g / ml för varje Ap-peptid, som utgångsmaterial. De Ap-peptider ska lösas upp i 20% acetonitril (ACN) och 4% koncentrerad ammoniaklösning i avjoniserat vatten (volym / volym) och lagrades vid 80 ° C.
Varning: Se tabell 1 för säkerhetsinformation.
1. Framställning av lösningar
- Förbereda 100 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniaklösning i avjoniserat vatten (volym / volym) genom att späda 20 ml ACN och 4 ml koncentrerad ammoniak (~ 25%) i avjoniserat vatten. Justera den slutliga volymen till 100 ml med avjoniserat vatten. Gör färsk dagligen.
- Förbered 50 ml av 5 M guanidin-hydroklorid genom upplösning av 26,08 g guanidin-hydroklorid i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 50 ml. Lagra vid 20 ° C och göra färsk månadsvis.
- Bereda 200 ml av 4% fosforsyra i avjoniserat vatten (volym /v) genom att späda 9,4 ml av koncentrerad fosforsyra (~ 85%) i avjoniserat vatten. Justera den slutliga volymen till 200 ml med avjoniserat vatten. Förvara i kylskåp och göra färsk varje vecka.
- Förbered 50 ml av 75% ACN och 10% koncentrerad ammoniaklösning (volym / volym) i avjoniserat vatten genom att späda 37,5 ml av ACN och 5 ml koncentrerad ammoniak (~ 25%) i avjoniserat vatten. Justera den slutliga volymen till 50 ml med avjoniserat vatten. Gör färsk dagligen.
- Tina åtminstone 2,5 ml human CSF för kalibratorer, som erhållits från de identifierade överblivna prover från rutinmässig klinisk analys.
- Förbereda artificiell CSF som innehöll 150 mM Na, 3,0 mM K, 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P, och 155 mM Cl i avjoniserat vatten och till bovinserumalbumin till en slutlig koncentration av 4 mg / ml. Endast 1 ml behövs per analys, men förbereder en stor volym, portion det, och lagra för framtida bruk.
2. Beredning av kalibratorer
- Förbered 0,5 ml 4 mikrogram / ml 15 NAβ 1-42 peptid genom att tillsätta 40 mikroliter av 50 mikrogram / ml 15 NAβ 142-0,46 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i ett 0,5-ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
- Förbereda 2 ml 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 peptid genom att tillsätta 50 mikroliter av 4 | ig / ml 15 NAβ 142-1,95 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i ett 2-ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
- Förbered sex kalibratorzoner lösningar (AF) genom blandning av de volymer av varje lösning som anges i tabell 2. Använd 0,5, 1,5, och 2 ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
- Förbered slut kalibratorer (i duplikat) i 0,5 ml mikrocentrifugrör genom att lägga till motsvarande kalibreringslösningar och human CSF enligt tabell 3. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
3. Beredning av den inre standarden
- Förbereda 2 ml 0,8 | ig / ml 13 CAβ 1-42 peptid genom att tillsätta 32 | il av 50 | ig / ml 13 CAβ 142-1,968 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i ett 2-ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
- Förbereda 5 ml 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptid genom att tillsätta 0,1 ml 0,8 ^ g / ml till 4,9 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i en 5 ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
4. Beredning av responsfaktorn Sample
OBS: Reaktionsfaktorn (RF) bestämningen utförs för att bestämma koncentrationen av den märkta peptiden som används för kalibrering (15 NAβ 1-42). Detta kräver att koncentrationen av den nativa Ap 1-42-peptiden har bestämts med användning av aminosyraanalys (AAA). Således, volym och koncentration av infödda AP 1-42 peptid portionermåste uppfylla kraven i AAA.
- Förbereda 0,5 ml 4 mikrogram / ml nativt (omärkt) Ap 1-42 genom tillsats av 40 mikroliter av 50 mikrogram / ml nativt Ap 1-42 till 0,46 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i ett 0,5-ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
- Bered en 2-ml 40 ng / ml blandning av nativt och 15 NAβ 1-42 genom tillsats av 20 mikroliter av 4 mikrogram / ml nativt Ap 1-42 och 20 mikroliter av 4 | ig / ml 15 NAβ 1-42 till 1,96 ml 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i ett 2 ml mikrocentrifugrör. Blanda på en vortexblandare under 1 minut.
- Tillsätt 20 mikroliter av 40 ng / ml mix till 0,38 ml av artificiell CSF i en 0,5 ml mikrocentrifugrör. Förbered dubbletter och blanda i en virvelblandare under 1 minut.
5. Provberedning
OBS: Tina proverna som skall mätas vid rumstemperatur på en vals.
- Lägg 0,18 ml av varje kalibrator, responsfaktor, och okända prov (inklusive kvalitetskontroll [QC] prover, om det används) till en 1 ml protein 96-djup brunnar, enligt figur 1 (med antagande av fullständig platta används). Se till att lägga proverna i, eller nära, botten av brunnarna.
- Tillsätt 20 mikroliter av en intern standard till varje brunn (dvs., kalibratorer, responsfaktorer, QCS och okända); det är avgörande att frigöra droppe på den sida av brunnen nära ytan av provet utan att sänka ned pipettspetsen.
- Lägga 0,2 ml 5 M guanidin-hydroklorid till varje brunn.
- Placera provplatta på en mikro shaker och blanda proverna under 45 minuter vid 1100 rpm. Den optimala frekvensen kan variera beroende på instrumentering. Ställa in frekvensen och amplituden hos biandaren, så att lösningarna blandas noggrant och att inga droppar av intern standard eller CSF är kvar oblandade på sidan av brunnarna.
- Tillsätt 0,2 ml av 4% fosforsyratill varje brunn. Vortex blanda kort.
6. Solid Phase Extraction
OBS: I alla tvätt, lastning och elueringssteg, tillämpa lägsta möjliga vakuum efter tillsats av lösningen och gradvis öka behövs för att lasta eller eluera lösningen. Inaktivera vakuum mellan varje lastnings- och elueringssteg.
- Sätt en behållare bricka för avfall enligt en mixed-mode, katjonbytar-96-väl fastfasextraktion (SPE) plattan i utvinning plattan samlingskammare.
- Konditionera SPE sorbenten genom att tillsätta 0,2 ml av metanol till varje brunn.
- Jämvikta sorbenten genom att tillsätta 0,2 ml av 4% fosforsyra till varje brunn.
- Överför alla prover (ca 0,62 ml i varje brunn) från den djupa brunnar till SPE plattan. Använd en åttakanals pipett vid överföring av proverna från den djupa brunnar till SPE plattan, det inte är av avgörande betydelse för att överföra hela eller lika volymer av samtliga prover, eftersom proverna innehålla en internal standard som kommer att kompensera för variationer.
- Tvätta sorbenten efter proverna har passerat genom genom att tillsätta 0,2 ml av 4% fosforsyra till varje brunn.
- Efter tvättlösningsmedlet elueras från sorbenten, byt ut behållaren facket med en uppsamlingsplatta eller rör.
- Eluera provet från sorbenten med två gånger tillsats av 50 mikroliter av 75% ACN / 10% koncentrerad ammoniak, och notera att denna lösning kräver en mycket lågt vakuum för att passera genom sorbentet. Kom ihåg att stänga av vakuum mellan varje tillsats.
- EXTRA: Täta uppsamlingsplattan eller rör och frysa dem vid -80 ° C. Avlägsna förseglingen från uppsamlingsplattan eller rör innan du fortsätter till steg 6.8.2.
- Torka eluaten med hjälp av vakuumcentrifugering (utan att applicera värme); detta kan ta från en till flera timmar, beroende på vakuumcentrifug.
- Täta behållarna och frysa dem vid -80 ° C.
7. Flytande Chromatography
- Förbereda mobil fas A (5% ACN och 0,3% koncentrerad ammoniak i avjoniserat vatten [v / v]), B (4% avjoniserat vatten och 0,1% koncentrerad ammoniak i ACN [v / v]) och nåltvätt (50% ACN och 4% koncentrerad ammoniak i avjoniserat vatten [v / v]).
- För 500 ml mobil fas A, tillsätt 25 ml ACN och 1,5 ml koncentrerad ammoniak till avjoniserat vatten. Justera den slutliga volymen till 500 ml med avjoniserat vatten.
- För 500 ml mobil fas B, tillsätt 500 | il av koncentrerad ammoniak och 25 ml avjoniserat vatten till ACN. Justera den slutliga volymen till 500 ml med ACN.
- Förbereda 250 ml nåltvätt genom att tillsätta 120 ml ACN och 10 ml koncentrerad ammoniak till avjoniserat vatten. Justera den slutliga volymen till 250 ml med avjoniserat vatten.
- Sätt den mobila faser A och B och nål tvätta flaskor öppen i en ultraljudsbadet under 20 minuter före användning med LC-systemet
- Lös varje prov med 25 mikroliter av 20% ACN och 4% Concentrated ammoniaklösning och placera dem på en skakanordning under 20 min. Centrifugera ner proverna och placera dem i autosampler (hålla 7 ° C).
- Injicera 20 | il av provet på en 1 x 250 mm 2 polystyren-divinylbensen (omvänd fas) monolitisk kolonn som hölls vid 50 ° C.
- Använda LC-gradient som visas i tabell 4 med en flödeshastighet av 0,3 ml / min. Avleda de första två och de sista fem minuter till avfall (post-kolonn) med användning av en vidarekoppling ventilen för att minska kontaminering av masspektrometer.
8. Masspektrometrisk analys
OBS: Dessa parametrar användes för en kvadrupol-Orbitrap hybrid masspektrometer utrustad med aheated elektrosprayjonisering källa.
- Ställ in parametrarna för jonkällan enligt tabell 5.
- Ställ in MS instrument för att isolera 4 + laddningstillstånd infödda Ap 1-42 (1,129.48 mass-till-laddningsförhållande [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), och 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) i kvadrupol analysator med en isolering bredd av 2,5 m / z.
- Fragmentet isolerade peptiderna i kollisionscell med en normaliserad kollisionsenergi (NCE) på 17,0. Detta kan behöva ställas in för varje instrument, även av samma typ (och särskilt om du använder andra typer av instrument, såsom en trippelkvadrupol MS).
- Spela fragmentet spektra med en upplösning på 17.500, med en automatisk förstärkningskontroll mål på 2 x 10 5 avgifter och en maximal insprutningstiden på 250 ms.
9. Data Processing
- Använda summan av produktjoner (med en massa tolerans på ± 250 millimassenheter [MMU]) i tabell 6 för att beräkna kromatografiska områden för varje peptid. Observera att jon typer och siffror endast visas för infödda Ap
- Bestäm den genomsnittliga responsfaktorn för de två svarsfaktorprov genom att dividera arean under kurvan (kromatografiska topp) på 15 NAβ 1-42 med området under kurvan för infödda Ap 1-42.
- Justera koncentrationen av 15 NAβ 1-42 används för kalibrering genom att multiplicera den med responsfaktorn beräknas i steg 9,2.
- Konstruera en kalibreringskurva genom att plotta förhållandena området av 15 NAβ 1-42 till 13 CAβ 1-42 från de två uppsättningarna av kalibratorer mot koncentrationen.
- Beräkna lutningen och skärningen av kalibreringskurvan med användning av linjär regression.
- Beräkna förhållandet mellan infödda Ap 1-42 området till intern standard (13 CAβ 1-42) för unkända prov.
- Extrapolera koncentrationen av okända prover från kalibreringskurvan med hjälp av lutningen och skärningspunkten som erhållits i steg 9,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plattan installationen i figur 1 används för en fullständig platta med prover. Om färre okända prover är analyseras, den andra kalibrator, RF, och QC uppsättningar ska placeras efter den första halvan av de okända proverna.
Såsom framgår av fig 2 är kalibratorerna nära regressionslinjen, med låga standardavvikelser. Denna metod har en lägre nivå av kvantifiering av 150 pg / ml och en övre nivå av kvantifiering av 4000 pg / ml. Den kvarvarande standardavvikelsen för kalibrering bör naturligtvis vara så låg som möjligt. Om kalibrering är icke-linjär, bör körningen kasseras (beroende på svårighetsgraden), och avvikelsen är mest sannolikt på grund av felaktig pipetteringsteknik och / eller fel i utspädning av kalibratorer. Variationskoefficienten (CV) av replikat bör vara under 20%, men företrädesvis under 10%.
ogether.within-page = "1"> Personen 15 N- och 13 CAβ 1-42 rinna genom LC-kolonnen samtidigt (eftersom de endast skiljer sig på isotop nivå), med nära symmetriska toppar och utan betydande svans (Figur 3 ). Minst tio mätningar bör utföras för varje kromatografiska toppen och kan justeras med det maximala insprutningstiden i instrumentmetod. Alla tre peptider kan mätas samtidigt för alla mätningar (kalibrering, RF, och okända) under MS-analys. Men om metodens känslighet är optimalt endast peptider av intresse bör mätas för varje injektion (dvs., Bara mäta 15 N- och 13 CAβ 1-42 för kalibratorer, infödda och 15 NAβ 1-42 för RF prover, och infödda och 13 CAβ 1-42 för okända prover).
Figur 1 "src =" / filer / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Figur 1: layouter av SPE och djupbrunnsplattor. Typisk layout kalibratorer (AF), responsfaktor prov (RF), kvalitet kontrollprover (QC), och okända. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kalibreringskurva. Kalibreringskurva konstrueras med hjälp av 15 NAβ 1-42 på 172, 572, 1144, 2287, 3431, och 4574 pg / ml (justerat med hjälp av responsfaktorn) och 13 CAβ 1-42 som den interna standarden i human CSF (n = 2) . Förhållandet mellan 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 area plottas (Y-axeln)mot koncentrationen (X-axeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kromatogram. Kromatogram av 0,500 ng / mL native (endogen) Ap 1-42 (övre panelen) och 1,6 ng / ml 13 CAβ 1-42 (nedre panelen) i human CSF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantifiering av okänd Ap 1-42 i okända prover <./ strong> toppareaförhållande beräknas genom att dividera den nativa Ap 1-42 kromatografiska toppen med den interna standarden (13 CAβ 1-42) kromatografiska toppen område. Koncentrationen av infödda AP 1-42 i provet extrapoleras från kalibreringskurvan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Säkerhet information. Säkerhetsinformation för kemikalier som används för detta protokoll.
| kalibrator lösning | Volym av 100 ng / ml 15 NAβ 1-42-lösning (ml) Volym av 20% ACN & 4% ammoniak (ml) | Slutlig volym (ml) | Slutlig 15 NAβ 1-42-koncentration (ng / ml) | |
| en | 0,20 | 0,30 | 0,50 | 40,00 |
| B | 0,15 | 0,35 | 0,50 | 30,00 |
| C | 0,20 | 0,80 | 1,00 | 20,00 |
| D | 0,10 | 0,90 | 1,00 | 10,00 |
| E | 0,05 | 0,95 | 1,00 | 5,00 |
| F | 0,03 | 1,97 | 2,00 | 1,50 |
Tabell 2: Calibrator lösningar. Calibrator lösningar som framställts i 20% ACN och 4% koncentrerad ammoniakanvänds för spiking CSF kalibratorer.
| kalibrator | Volym motsvarande kalibrator lösning (ml) | Volym av human CSF (ml) | Slutlig volym (ml) | Slutliga 15N-Aβ1-42 koncentration (ng / ml) |
| en | 0,02 (A) | 0,18 | 0,20 | 4,00 |
| B | 0,02 (B) | 0,18 | 0,20 | 3,00 |
| C | 0,02 (C) | 0,18 | 0,20 | 2,00 |
| D | 0,02 (D) | 0,18 | 0,20 | 1,00 |
| E | 0,02 (E) | 0,18 | 0,20 | 0,50 |
| F | 0,02 (F) | 0,18 | 0,20 | 0,15 |
Tabell 3: Kalibratorer. Kalibratorer framställda i human CSF.
| Tid (min) | % Mobil fas B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabell 4: LC lutning. LC-gradient användes med en konstant flödeshastighet av 300 | il / min.
| Parameter | Värde |
| slida gas | 50 |
| hjälpgas | 6 |
| sprutspänning | 4,4 kV |
| S-objektiv RF | 61 |
| värmartemperatur | 190 ° C |
| kapillär temperatur | 350 ° C |
Tabell 5: jonkälla inställningar. Parametrar för jonkällan som ska ställas in i instrumentet tune programvara.
| moderjon | produktjoner |
| Nativt Aβ1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (B334 +), 943,21 (b344 +), 975,98 (b354 +), 1000,74 (b364 +), 1029,51 (b384 +), 1054,03 (b394 +), 1078,79 (b404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (b313 +), 1200,25 (b323 +), 1257,29 (b343 +), 1300,96 (b353 +), 1333,66 (b363 +), 1372,00 (b383 +), 1405,02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1012,71, 1041,22, 1066,99, 1091,75, 1120,28, 1177,18, 1215,55, 1272,58, 1316,92, 1349,94, 1388,63, 1422,31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1019,37, 1045,14, 1074,65, 1100,67, 1126,69, 1156,40, 1253,43, 1313,14, 1358,50, 1393,19, 1432,21, 1466,90 |
Tabell 6: Joner används för kvantifiering. De 4 + laddningstillstånd av prekursorn joner isoleras i kvadrupol analysator, med en isolerings bredd på 2,5 m / z. De produktjoner (med en vikt tolerans på ± 250 mmu) används för att beräkna de kromatografiska områden för varje peptid. Ion typer och siffror är only visas för infödda Ap 1-42 produktjoner, eftersom de är samma för båda 15 NAβ 1-42 och 13 CAβ 1-42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För den beskrivna metoden, istället för att använda ett surrogat matris använde vi surrogat analyt metod 13, 14, 15, 16, som gör det möjligt för kalibrering i human CSF. Surrogat analyt synsätt innebär två olika isotopiskt märkta standarder. On (15 NAβ 142) används för att generera kalibreringskurvan i human CSF, medan en annan (13 CAβ 142) används som den interna standarden. Okända endogena Ap 142 koncentrationer sedan extrapoleras från kalibreringskurvan konstrueras med användning av 15 NAβ 142/13 CAβ 142 förhållande med den beräknade endogena Ap 142/13 CAβ 142 förhållande. Surrogat analyt tillvägagångssätt användes eftersom det inte finns någon analyt fritt CSF tillgängliga, och låg aP 142 återhämtningobserverades vid användning av infödda AP 142 i en surrogat matris under metodutveckling.
Sedan 15 NAβ 142 och nativt aP 142 kan ge olika svar i MS, koncentrationen av 15 NAβ 142 justeras genom att mäta en RF prov-en artificiell CSF-prov innehållande lika koncentrationer av 15 NAβ 142 och nativt Ap 142, med en känd koncentration bestäms av AAA.The responsfaktorn kan skilja sig mellan olika masspektrometrar på grund av möjliga variationer i isotopiska renheten för 15 N-märkta peptiden mellan satser. Sålunda bör responsfaktorn bestämmas för varje mätning dag.
De mest kritiska stegen i detta protokoll är framställningen av kalibratorer och RF prover. Ap-peptider, särskilt Ap 1-42, är mycket hydrofoba och lätt hålla sig till pipettspetsar ennd rör ytorna 8, 17, 18. För att minimera förlusten av Ap-peptider under pipettering, är det extremt viktigt att mätta pipettspetsarna före leverans. Företrädesvis bör tre volymer av peptidlösningen kasseras före avgivning till ett nytt rör innehållande lösningen. Beroende på volymen och koncentration av stamlösningen, är detta inte alltid möjligt. Den näst bästa sättet är naturligtvis att pipetpeptidlösningen upp och ner tre gånger före leverans. Av samma anledning är det viktigt att använda lämpliga storlekar för rör, undvika stora hålrumsvolymer.
Tidigare publicerade data för metoden visar att återhämtningen var inom 100% (15%) 15. De relativa felen för de bakre beräknade kalibratorer låg under 15% av hela området som definieras av kalibratorkurva 19.
Ett obvious begränsning med denna teknik är att den är låg genomströmning jämfört med automatiserade immunanalyser. Emellertid är syftet med den beskrivna metoden hög noggrannhet och inte genomströmning. Denna metod kan också utökas till att omfatta Ap 1-38 och Ap 1- 40, som är kortare 19. En annan begränsning med denna metod är att operatören kommer att behöva omfattande spektrometri utbildning massa innan du kör analysen på instrumentet.
Kvantifiering med användning av immunanalyser är beroende av växelverkan mellan antikroppen och antigenet. Denna interaktion skulle kunna påverkas av närvaron av provkomponenter som kan störa eller konkurrerar med interaktionen. Dessutom kan interaktionen också påverkas av konformationen av antigenet. Dessa effekter är svåra att kontrollera och tros vara den främsta orsaken till varför det har varit svårt att harmonisera resultat mellan immunplattformar och mellan laboratorier. because kvantifiering med MS är baserad på direkt räkna målmolekyler i förhållande till en stabil, isotopmärkt standard, är kvantifiering absolut och allmänt påverkas av sådana matriseffekter. Dessutom bör diagnostiska protein från immun stödjas av en obruten kedja av förfaranden och material av högre ordning mätning, från validerade LC-MS / MS och stabila isotopmärkta interna standarder för RMPs och CRM, vilket förbättrar jämförbarheten och resultatens tillförlitlighet 20, 21.
Sammanfattningsvis beskrivs RMP för mätning av Ap 142 i CSF är ett viktigt steg i utvecklingen av ett CRM som bidrar till att skapa allmänna cut-off koncentration för AP 142 i CSF. Exakt cut-off är mycket viktigt för korrekt diagnostisera AD tidigt och är av yttersta vikt när nya typer av sjukdomsmodifierande läkemedel når kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E.
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Buchhave, P., et al. Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia. Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).
- Bjerke, M., et al. Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid. Int J Alzheimers Dis. , (2010).
- Dumurgier, J., et al. Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting. Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).
- Mattsson, N., et al. CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program. Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).
- Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers. Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).
- Mattsson, N., et al. Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42. Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).
- Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach. Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).
- Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).
- Leinenbach, A., et al. Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid. Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).
- Li, W., Cohen, L. H. Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix. Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).
- Perret-Liaudet, A., et al. Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis. Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).
- Lewczuk, P., et al. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).
- Pannee, J., et al. Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET. J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).
- Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).
- Vesper, H. W., Thienpont, L. M.
