Introduction
阿尔茨海默氏病（AD）是老年痴呆症的最常见的形式，影响了全球100约35万人。疾病广泛认为在躺在床上的AD发病的芯的神经病学特征是tau蛋白的蛋白2的细胞内神经原纤维缠结和细胞外斑块由聚集的淀粉样-β（Aβ）肽3。本着这一精神，体内斑块病理的生物标志物评估最近已包含在公元4研究的诊断标准。对于Aβ1-42的CSF测量，几个免疫测定可以使用，在许多临床实验室5被使用。 的Aβ1-42的CSF中的浓度是在AD患者比在认知正常老年人下大约50％，这反映了肽在斑中的BR的沉积AIN 6,7。
这些生物标志物重点分析使用免疫（ 即，基于抗体的技术），但这些试验可以由基体效应8的影响。使用不同技术平台的免疫测定和缺乏测定标准化9，10，使引入全球截止浓度难以11,12。一种分析验证RMP将允许不同的检测平台统一校准，最好导致跨平台的分析比较好和更好的控制有助于整体测量变异的因素。
使用开发的LC-MS / MS方法的Aβ1-42的绝对定量克服了与基于抗体的TECHN有关的问题iques。该方法被列为联合委员会溯源实验室医学（JCTLM数据库标识号C11RMP9），一个RMP将被用来确定一个标准物质（CRM）Aβ1-42的绝对浓度协调CSFAβ1跨越技术和分析平台-42测量。所描述的工作流程应该是相关的用于医学的其他领域内的肽和蛋白质候选参考方法的发展。
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Protocol
注：此协议需要至少50微升的等分试样，对每个Aβ肽50微克/ mL的浓度，作为原料。 Aβ的肽应溶于20％乙腈（ACN）和4％浓氨溶液在去离子水（v / v）中并储存在80℃。
注意：请参阅表1的安全信息。
1.溶液的制备
- 通过稀释20毫升乙腈和4毫升浓氨水（〜25％）在去离子水中制备100毫升20％的ACN和4％的在去离子水（v / v）的浓氨溶液。调节最终体积至100毫升去离子水。让每天新鲜。
- 通过26.08克胍 - 盐酸盐溶解在去离子水至50毫升的最终体积制备50毫升，5M胍盐酸盐。在20°C储存，使新鲜的月刊。
- 制备200毫升的4％磷酸在去离子水（v /ⅴ）通过稀释9.4毫升去离子水中的浓磷酸（〜85％）的。调节最终体积至200毫升去离子水。存放在冰箱，并每周新鲜。
- 通过稀释37.5毫升乙腈和5mL浓氨水（〜25％）在去离子水中制备50毫升75％的ACN和10％的浓氨水溶液（体积/体积）在去离子水中。调节最终体积至50mL去离子水。让每天新鲜。
- 解冻至少2.5 mL人CSF为校准器，从常规临床分析去确定剩余样品。
- 制备含有150mM的Na，3.0毫钾，1.4毫米的Ca，0.8毫镁，1.0mM的磷，和155毫氯在去离子水中人工CSF和添加的牛血清白蛋白4毫克/毫升的最终浓度。只有1毫升每分析需要的，但制备大体积，等分它，并存储以供将来使用。
2.校准器的研制
- 准备的4微克0.5毫升/ 1毫升5NAβ1-42肽通过在0.5毫升微量离心管中加入40微升50微克/毫升15NAβ142至0.46毫升20％的ACN和4％浓氨水的。混合在涡旋混合器上于1分钟。
- 通过在2毫升的离心管中加入50微升4微克/毫升15NAβ142至1.95毫升20％的ACN和4％浓氨水的制备2毫升100纳克/毫升15NAβ1-42肽。混合在涡旋混合器上于1分钟。
- 由表2中所示的各溶液的体积混合准备六节校准溶液（AF）。使用0.5，1.5，和2mL微量离心管。混合在涡旋混合器上于1分钟。
- 通过将相应的校准溶液，并根据表3混合在涡旋混合器上于1分钟人CSF制备于0.5mL微离心管中的最后的校准（一式两份）。
3.内部标准的研制
- 通过在2毫升的离心管中加入32微升50微克/毫升13CAβ142以1.968毫升20％ACN和4％浓氨水的制备2毫升0.8微克/毫升13CAβ1-42肽。混合在涡旋混合器上于1分钟。
- 通过在5毫升的离心管中加入0.1毫升0.8微克/毫升至4.9毫升20％的ACN和4％浓氨水的制备5mL的16毫微克/毫升13CAβ1-42肽。混合在涡旋混合器上于1分钟。
4.响应系数样品的制备
注意：响应因子（RF）判定被执行以确定用于校准（15NAβ1-42）标记的肽的浓度。这就要求本机的Aβ1-42肽的浓度已经使用氨基酸分析（AAA）确定。因此，体积和天然的Aβ1-42肽的等分试样的浓度需要履行的AAA的要求。
- 通过以0.5毫升微量离心管中加入40微升50微克/ mL的原生的Aβ1-42至0.46毫升20％的ACN和4％浓氨水的制备0.5毫升4微克/毫升天然（未标记） 的Aβ1-42的。混合在涡旋混合器上于1分钟。
- 通过加入4微克20微升/毫升天然的Aβ1-42和20微升为4μg/ mL的15NAβ1-42制备天然的和15NAβ1-42的2毫升40纳克/毫升组合，以1.96毫升的20％ ACN和4％在一个2毫升的离心管中浓氨。混合在涡旋混合器上于1分钟。
- 添加40毫微克/毫升混合20微升至0.38毫升的人工脑脊液在0.5毫升离心管中。准备重复并在涡旋混合器上混合1分钟。
5.样品制备
注：融化样品在上辊室温进行测定。
- 添加每个校准器，响应因子，和未知样品（包括质量控制[QC]样品，如果使用的话），以1毫升的蛋白质的96深孔板的0.18毫升，根据图1（假设全板使用）。确保添加样品中，或接近，在孔的底部。
- 加入内标20微升到每口井（ 即校准器，响应因子，QCS系统和未知）;关键的是要释放井靠近样品的表面侧的压降而不浸没枪头。
- 0.2毫升，5M胍盐酸添加到每个孔中。
- 放置在微板振荡器上样品板并以1100rpm进行45分钟混合样品。最佳频率可能会因仪器不同。设定混频器的频率和振幅，以使溶液充分混合，没有内部标准或脑脊液滴留未混合在孔的一侧。
- 加0.2毫升的4％磷酸到每个孔中。轻轻振荡混匀。
6.固相萃取
注：在所有的洗涤，装载和洗脱步骤，应用可能的最低的真空加入溶液后，并根据需要装载或洗脱溶液逐渐增加。禁用每个加载和洗脱步骤之间的真空。
- 置于废物贮存池托盘混合模式下，在萃取板歧管室的阳离子交换，96孔固相萃取（SPE）板。
- 通过加入0.2毫升甲醇中以每孔调节在SPE吸附剂。
- 通过加入0.2毫升的4％磷酸至每个孔平衡吸附剂。
- 从深孔板转移所有样品（每孔约0.62 mL）添加到SPE板。样品从深孔板SPE板传送时使用8通道移液器;它不是传输所有样品的整个或相等体积至关重要的，因为样品中含有的实习生人的标准，将为变化进行补偿。
- 洗吸附剂样品已通过加入0.2毫升的4％磷酸向每个孔穿过后。
- 洗涤溶剂从吸附剂洗脱后，更换一个收集盘或管水库托盘。
- 通过两次加入75％ACN / 10％浓氨水加入50μL洗脱从吸附剂样品，并注意此解决方案要求一个非常低的真空穿过吸附剂。记住要禁用每个另外的真空。
- 可选：密封收集板或管，并在-80℃冷冻。继续步骤6.8.2之前从收集板或管密封。
- 干燥使用真空离心（不施加热量）洗脱液;这可以从一个到几个小时，取决于真空离心机。
- 密封该容器，并在-80℃冷冻。
7.液体色谱造影
- 制备流动相A（5％ACN和0.3％浓氨水在去离子水[体积/体积]），B（4％去离子水和0.1％浓氨水在ACN [体积/体积]），并且针洗涤（50％ACN和4％浓氨水在去离子水[体积/体积]）。
- 为500毫升流动相A，加入25毫升乙腈和1.5毫升浓氨水，以去离子水。调节最终体积至500毫升去离子水。
- 为500毫升流动相B，加500微升浓氨水和25毫升去离子水于乙腈。调节最终体积至500mL乙腈。
- 通过加入120mL的乙腈和10mL浓氨水去离子水的制备250毫升洗针的。调节最终体积至250毫升去离子水。
- 把流动相A，打开B和针头清洗瓶子在超声浴20分钟，LC系统使用前
- 溶解有20 25微升％ACN和4％concentra各样品泰德氨水溶液，将其放在20分钟的振动筛。离心下来的样品，并放置在自动进样器（保持在7℃）。
- 注入上保持在50℃的1×250毫米2的聚苯乙烯-二乙烯基苯（反相）整体柱的样品20微升。
- 使用在表4中为0.3毫升/分钟的流速所示的LC梯度。转移的前两个和最后五分钟使用一个转向阀，以减少质谱仪的污染浪费（柱后）。
8.质谱分析
注意：这些参数被用于配备aheated电喷雾源的四极的Orbitrap杂交质谱仪。
- 根据表5中设置用于离子源的参数。
- 设置MS仪器来隔离本地Aβ1-42的4 +充电状态（按质量1,129.48电荷比[M / Z]），15NAβ1-42（1,143.00 M / Z），和13CAβ1-42（1,179.50 M / Z）中的四极质量分析器，用2.5 M / Z的隔离宽度。
- 分段在碰撞单元中的分离的肽与17.0归一化碰撞能量（NCE）。这可能需要被调谐每个仪器，即使是同一类型的（尤其是如果使用其它类型的仪器，诸如三重四极杆质谱）。
- 记录片段光谱和17.500的分辨率，为2×10 5个电荷的自动增益控制目标和250毫秒的最大喷射时间。
9.数据处理
- 在表6中使用的产品的离子的总和（具有±250毫质量单位[MMU]的质量公差）来计算的色谱区域为每个肽。需要注意的是离子种类和数量只显示了本机Aβ
- 由15NAβ1-42的曲线（色谱峰）与天然Aβ1-42的曲线下的面积下，将该区域确定两个响应因子样本的平均响应因子。
- 调整通过在步骤9.2计算出的响应因子乘以它用于校准的15NAβ1-42的浓度。
- 通过从两组对浓度校准的标绘的15面积比NAβ1-42〜13CAβ1-42构建校准曲线。
- 计算使用线性回归校正曲线的斜率和截距。
- 计算机的Aβ1-42的面积比的内标（13CAβ1-42）为未已知样品。
- 推断使用在步骤9.5中得到的斜率和截距由校准曲线未知样品的浓度。
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Representative Results
图1中的板设置用于样品的完整板。如果较少的未知样本进行分析，所述第二校准器，RF和QC套应置于未知样品的前半部分后。
如在图2中看到的那样，校准接近回归线，具有低标准偏差。这种方法具有150皮克/毫升和4000皮克/毫升的量化的上层的定量的较低水平。当然校准的剩余标准偏差应尽可能低。如果校准是非线性，运行应（取决于严重性）被丢弃，并且该偏差是最有可能是由于在校准的稀释不正确移液技术和/或错误。重复的变化（CV）的系数应低于20％，但优选低于10％。
ogether.within页=“1”>同时从LC柱的本机15 N-和13CAβ1-42洗脱（因为他们仅在同位素水平不同），与附近的对称峰和无显著拖尾（ 图3 ）。至少十个测量应为每个色谱峰进行，并可以在仪器方法最大喷射时间进行调整。所有三种肽可以同时用于MS分析过程中的所有测量值（校准，RF和未知）来测量。然而，如果该方法的灵敏度是不理想的，只有感兴趣的肽应为每次注射测定（ 即 ，只测量15 N-和13CAβ1-42为校准器，本地和15NAβ1-42用于RF采样，和天然的和13CAβ1-42未知样品）。
图1“SRC =”/文件/ ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg“/>
图1：SPE 和深孔板的布局。校准器的典型布局（AF），响应因子样（RF），质量控制样品（QC），和未知。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 校准曲线。使用15NAβ1-42在172，572，1144，2287，3,431，和4574皮克/毫升（使用响应因子调整）和13CAβ1-42在人CSF内标校准曲线构造（N = 2） 。 15NAβ1-42 / 13CAβ1-42的面积比作图（Y轴）对浓度（X轴）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 色谱。 0.500纳克/毫升天然（内源）将Aβ1-42（顶面板）和1.6毫微克/毫升13CAβ1-42（底部面板）于人类CSF中的色谱图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 未知样品中Aβ未知的1-42定量<。/强>的峰面积比率是通过将天然的Aβ1-42色谱峰面积与内标（13CAβ1-42）色谱峰面积来计算。天然的Aβ1-42的样本中的浓度是从标准曲线外推。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：安全信息。安全信息用于此协议的化学物质。
| 校准解决方案 | 100毫微克的体积/ mL的15NAβ1-42溶液（毫升） 20％的ACN和4％的氨的体积（毫升） | 最终体积（毫升） | 最后15NAβ1-42浓度（纳克/毫升） | |
| 一个 | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| 乙 | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20.00 |
| ð | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| Ë | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1.50 |
表2：校准器的解决方案。在20％ACN制备校准溶液和4％浓氨用于扣球CSF校准。
| 校准器 | 相应校准溶液的体积（毫升） | 人CSF的体积（毫升） | 最终体积（毫升） | 最终15N-Aβ1-42浓度（ng / mL）的 |
| 一个 | 0.02（A） | 0.18 | 0.20 | 4.00 |
| 乙 | 0.02（B）的 | 0.18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0.02（C） | 0.18 | 0.20 | 2.00 |
| ð | 0.02（D） | 0.18 | 0.20 | 1.00 |
| Ë | 0.02（E） | 0.18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0.02（F） | 0.18 | 0.20 | 0.15 |
表3：校准器。于人类CSF中制备校准物。
| 时间（min） | ％流动相B |
| 0 | 五 |
| 1 | 五 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 五 |
| 15 | 五 |
表4：LC梯度。为300微升/分钟的恒定流速用在LC梯度。
| 参数 | 值 |
| 鞘气 | 50 |
| 辅助气体 | 6 |
| 喷雾电压 | 4.4千伏 |
| S-RF镜头 | 61 |
| 加热器温度 | +190℃， |
| 毛细管温度 | +350℃， |
表5：离子源设置。离子源参数在仪器调软件设置。
| 母离子 | 产品离子 |
| 本地Aβ1-42（M / Z 1129.58，4+） | 915.19（b334 +），943.21（b344 +），975.98（B354 +），1000.74（b364 +），1029.51（B384 +），1054.03（b394 +），1078.79（B404 +），1107.06（b414 +），1163.23（B313 +），1200.25（B323 +），1257.29（B343 +），1300.96（b353 +），1333.66（b363 +），1372.00（b383 +），1405.02（B393 +） |
| 15N-Aβ1-42（M / Z 1143.00，4+） | 926.41，954.68，987.95，1012.71，1041.22，1066.99，1091.75，1120.28，1177.18，1215.55，1272.58，1316.92，1349.94，1388.63，1422.31 |
| 13C-Aβ1-42（M / Z 1179.50，4+） | 955.33，985.11，1019.37，1045.14，1074.65，1100.67，1126.69，1156.40，1253.43，1313.14，1358.50，1393.19，1432.21，1466.90 |
表6：离子用于定量。前体离子的4+电荷状态被隔离在所述四极质量分析器，用2.5 M / Z的隔离宽度。产物离子（具有±250 MMU的质量公差）被用来计算在色谱领域每种肽。离子种类和数量是ONL示出了本机的Aβ1-42产物离子Y，因为它们是两个15NAβ1-42和13CAβ1-42相同。
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Discussion
对于所描述的方法，而不是使用一个代理矩阵，我们使用了替代的分析物的方法13，14，15，16，它使校正在人CSF。代孕的方式分析涉及到两个不同的同位素标记的标准。酮（15NAβ142）被用来产生于人类CSF中的校准曲线，而另一个（13CAβ142）用作内标。然后未知的内源性Aβ142浓度外推由校准曲线使用15NAβ13分之142CAβ142比所计算出的内源Aβ 十三分之一百四十二 CAβ142比构成。使用了替代的分析物的方法，因为不存在游离分析物-CSF可用，以及低的Aβ142恢复方法开发过程中的替代基质使用本机Aβ142时进行了观察。
自15NAβ142和本机的Aβ142可在MS给出不同的应答，15NAβ142的浓度是通过测量的RF采样的人工脑脊液含有15NAβ142和本机的Aβ142的相同浓度试样调整，与已知的浓度通过AAA.The响应因子由于在15的同位素纯度可能的变化而确定的不同的质谱仪之间可能不同N-标记批次之间的肽。因此，响应因子应为每个测量日来确定。
在这个协议中最关键的步骤是校准和RF样本的制备。 Aβ肽，特别是Aβ1-42，非常疏水性，容易粘吸头一个第二管表面8，17，18。为了尽量减少Aβ肽的移液过程中的损失，饱和之前交付枪头是极为重要的。优选的肽溶液三卷应递送到一个新的含有管溶液之前被丢弃。根据原液的体积和浓度上，这并不总是可能的。第二最佳方法当然是吸取的肽溶液和交付之前，向下三次。出于同样的原因，它以使用适当尺寸管，避免大空隙体积是重要的。
对于该方法此前公布的数据表明，回收率为100％（15％）15内。用于背计算校准，相对误差低于由校准曲线19所限定的整个范围的15％。
一个O这种技术的bvious局限性在于它是低通量相比自动化免疫测定。然而，所描述的方法的目的是高精确度和不吞吐量。这种方法还可以扩展到包括Aβ1-38和Aβ1- 40，其是较短的19。这种方法的另一个限制是，操作员将需要在运行仪器上分析前广泛质谱训练。
使用免疫测定定量取决于抗体和抗原之间的相互作用。这种相互作用可通过可能干扰或相互作用竞争样品组分的存在而受到影响。此外，交互，也可以通过抗原的构象的影响。这些影响是难以控制，被认为是主要的原因，一直难以协调免疫平台之间和实验室之间的结果。 BEC与MS澳洲英语定量是基于直接计数相对于一个稳定的，同位素标记的标准目标分子，量化是由这种基质效应绝对，通常不受影响。此外，通过免疫诊断蛋白测量应该由高阶测量程序和材料一个完整的链支承，从经验证的LC-MS / MS和稳定，同位素标记的内标，以制冷剂管理和客户关系管理，从而提高了可比较和结果20，21的可靠性。
总之，对于Aβ142的CSF测量所描述的贼法牧在开发CRM，这将有助于脑脊液中确立一般截止浓度Aβ142的重要一步。确切截止值是为早期准确诊断的AD非常重要，并且，最重要的，当新类型的疾病修饰药达到诊所。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
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