Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

قياس العكر غسلها لحقوق الإنسان الصفائح الدموية: تأثير من Pannexin1 المانع الزرقاء الرائعة FCF على تجميع الناجمة الكولاجين،

Published: April 6, 2017 doi: 10.3791/55525
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva, 2Division of Angiology and Haemostasis & Geneva Platelet Group, Geneva University Hospitals

Summary

نحن تصف طريقة واضحة لعزل الصفائح الدموية غسلها من الدم البشري تليها القياسات تراكم الصفائح الدموية التي يسببها ناهض بواسطة قياس العكر. وكمثال على ذلك نطبق هذه الطريقة لدراسة استجابة تجمع الصفائح الدموية البشرية لالكولاجين بعد مرحلة ما قبل الحضانة مع قناة المانع Pannexin1 الزرقاء الرائعة FCF.

Abstract

قياس العكر هي تقنية المختبرات التي يتم تطبيقها لقياس تجمع الصفائح الدموية مع وقف التنفيذ في أي البلازما (الصفائح الدموية الغنية البلازما، PRP) أو في المخزن (الصفائح الدموية غسلها)، عن طريق استخدام واحد أو مزيج من منبهات. استخدام الصفائح الدموية غسلها فصلها عن البيئة البلازما الخاصة بهم وعدم وجود مضادات التخثر يسمح لدراسة خصائص الصفائح الدموية الجوهرية. بين لوحة كبيرة من منبهات، وحمض الأراكيدونيك (AA)، أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP)، الثرومبين والكولاجين هي الأكثر استخداما. وكميا الاستجابة التجميع عن طريق قياس الكثافة البصرية النسبية (OD) مع مرور الوقت من تعليق الصفائح الدموية مع التحريك المستمر. الصفائح الدموية في تعليق متجانسة تحد من مرور الضوء بعد إضافة ناهض، وتغير شكل الصفائح الدموية يحدث تنتج زيادة مؤقتة صغيرة في OD. وبعد هذه الخطوة التنشيط الأولية، تشكل جلطات الصفيحات تدريجيا، مما يسمح بمرور الضوء من خلال التعليق كشرط الدقةانخفاض الموج من OD. وأعرب عن عملية التجميع في نهاية المطاف كنسبة مئوية، بالمقارنة مع OD البلازما فقيرة الصفائح الدموية أو العازلة. معايرة دقيقة هي بالتالي أساسية في بداية كل تجربة. تم تعيين المعايرة إلى 0٪ عن طريق قياس OD من تعليق غير حفز الصفائح الدموية بينما قياس OD من المتوسط ​​تعليق لا تحتوي على الصفائح الدموية يمثل قيمة 100٪: كقاعدة عامة. هو تصور تراكم الصفائح الدموية عموما منحنى التجميع في الوقت الحقيقي. قياس العكر هي واحدة من التقنيات المخبرية الأكثر استخداما للتحقيق في وظيفة الصفائح الدموية ويعتبر معيار الذهب التاريخية واستخدامها لتطوير وكلاء الصيدلانية جديد يهدف إلى منع تراكم الصفائح الدموية. هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة ل1) إعداد الإنسان غسلها الصفائح الدموية و2) تحليل قياس العكارة التجميع التي يسببها الكولاجين البشرية غسلها الصفائح الدموية سابقة التجهيز مع صبغة الطعام الزرقاء الرائعة FCF التي كانت مؤخرا الاتساعtified كما المانع من Pannexin1 (Panx1) القنوات.

Introduction

الصفائح الدموية هي العناصر الحاسمة من الدم والرئيسي الوظائف جنبا إلى جنب مع تخثر العوامل هي لوقف النزيف بعد إصابة الأوعية الدموية. الصفائح الدموية هي صغيرة شظايا (2-3 ميكرون) عديم النواة المشتقة من الخلايا السوية العرطلة من نخاع العظام 1. الصفائح الدموية تدور في حالة غير تنشيط خلالها تظهر كما هياكل على شكل العدسة. على انقطاع البطانة، الصفائح الدموية تتجمع إلى موقع الإصابة الأوعية الدموية إلى سد الثقب، وهي عملية تسمى الإرقاء الأولي. في البداية، الصفائح الدموية تلتصق جزيئات شبه البطانية، مثل الكولاجين وعامل فون ويلبراند، التي يتعرض لها نتيجة الخطوة إصابة التصاق 2. ثم تقوم بتغيير شكل وتفرز الكيميائية خطوة رسل التنشيط. وأخيرا، اتصالهم مع بعضهم البعض من خلال سد مستقبلات خطوة التجميع. ويتبع الإرقاء الأولي من خلال عملية الثانوية التي تنطوي على تفعيل شلال التخثر مع ترسب الليفين، والتي الاستقرارق الجلطة الأولية 2.

أحداث الدماغية الحادة مثل احتشاء عضلة القلب 3 غالبا ما تنجم عن الجلطة الدموية التي تشكل بسبب تعطل المادي (تمزق) لوحة تصلب الشرايين. العقاقير الحالية المضادة للصفائح هي حجر الزاوية في علاج هذا المرض على نطاق واسع ولكن فائدتها السريرية محدودة بسبب خطر متزايد للنزيف. أكثر الأدوية الموصوفة للمرضى القلب والأوعية الدموية، والأسبرين ومكافحة P2Y12 المركبات، تستهدف الثرموبوكسان A2 ومسارات ADP 4 على التوالي، والتي هي الممرات الرئيسية المؤدية إلى نشاط الصفائح الدموية. ومع ذلك، والبحوث المبتكرة نحو أهداف جديدة من شأنها تحقيق التوازن الأمثل آثار جرعات ومخاطر haemorragic لا يزال ضروريا.

من 1960s 5 إلى اليوم، وقد لعبت قياس التكدس قياس العكارة دورا حاسما في مجال البحوث، وتعزيز معرفتنا التفاعل الصفائح الدموية وأناN رصد قوة من الكواشف مكافحة الجلطات لدى البشر. تم تطبيق قياس العكر في البداية إلى PRP المستخرج من عينات الدم. في الواقع، وجمع الدم أجريت في أنابيب تحتوي على سترات تتيح إنتاج سريع وكبير من PRP دون أي تأثير على سلامة الصفائح الدموية وظيفة. ومع ذلك، فإن الاستقرار على المدى القصير (حوالي 3 ساعات) من PRP وما تبقى من الانزيمات بلازمية، مثل الثرومبين، وتركيز الكالسيوم منخفض مصاحب لمحات تجميع يحتمل مصطنع هم من إزعاج كبير لاستخدام PRP. وكانت خطوة هامة إلى الأمام في تطوير طريقة لعزل الصفائح الدموية مع الطرد المركزي الإضافية وغسل الخطوات من 6. باختصار، يتم عزل PRP من الدم الكامل التي تم جمعها على حمض سترات الدكستروز (ACD) ويتم عزل الصفائح الدموية بعد خطوات الطرد المركزي المسلسل قبل أن يتم معلق في وجود مخزن مؤقت-ايزو الاسموزي الفوسفات (عازلة تايرود) التي تحتوي على الجلوكوز، وألبومين المصل البشري وثنائي التكافؤ جبالجمع (الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+). لتجنب التغيرات في الصفائح الدموية التفاعل، يتم الاحتفاظ درجة الحموضة العازلة تايرود بعناية في 7،35-7،4. وعلاوة على ذلك، يتم منع تفعيل غير مرغوب فيه من الصفائح الدموية عن طريق إضافة بروستاسيكلين (PGI 2) قبل بعض الخطوات الطرد المركزي. وأخيرا، إضافة آبيراز يمنع الصفائح الدموية غسلها من أن تصبح مقاومة ضد عمل ATP / ADP. تعليق الصفائح الدموية مما أدى يفتقر إلى عوامل تخثر ويتم زيادة استقرار الصفائح الدموية من قبل ما لا يقل عن اثنين أضعاف بالمقارنة مع الحلول الحزب الثورى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حقيقة أن الصفائح الدموية هي مذكرات الخاملة ولكن سليمة استنساخ القياسات قياس العكارة ويوفر القدرة على دراسة عمل منبهات أو مضادات تجمع الصفائح الدموية بطريقة مثلى.

باستخدام هذه الطريقة، لقد أظهرنا في دراسة حديثة أن تحول دون تشكيل قنوات Panx1 بنهج الجيني (خروج المغلوب الفئران) أو خفض النشاط قناة Panx1 التي كتبها الدوائيةنهج خفض الناجم عن تراكم الصفائح الدموية الكولاجين 7. Panx1 تشكل قنوات ATP الإفراج، والتي أعرب بتواجد مطلق في العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك الصفائح الدموية البشرية 7 و 8. في الواقع، أثبتنا من خلال قياس العكر على الإنسان غسل الصفائح الدموية أن حضن مسبق 7 دقيقة مع لجنة من حاصرات أكثر أو أقل محددة الكيميائية (البروبينسيد، المفلوكين و 10 الببتيدات Panx1) قبل إضافة العديد من منبهات، مستعمل على وجه التحديد التي يسببها الكولاجين تراكم الصفائح الدموية في حين ردود الصفيحات إلى AA وADP لم تتأثر. أثبتنا أن الإفراج ATP من خلال قنوات Panx1 يتدخل على وجه التحديد في مسار GPVI الإشارات التي تؤدي إلى تجميع الناجم عن الكولاجين. ومن المثير للاهتمام، متعددة مركبات وافقت ادارة الاغذية والعقاقير مع تطبيقات في أمراض أخرى (البروبينسيد، المفلوكين) تؤثر على نشاط قنوات Panx1 في الصفائح الدموية. من جهة، هذا تفتح آفاقا علاجية جديدة لتحديدively تعديل تفاعلية الصفيحات. من ناحية أخرى، ينبغي للمرء أن ينظر الآثار الثانوية المحتملة لهذه المركبات. وفي هذا السياق، الطعام صبغ آمن الزرقاء الرائعة FCF يستخدم في الحلوى متعددة ومشروبات الطاقة وصفت بأنها مثبطات انتقائية من Panx1 9. نحن هنا وصف بروتوكول لعزل الصفائح الدموية البشرية غسلها والقياسات قياس العكارة من تراكم الصفائح الدموية تكييفها للتحقيق في تأثير الرائعة الصبغة الزرقاء FCF كمضاد للتراكم الصفائح الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تجنيد خمسة متطوعين أصحاء لا علاقة لأخذ عينات الدم للصفائح العزل وتجميع الاختبارات. تم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق المركزية للمستشفيات جامعة جنيف. جميع المتطوعين شهادة لتكون صحية ولم تتخذ أي أدوية التدخل الصفائح الدموية خلال 10 أيام على الأقل تسبق التجارب.

1. إعداد العازلة لجمع الدم الإنسان وغسلها عزل صفائح الدم

  1. إعداد 100 مل من المحلول المائي لحمض سترات الدكستروز (ACD) عن طريق إذابة 1.4 جم حمض الستريك مونوهيدرات (C 6 H 8 O 7 • H 2 O، 66.6 ملم)، و 2.5 جم سترات الصوديوم ثنائي الهيدرات (نا 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H 2 O، 85 ملم) و 2 غرام من D اللامائية (+) - الجلوكوز. الرقم الهيدروجيني للمحلول حوالي 4.5.
  2. إعداد الحلول الأسهم لعازلة تايرود على النحو التالي
    1. إعداد محلول المخزون 1 عن طريق إذابة 80 جم كلوريد الصوديوم، 2 ز بوكل، و 10 غرام NaHCO 3 و 0.58 غرام ناه 2 PO 4 * H 2 O في 500 مل من H 2 O. المقطر تركيزات النهائية منها هي 2.73 M، 53.6 ملم، 238 مم و 8.4 مم. إبقاء الحل في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد محلول المخزون 2 عن طريق إذابة 10.15 ز MgCl 2 * 6 H 2 O (100 ملم) في 500 مل المقطر H 2 O. نضع الحل في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد محلول المخزون 3 عن طريق إذابة 10.95 غم (100 ملم) CaCl 2 * 6 H 2 O في 500 مل المقطر H 2 O. نضع الحل في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد عازلة تايرود عن طريق تمييع 2.5 مل من محلول المخزون 1 في الحجم النهائي من 50 مل مع H المقطر 2 O. هذا يتوافق مع تركيزات النهائي من 136.5 مم كلوريد الصوديوم، 2.68 ملي بوكل، 11.9 ملم NaHCO 3 و 0.42 ملم ناه 2 PO 4 * H 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.35 وتعقيم من خلال تصفية مع 0.22 ميكرون وilters.
  4. إعداد الزلال 0.35٪ عازلة تايرود (TA عازلة 7) عن طريق تمييع 5 مل من محلول المخزون 1، 1 مل من محلول المخزون 2، 2 مل من محلول المخزون 3، 0.5 مل 1M HEPES، 1.8 مل من 200 غرام / L ألبومين المصل البشري و 0.1 غرام من D اللامائية (+) - الجلوكوز في الحجم النهائي من 100 مل المقطر H 2 O.
    1. ضبط درجة الحموضة إلى 7.35 مع 1N حمض الهيدروكلوريك وتعيين الأسمولية إلى 295 الميلي أسمول / L بإضافة المقطر H 2 O (10٪ من إجمالي حجم). تركيزات النهائي في هذا الحل هي: 124 مم كلوريد الصوديوم، 2.44 ملي بوكل، 10.82 ملم NaHCO 3، 0.38 ملي ناه 2 PO 4 * H 2 O، 0.91 ملي MgCl 2 * 6 H 2 O، 1.82 ملي CaCl 2 * 6 H 2 O احتفظ عازلة TA عند 37 درجة مئوية خلال التجربة بأكملها.

مجموعة 2. الدم

  1. جمع 45-50 مل من الدم الوريدي، من الوريد أمام المرفق باستخدام 19 G إبرة ولا أو عاصبة منخفضة، إلى 50 مل أنابيب يخدععلى الحتفاظ ACD تخثر (1 حجم ACD لمدة 6 مجلدات من الدم). تجاهل الأول 1-2 مل من الدم لتجنب وجود الثرومبين والعامل النسيجي.
    1. بعد جمع وخلط الدم مع ACD التي كتبها عكس بلطف الأنبوب. احتضان العينة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

3. إعداد الإنسان غسلها الصفائح الدموية

  1. قبل تسخين الطرد المركزي إلى 37 درجة مئوية. يتم تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي أقل في درجة الحرارة هذه.
  2. إيفاد الدم التي تم جمعها في 15 مل أنابيب (5 مل في أنبوب) وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 13 دقيقة للحصول على PRP.
    ملاحظة: هذا الطرد المركزي النتائج خطوة في إنتاج ثلاث طبقات في العينة: 1) الطبقة العليا، المؤلفة من البلازما والصفائح الدموية، وجزء صغير من خلايا الدم البيضاء. 2) الطبقة المتوسطة، وجزء غني في خلايا الدم البيضاء. 3) الطبقة السفلية، التي تتألف أساسا من خلايا الدم الحمراء.
  3. جمع PRP من قبل pipetting الجزء العلوي من لاYER بعناية إلى جديد 15 مل أنبوب لمنع التلوث الحد الأقصى مع خلايا الدم الحمراء والبيضاء، واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. الطرد المركزي PRP في 2200 x ج لمدة 12 دقيقة (لمدة 5 مل PRP).
    ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة الطرد المركزي مع الفرامل منخفضة أو بدون فرامل.
  5. إزالة طاف (فقيرة الصفائح الدموية البلازما)، وإعادة تعليق بعناية بيليه مع 10 مل من العازلة TA تحتوي على 2 ميكرولتر / مل من الهيبارين (5000 U / مل) و 2.5 ميكرولتر / مل من 25 ميكرومتر PGI 2 باستخدام الماصة باستور البلاستيك. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. إضافة 2.5 ميكرولتر / مل من 25 ميكرومتر PGI 2 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 1900 x ج (مع الفرامل منخفضة أو بدون فرامل).
  7. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه مع 5 مل عازلة TA تحتوي على 2.5 ميكرولتر / مل من 25 ميكرومتر PGI 2 باستخدام البلاستيك باستور الماصة. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. خلال فترة الحضانة، الماصة 150 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية فيإلى أنبوب 1.5 مل وعدد الصفائح الدموية، وذلك باستخدام عداد الخلية المؤتمتة (الذي يكشف حجم خلايا الدم عن طريق قياس التغيرات في مقاومة التيار المباشر).
  9. بعد حضانة 10 دقيقة، إضافة 2.5 ميكرولتر / مل من 25 ميكرومتر PGI 2 إلى تعليق الصفائح الدموية وأجهزة الطرد المركزي على الفور في 1900 x ج لمدة 8 دقائق.
  10. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه إلى تركيز 250،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر مع حجم كاف من العازلة TA (أي إذا كان عدد خلايا هو 500000 في ميكرولتر، resuspend في 10 العازلة مل TA) التي تحتوي على 32 ميكرولتر / مل من آبيراز عند 0.01 U / مل (تركيز النهائي 0.32 U / مل).
    ملاحظة: تركيز عال من آبيراز يستخدم لتجنب الحساسية من المستقبلات P2X1 الناجمة عن إفراز عفوية من ATP 10 و 11 في غياب محفزات. هذا مهم جدا لأنه وبفعل الردود التي يسببها الكولاجين التي كتبها نظير الصماوي سريع / تفعيل autocrine من P2X1 من ATP إطلاق سراح الابتنشيط ام الصفائح الدموية. إذا لم مسار الصفائح الدموية مما يشير تتطلب خطيرة الحفاظ على وظيفة P2X1، استخدم 0.02 U / مل آبيراز. أثبتت العديد من الدراسات (إعادة النظر في Mahaut سميث وآخرون. 10) أن 0.02 U / مل آبيراز يتجنب ADP الحساسية مستقبلات P2Y1 مع ردود P2X1 تذكر.
  11. احتضان تعليق خلية لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل إجراء القياسات aggregometric. إعداد مستقر لمدة 5 إلى 8 ساعات.

4. قياس التكدس

  1. إعداد الفيبرينوجين (56 ملغ / مل) في المخزن تايرود.
  2. الماصة 260 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية في cuvettes الزجاج (الشكل 1A، كفيت اليسرى) تحتوي على 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين (56 ملغ / مل) وقضيب التحريك المغناطيسي، ثم احتضان تعليق ل2-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الآبار حضانة الحالية في مقياس التكدس (1B الشكل و1C).
  3. قبل احتضان مع Panx1المانع الزرقاء الرائعة FCF بإضافة 10 ميكرولتر من ملي 2.8 أو 28 ملي حل الأوراق المالية (تركيز النهائي 100 ميكرومتر و 1 ملم، على التوالي) لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. معايرة مقياس التكدس إلى قيمة تجميع 100٪ مسلم به عن طريق قياس OD من كفيت تحتوي على 10 ميكرولتر الفيبرينوجين (56 ملغ / مل)، و 10 ميكرولتر الزرقاء الرائعة FCF (2.8 ملم أو 28 ملم) وعازلة TA دون الصفائح الدموية.
    1. ضع كفيت في تجميع جيدا مع التحريك التلقائي واضغط على زر المقابلة على لوحة المفاتيح للكمبيوتر مرتبطة مقياس التكدس (أي الصحافة F1 إذا تم استخدام التجميع جيدا 1).
      ملاحظة: هذه التجربة هو موضح أدناه تتضمن الزرقاء الرائعة FCF. مجمع المستخدمة في المعايرة لابد من تعديلها إلى حالة تجريبية.
  5. معايرة مقياس التكدس إلى قيمة تجميع 0٪ مسلم به باستخدام نفس العينة الصفيحات التي سيتم استخدامها للتجربة تحت stirrin التلقائيز.
    1. ضع كفيت في تجميع جيدا واضغط على زر المقابلة على لوحة المفاتيح للكمبيوتر مرتبطة مقياس التكدس. الانتظار لمدة 20-30 الصورة قبل المتابعة. يخدم هذا التأخير لضمان عدم تراكم يحدث قبل إضافة منبهات.
      ملاحظة: باسم أي اختلاف في عدد الصفائح الدموية قد يكون لها تأثير على OD قياس، تحتاج خطوة المعايرة 0٪ أن تتكرر لكل قياس الفردية.
  6. إضافة 20 ميكرولتر من ناهض المطلوب، مثل 15 ميكروغرام / مل الكولاجين (1 ميكروغرام / مل النهائي) أو 1.125 ملي حمض الأراكيدونيك (75 ميكرومتر النهائي)، في كفيت. بدء فورا في تسجيل تحت التحريك التلقائي المستمر عن طريق الضغط على زر المقابلة على لوحة المفاتيح للكمبيوتر مرتبطة مقياس التكدس.
    ملاحظة: إضافة ناهض تحرض نشاط الصفائح الدموية. يمكن بوضوح المجاميع الصفائح الدموية يمكن تمييزها في كفيت الزجاج في نهاية التجربة (الشكل 1A، righر كوفيت).
  7. توقف تسجيل تلقائيا بعد 6 دقائق. في هذه المرحلة، وتوفير البيانات عن طريق النقر على حفظ رمز جهاز الكمبيوتر.
    ملاحظة: حساب معدل التجميع يتم تنفيذه بواسطة الكمبيوتر، والتي تعبر عن النتائج النهائية لعملية التجميع كنسبة مئوية.
  8. تحليل البيانات.
    1. للحصول على معلومات إضافية واسعة على بروتوكولات لإعداد تعليق الصفائح الدموية غسلها وقياس قياس العكارة من تراكم الصفائح الدموية، الرجوع إلى أوراق أخرى من تأليف خبراء في مجال 12 و 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

برنامج مقياس التكدس تنتج تلقائيا منحنيات تجميع ويعطي القيم لتجميع القصوى في النسبة المئوية. يمكن نسخ القيم إلى برامج تحليل البيانات من أجل إجراء تحليل إحصائي وتصور القيم تجميع القصوى في شكل رسوم بيانية. اختياريا، كل نقطة على حدة من المنحنيات تجميع يمكن تصديرها تباعا في برنامج جداول البيانات ومن ثم إلى البرنامج الإحصائي (على سبيل المثال GraphPad) من أجل رؤية المنحنيات. بعض المحققين استخدام منحدر القصوى من منحنى تجميع لحساب السرعة والمساحة تحت منحنى لتقييم نشاط الصفائح الدموية. الوقت تأخر وتغيير شكل يمكن أيضا تصور بيانيا.

ويرد مثال نموذجي لمنحنى تجمع الصفائح الدموية البشرية غسلها تحت ظروف التحكم (H 2 O) في الشكل 2A. إضافة لgonist (الكولاجين)، التي يسببها (بعد تأخير قصير) حدوث كساد في منحنى التجميع التي نجمت عن تغيير شكل الصفائح الدموية. ثم، تم التوصل إلى نسبة تجميع تدريجيا مع مرور الوقت حتى القيمة القصوى في حوالي 3-4 دقائق. ولوحظ وجود انخفاض طفيف في نسبة تجميع نحو نهاية التسجيل 6 دقائق، مما يعكس بعض التفصيل. كما هو موضح في الشكل 2A-B، وغسلها preincubating الإنسان الصفائح الدموية مع مثبطات قناة Panx1 الزرقاء الرائعة FCF، بتركيز 1 ملم، تباطأ أو ألغيت تماما تغيير شكل الصفائح الدموية الأولي ومنعت تجميع الناجم عن الكولاجين الصفائح الدموية غسلها تم الحصول عليها من 5 مختلف متطوعين أصحاء غير ذات صلة. عندما الصفائح الدموية حيث preincubated مع تركيز أقل (100 ميكرون) من الزرقاء الرائعة FCF، لم تراع تأثير مثبط للصباغة على الردود التي يسببها الكولاجين وتغيير الشكل بعد الآن (انظر الشكل 2A للحصول على مثال). Quantifكشفت ication الردود تراكم الصفائح الدموية الناجمة عن 1 ميكروغرام / مل الكولاجين أن 1 مم الزرقاء الرائعة FCF انخفاض كبير الردود تجميع القصوى بالمقارنة مع الظروف السيطرة فضلا عن انخفاض تركيز (100 ميكرون) من المانع Panx1 (الشكل 2C). كان منع تجمع الصفائح الدموية محددة للاستجابات التي يسببها الكولاجين وليس بسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها من الزرقاء الرائعة FCF (على بقاء الخلية، على سبيل المثال)، ونفس التركيز من الصبغة (1 ملم) لم يؤثر على استجابة تجميع الناجمة عن ناهض آخر، أي 75 ميكرومتر AA، كما هو موضح في الشكل 2D. وتؤكد هذه النتائج الدور المحدد للقنوات Panx1 في الردود تجميع الناجم عن الكولاجين الصفائح الدموية البشرية التي نحن وآخرون قد أظهرت سابقا مع مثبطات الدوائية الأخرى للPanx1 مثل البروبينسيد، المفلوكين، وتحديدا 10 الببتيدات Panx1 7 و 8.

شكل 1
الشكل 1: قياس التكدس. (A) صورة الممثل من cuvettes الزجاج (التي تحتوي على مغناطيس اثارة) تستخدم لقياس التكدس. كفيت على اليسار يظهر الصفائح الدموية الراحة بينما كفيت على اليمين توضح المجاميع الصفائح الدموية بعد التنشيط التي يسببها الكولاجين. (B) صورة الممثل من مقياس التكدس 8 جيدا لقياس قياس العكارة. الآبار المستخدمة (النجمة) لاحتضان تعليق الصفائح الدموية الموجودة في كوفيت الزجاج عند 37 درجة مئوية، وتلك المستخدمة في القياسات (السهم الأبيض) وترد في C. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تركيز عال من الزرقاء الرائعة FCF كتل الصفيحات تفعيل ردا على الكولاجين. (A) آثار التمثيلية للتجميع الناجم عن الكولاجين البشرية غسلها الصفائح الدموية التي تم الحصول عليها من نفس المتطوعين الأصحاء (V1) في ظل ظروف التحكم (H 2 O؛ الأزرق الداكن) أو بعد حضن مسبق 7 دقائق مع المانع Panx1 الزرقاء الرائعة FCF في 1 ملم ( الضوء الأزرق) أو عند 100 ميكرومتر (وسيطة اللون الأزرق). سجلت آثار تجميع لمدة 6 دقائق. (B) آثار التمثيلية للتجميع الناجم عن الكولاجين البشرية غسلها الصفائح الدموية التي تم الحصول عليها من 4 متطوعين أصحاء (V2-V5) بعد حضن مسبق 7 دقائق مع المانع Panx1 الزرقاء الرائعة FCF (1 ملم). (C) الكمي لاستجابات تجميع القصوى من الإنسان غسلها الصفائح الدموية تحت ظروف التحكم (شريط بيضاء) أو بعد حضن مسبق 7 دقيقة مع رائعة FCF الأزرق في 100 ميكرومتر (شريط رمادي) أو في 1 ملم (شريط أسود). N = 5. **** P0؛ 0.0001. ANOVA تليها مرحلة ما بعد اختبار بونفيروني للمقارنة متعددة؛ يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SEM. (D) آثار التمثيلية للتجميع الناجم عن AA البشرية غسلها الصفائح الدموية التي تم الحصول عليها من 5 متطوعين أصحاء (V1-V5) بعد حضن مسبق 7 دقائق مع المانع Panx1 الزرقاء الرائعة FCF (1 ملم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك اهتمام كبير في إيجاد أدوية جديدة قادرة على تحوير وظيفة الصفائح الدموية من أجل منع تجلط الدم دون زيادة خطر النزيف. لهذا الغرض، في المختبر الاختبارات المعملية التي يمكن أن يعتمد عليه وبتكاثر مراقبة ردود تجميع الصفائح الدموية في الإنسان ضرورية للغاية. قياس التكدس قياس العكارة هي تقنية سهلة لأداء. ومع ذلك، لا بد من وضعها في الاعتبار بعض الاحتياطات. تحتاج القياسات التي يتعين القيام بها مع التحريك المستمر إلى عملية تجميع تعتمد إلى حد كبير على التحريك. ومن المهم أيضا للحفاظ على الصفائح الدموية في درجة حرارة الفسيولوجية لل37 ° C من أجل تجنب أي نوع من التنشيط سابق لأوانه. يمكن أيضا أن تحدث Preactivation من الصفائح الدموية خلال جمع الدم والصفائح الدموية غسلها إعداد، مما يؤدي إلى تجميع عفوية. وهكذا ينبغي اتخاذ تدابير الحذر أثناء إجراء كاملة من إعداد الصفائح الدموية.

ويستند قياس العكر سن قياس OD لتعليق الصفائح الدموية. وهذا ما يجعل هذه التقنية مناسبة لقياس تجميع في الدم كله بسبب وجود خلايا الدم الحمراء. وهكذا، قياس العكر يمكن القيام بها إلا على PRP أو الصفائح الدموية غسلها معزولة عن PRP. على الرغم من السهل التعامل مع وغير مكلفة إلى حد ما، وقد تم الاعتراف قياس العكر كما حساسة لوجود microaggregates 14 و 15. حيث من المتوقع أن تكون ذات أهمية حاسمة microaggregates، مقاومة قياس التكدس، والذي يقيس التغير في المقاومة الكهربائية عندما الصفائح الدموية تلتزم إلكترود مغمورة في عينة الدم الكامل سيتراتي، هو أكثر ملاءمة 16. عملية تراكم الصفائح الدموية هي أيضا تعتمد إلى حد كبير على عدد الصفائح الدموية في تعليق الصفيحات 17؛ التدفق الخلوي يستخدم في المرضى الذين يعانون من نقص الصفيحات 18، ومنهم من الحد الأقصى لعدد الصفائح الدموية التيويمكن الحصول على غير كافية لقياس العكر. ومع ذلك، فإن ميزة العامة للقياس العكر هو أنه يتيح تحليلا مفصلا للتفاعل الصفائح الدموية، مثل تغير شكل وتفصيل، والتي لا يمكن تقييمها في عينات الدم الكامل.

من المهم أن ندرك أن الاختلاف الطبيعي في تراكم الصفائح الدموية البشرية موجود بسبب الاختلافات في العمر والجنس وأسلوب الحياة، وكذلك الحالة الصحية للموضوع الذي الصفائح الدموية وظيفة طعن 19 و 20 و 21. قد يكون هذا الاختلاف الطبيعي بناء على أمر من 10-20٪ في نتائج قياس العكارة، وبالتالي ينبغي توخي الحذر عند تنفيذ وتفسير هذه التجارب، في الحصول على الصفائح الدموية من عدد كاف من المتطوعين الأصحاء لا علاقة للسماح للإحصاءات موثوقة. لكن وفي مقابل هذا القيد من حقيقة أن القياسات قياس العكارة هي تكرار للغاية، على الأقل عندما التجميعإجراءات وموحدة بشكل جيد عبر المختبرات. وقد بذلت جهود التوحيد من قبل الجمعية الدولية للتخثر وتخثر الدم 22. لهذا السبب، لا يزال قياس العكر الاختبار الأكثر شيوعا التي تواجهها لقياس تراكم الصفائح الدموية في كل من مختبرات العلوم السريرية والأساسية ويبقى الأسلوب المفضل لدراسة تأثير الأدوية على الردود الصفائح الدموية.

في هذه الدراسة أننا أظهرنا، وذلك باستخدام قياس العكر لقياس الاستجابات في الصفائح الدموية البشرية غسلها، أن شائعة الاستخدام صبغة الطعام الزرقاء الرائعة FCF يؤثر على تراكم الصفائح الدموية. وقد كشفت الدراسات الكهربية الأنيقة الحصار محدد من القنوات Panx1 من هذه الصبغة 9، 23. في الواقع، تركيزات عالية (1 ملم) من هذه الصبغة أظهرت الآثار المثبطة على كل تغيير شكل الناجم عن الكولاجين وتجميع القصوى ولكن 10 أضعاف تركيزات أقل (100 ميكرومتر)من الصبغة لم يؤثر على استجابة تراكم الصفائح الدموية. ووفقا للرأي العلمي على إعادة تقييم الزرقاء الرائعة FCF (E133) كمادة مضافة للغذاء، التي نشرتها الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية 24، وتركيز المسموح به القصوى من الزرقاء الرائعة FCF (الوزن الجزيئي = 792.84 جم / مول) 500 ملغم / كغم من المواد الغذائية. لH 2 O، وهذا يتوافق مع 0.63 ملم، وهو أقل تركيز 1.59 أضعاف من تلك التي تحول دون الناجم عن تراكم الصفائح الدموية الكولاجين في تجاربنا. على افتراض أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الصبغة سيتم استيعابها في الأمعاء بعد الابتلاع عن طريق الفم، وأن الصبغة سوف أخيرا أن تضعف في حجم 5 لتر من الدم من شخص بالغ، والاستهلاك اليومي من هذه الصبغة الغذاء الأزرق ديه على الأرجح تتجاوز إلى حد كبير المستويات العادية قبل يمكن توقع أي آثار جانبية على تراكم الصفائح الدموية. ممكن من الآثار الجانبية على أعلى تركيز الصبغة في تجاربنا على قابلية الصفائح الدموية، على سبيل المثال، كانتاستبعاد من وجود ردود تجميع الصلبة إلى ناهض آخر (AA). وأكد هذه الردود AA تتأثر أيضا أن التأثيرات المثبطة للالزرقاء الرائعة FCF يبدو أن تنطوي على وجه التحديد مسار الكولاجين الإشارات. هذا هو تماشيا مع دراستنا السابقة 7 تفاصيل مكان محدد لإطلاق ATP من خلال قنوات Panx1 في الاستجابة تراكم الصفائح الدموية التي يسببها الكولاجين.

من خلال تكييف بروتوكول العزلة الصفائح الدموية غسلها لهذه الدراسة، ونحن تصف طريقة بسيطة ومباشرة لعزل الصفائح الدموية من الدم البشري. بعد أداء عدة خطوات غسل أساسا بواسطة الطرد المركزي، ومعلق الصفائح الدموية في وسط يحترم الشروط الدقيقة الفسيولوجية بما في ذلك درجة الحموضة، ودرجة حرارة وتركيز أيونات ثنائي التكافؤ ولكن يؤكد عدم وجود بروتينات البلازما. هذه هي ميزة هذه التقنية على الطرق البديلة مثل الترشيح هلام فيها القضاء على compon البلازماالوالدان لا تحدث 25.

جميع خطوات إجراء الغسيل ذات أهمية حاسمة للحصول على نتائج قابلة للتكرار عند استخدام الصفائح الدموية غسلها. هناك عدد هائل من الأدوية قد تؤثر على التفاعل الصفائح الدموية، وبالتالي فمن الضروري أن يطلب من المتطوعين الأصحاء أن لا تأخذ أي دواء لمدة 10 يوما على الأقل السابقة جمع الدم. وبالإضافة إلى ذلك، جمع الدم يتطلب أن تدفع الانتباه إلى تجنب الصدمة الوريد أو تدفق بطيء جدا لأن هذا قد يسبب توليد الثرومبين والصفائح الدموية لاحق تفعيل 22. وعلى نفس المنوال، وتفعيل الصفائح الدموية المحتملين خلال الطرد المركزي وغسل الخطوات التي يمكن تجنبها من خلال الاستخدام المتكرر للPGI 2. نظرا لاستقرارها منخفضة جدا، PGI 2 ينبغي أن يضاف إلى كل خطوة الغسيل مباشرة قبل كل الطرد المركزي. إعادة تعليق الصفائح الدموية في المخزن TA (في درجة الحموضة الفسيولوجية) التي تحتوي على آبيراز يضمن الردود الصفائح الدموية لا تزالسليم. وجود آبيراز في تعليق الصفائح الدموية ضروري للسماح تدهور ATP وADP للحفاظ على الصفائح الدموية من الحساسية من مستقبلاتها purinergic. كما Panx1 إشارات الطريق ينطوي على تنشيط مستقبلات P2X1 في الصفائح الدموية البشرية على تنشيط الكولاجين مستقبلات، واضاف نحن على نسبة عالية نسبيا من آبيراز (0.32 U / مل) إلى تعليق الصفائح الدموية من أجل تجنب P2X1 الحساسية 7. لتجنب densensitization مستقبلات purinergic أخرى في الصفائح الدموية، فإن تركيزات أقل من آبيراز تكون كافية 10.

على الرغم من أن إجراءات centrifugations وغسل مسلسل خطوات وعمالة كثيفة وتتطلب المزيد من الوقت، حصلت على الصفائح الدموية غسلها باستخدام هذا البروتوكول تقديم مصلحة استقرار أكبر في 37 ° C (5-8 ح) بالمقارنة مع الصفائح المستخدمة مباشرة من PRP (1 -3 ح). CAU ومع ذلك، ينبغي بذل خيار استخدام PRP أو الصفائح الدموية غسلهاtiously وينبغي أن تشمل اعتبارات مثل كمية الدم متاح للتجربة، ناهض لاستخدامها وكذلك مسألة التي سيتم تناولها. على سبيل المثال، على أنها ملزمة من الفيبرينوجين إلى تنشيط α2β3 integrins هو الآلية الرئيسية التوسط تراكم الصفائح الدموية، وغياب الفيبرينوجين في الصفائح الدموية غسلها قد تؤثر على رد الفعل. على وجه الخصوص، عند استخدام منبهات ضعيفة (مثل ADP) 13. هذه المشكلة هي أقل أهمية عند استخدام ناهض قوي، مثل الثرومبين أو الكولاجين، والتي هي في حد ذاتها قادرة على حمل الإفراج الفيبرينوجين من α-حبيبات. ومع ذلك، نضيف بشكل روتيني الفيبرينوجين خارجي إلى تعليق الصفائح الدموية البشرية غسلها من أجل زيادة السعة للاستجابة تجميع الناجمة عن الكولاجين.

وفي الختام، باستخدام الإنسان غسلها الصفائح الدموية وقياس العكر، وجدنا أن صبغة الطعام الرائعة الأزرق FCF، من خلال الآثار المثبطة على Panx1، يمثلالمانع المحتمل لوظائف الصفائح الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (310030_162579 / 1 إلى بريندا ريناتا كواك و320030_144150 إلى بيير فونتانا)، وكذلك من خلال منحة من مؤسسة القلب السويسري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) Roth 5949-29-1 danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) Sigma-Aldrich S1804 -
D(+)-glucose Sigma-Aldrich G8270 -
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 -
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 -
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014 -
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) Sigma-Aldrich S9638 -
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) Sigma-Aldrich M9272 -
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) Sigma-Aldrich 442909 danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) ThermoFisher Scientific  15630 -
human serum albumin CSL Behring 00257/374 -
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331 Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R Fisher Scientific - -
heparin Drosspharm AG/SA 20810
prostacyclin I2 (PGI2) Cayman 18220 -
apyrase from potatoes Sigma-Aldrich A6535 -
fibrinogen (Haemocomplettan) CSL Behring HS 73466011 -
thrombo-aggragometer SD-Medical SD-Innovation TA8V -
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) Sigma-Aldrich 80717 Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen Horm, Nycomed -
arachidonic acid Bio/Data corporation C/N 101297 -
cell counter Sysmex KX-21N Sysmex Digitana  - -
HEPES Gibco 15630-056 -
glass cuvettes SD-Innovation THCV1000 -
magnetic stirrers SD-Innovation THA100 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
  2. Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
  3. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  4. Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
  5. Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
  6. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
  7. Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
  8. Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
  9. Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
  10. Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
  11. Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
  12. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  13. Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
  14. Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
  15. Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
  16. Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
  17. Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
  18. Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
  19. Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
  20. Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
  21. Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
  23. Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
  24. European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
  25. Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).

Tags

الطب، العدد 122، تراكم الصفائح الدموية، وغسلها الصفائح الدموية، الكولاجين، وقياس العكر، Pannexin1، الزرقاء الرائعة FCF
قياس العكر غسلها لحقوق الإنسان الصفائح الدموية: تأثير من Pannexin1 المانع الزرقاء الرائعة FCF على تجميع الناجمة الكولاجين،
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molica, F., Nolli, S., Fontana, P.,… More

Molica, F., Nolli, S., Fontana, P., Kwak, B. R. Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation. J. Vis. Exp. (122), e55525, doi:10.3791/55525 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter