Summary
We beschrijven een eenvoudige methode voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door agonist-geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes metingen door turbidimetrie. Als voorbeeld passen we deze methode voor het bestuderen van aggregatie van humane bloedplaatjes aan collageen na voorincubatie met Pannexin1 kanaal remmer Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetrie is een laboratorium techniek die wordt toegepast op de aggregatie van bloedplaatjes gesuspendeerd in hetzij plasma (bloedplaatjes-rijk plasma, PRP) of in buffer (gewassen bloedplaatjes) meten met behulp van een of een combinatie van agonisten. Het gebruik van gewassen bloedplaatjes gescheiden van hun plasma omgeving en in de afwezigheid van anticoagulantia zorgt voor het bestuderen van de intrinsieke bloedplaatjes eigenschappen. Onder het grote paneel agonisten, arachidonzuur (AA), adenosine di fosfaat (ADP), trombine en collageen zijn de meest gebruikte. De aggregatie respons wordt gekwantificeerd door meting van de relatieve optische dichtheid (OD) in de tijd van bloedplaatjes suspensie onder voortdurend roeren. Bloedplaatjes in homogene suspensie beperking van de doorgang van licht na de toevoeging van een agonist, treedt bloedplaatjes vormverandering produceren een kleine tijdelijke stijging van OD. Na deze eerste activeringsstap bloedplaatjes stolsels vormen geleidelijk, waardoor de doorgang van licht door de suspensie als een result verminderde OD. De aggregatie uiteindelijk uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de OD van bloedplaatjes-arm plasma of buffer. Strenge kalibratie is dus essentieel bij het begin van elk experiment. In het algemeen: 0% kalibratie wordt door meting van de OD van niet-gestimuleerde bloedplaatjes suspensie tijdens het meten van de OD van het suspensiemedium dat geen bloedplaatjes een waarde van 100% ingesteld. Plaatjesaggregatie wordt meestal voorgesteld als een real-time aggregatie curve. Turbidimetrie is een van de meest gebruikte laboratoriumtechnieken voor het onderzoek van de bloedplaatjes functie en wordt beschouwd als de historische gouden standaard en gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe farmaceutische middelen die gericht zijn op het remmen van de aggregatie van bloedplaatjes. We beschrijven gedetailleerde protocollen 1) Bereiding van humane plaatjes gewassen en 2) turbidimetrische analyse van door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke bloedplaatjes gewassen voorbehandeld met de voedselkleurstof Brilliant Blue FCF die onlangs identiteit wastificeerd als een remmer van Pannexin1 (Panx1) kanalen.
Introduction
Bloedplaatjes zijn essentiële bestanddelen van het bloed en hun belangrijkste functie-met-stollingsfactoren te stoppen met bloeden na bloedvat letsel. Bloedplaatjes zijn kleine (2-3 um) kernloze fragmenten verkregen van megakaryocyten van het beenmerg 1. Trombocyten circuleren in niet-geactiveerde toestand, waarbij ze als lensvormig structuren. Bij onderbreking van het endotheel, bloedplaatjes verzamelen op de site van bloedvat letsel aan het gat, een proces genaamd primaire hemostase plug. Aanvankelijk bloedplaatjes hechten aan sub-endotheliale moleculen zoals collageen en von Willebrand factor, die blootgesteld zijn als gevolg van de schade-adhesie stap 2. Vervolgens zij vorm veranderen en uitscheiden chemische boodschappers-activeringsstap. Tot slot hebben ze met elkaar te verbinden door het overbruggen van receptoren-aggregatie stap. Primaire hemostase wordt gevolgd door een secundair proces waarbij activering van de stollingscascade met fibrine depositie, welke stabiliserenTussen de eerste trombus 2.
Acute ischemische gebeurtenissen zoals myocardinfarct 3 meestal het gevolg van trombi die worden gevormd door fysische verstoring (breuk) van een atherosclerotische plaque. Huidige anti-bloedplaatjes geneesmiddelen zijn de hoeksteen van de behandeling van deze wijdverspreide ziekte, maar hun klinisch voordeel wordt beperkt door een verhoogd risico op bloedingen. De meest voorgeschreven medicijnen cardiovasculaire patiënten, aspirine en anti-P2Y12 verbindingen, richten de tromboxaan A2 en ADP paden 4 getoond, die de belangrijkste routes die tot bloedplaatjes activering. Echter, innovatief onderzoek naar nieuwe targets die optimaal antitrombotische effecten en hemorragische risico zou in evenwicht te brengen is nog steeds noodzakelijk.
Vanaf de jaren 1960 5 tot vandaag, heeft turbidimetrische aggregometrie een cruciale rol in het onderzoek gespeeld, het verbeteren van onze kennis van bloedplaatjes reactiviteit en in de monitoring van de potentie van anti-trombotische reagentia bij de mens. Turbidimetrie werd aanvankelijk toegevoerd aan PRP geëxtraheerd uit bloedmonsters. Inderdaad, bloedafname uitgevoerd in buisjes die citraat maakt een snelle en grote productie van PRP zonder enig effect op bloedplaatjes integriteit en functie. De stabiliteit op korte termijn (ongeveer 3 h) van PRP en de resterende plasmatische enzymen, zoals trombine, en de lage calciumconcentratie in verband met mogelijk artefact aggregatie profielen van groot ongemak voor de toepassing van PRP. Een belangrijke stap voorwaarts is de ontwikkeling van een methode voor bloedplaatjes isoleren met extra centrifugeren en wassen stappen 6 geweest. Kortom, PRP geïsoleerd uit volbloed on zuur-citraat-dextrose (ACD) en bloedplaatjes worden geïsoleerd na seriële centrifugatiestappen alvorens opnieuw gesuspendeerd in een iso-osmotische fosfaatbuffer (Tyrode's buffer) bevattende glucose, humaan serumalbumine en tweewaardige caties (Ca 2+ en Mg 2+). Om veranderingen in de bloedplaatjes reactiviteit te vermijden, wordt de pH van buffer Tyrode zorgvuldig bewaard bij 7,35-7,4. Bovendien wordt ongewenste activering van bloedplaatjes voorkomen door toevoeging van prostacycline (PGI2) vóór sommige centrifugatiestappen. Tenslotte toevoeging van apyrase gewassen plaatjes verhindert van resistent tegen de werking van ATP / ADP. De verkregen suspensie van bloedplaatjes mist coagulant factoren en de stabiliteit van bloedplaatjes met ten minste twee maal in vergelijking met PRP oplossingen. Bovendien, het feit dat bloedplaatjes inactief maar intact garandeert de reproduceerbaarheid van turbidimetrische metingen en biedt de mogelijkheid om de werking van agonisten of antagonisten van bloedplaatjesaggregatie optimaal bestuderen.
Met deze methode, hebben we in een recent onderzoek dat remmen van de vorming van Panx1 kanalen van een genetische benadering (knock-out-muizen) of verlagen Panx1 kanaalactiviteit met farmacologischebenaderingen verlaagde collageen-geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie 7. Panx1 vormt ATP-afgifte kanalen, die alom tot expressie worden gebracht op vele celtypen waaronder menselijke bloedplaatjes 7, 8. In feite hebben we gedemonstreerd door turbidimetrie menselijke gewassen bloedplaatjes dat een 7 min voorincubatie met een panel van meer of minder specifieke chemische blokkers (probenecide, mefloquine en 10 Panx1 peptiden) voor de toevoeging van verschillende agonisten, remde het bijzonder collageen geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes terwijl bloedplaatjes reacties op AA en ADP niet werden getroffen. We hebben aangetoond dat ATP de afvoer via Panx1 kanalen specifiek ingrijpt in de GPVI signaleringsroute die leidt tot collageen-geïnduceerde aggregatie. Interessant meerdere FDA goedgekeurde verbindingen met toepassingen in andere ziekten (probenecid, mefloquine) invloed op de activiteit van Panx1 kanalen in bloedplaatjes. Aan de ene kant is dit opent nieuwe therapeutische perspectieven te selecterenively wijzigen bloedplaatjes reactiviteit. Aan de andere kant moet men mogelijke secundaire effecten van deze verbindingen te overwegen. In dit verband heeft de veilige voedselkleurstof Brilliant Blue FCF gebruikt op diverse snoep en energiedranken is beschreven als een selectieve remmer van Panx1 9. We beschrijven hier een protocol voor de isolatie van menselijke gewassen bloedplaatjes en turbidimetrische metingen van bloedplaatjesaggregatie ingericht om het effect van Brilliant Blue FCF kleurstof als een antagonist van plaatjesaggregatie onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vijf ongerelateerde gezonde vrijwilligers werden gerekruteerd voor het nemen van bloedmonsters voor bloedplaatjes isolatie en aggregatie testen. Schriftelijke informed consent werd verkregen en het protocol werd goedgekeurd door de centrale ethische commissie van de Universiteit van Genève Ziekenhuizen. Alle vrijwilligers gecertificeerd om gezond te zijn en hebben geen bloedplaatjes storende drugs genomen tijdens ten minste de 10 dagen voorafgaand aan de experimenten.
1. Buffer Voorbereiding voor Human Collection Blood and Gewassen bloedplaatjes Isolation
- Bereid een 100 ml waterige oplossing van zuur-citraat-dextrose (ACD) door het oplossen van 1,4 g citroenzuurmonohydraat (C 6 H 8 O 7 • H2O, 66,6 mmol), 2,5 g trinatriumcitraat dihydraat (Na 3C 6H 5 7 O • 2 H2O, 85 mM) en 2 g watervrij D (+) - glucose. De pH van de oplossing is ongeveer 4,5.
- Bereid voorraad oplossingen voor buffer Tyrode als volgt
- Bereid voorraadoplossing 1 door oplossen van 80 g NaCl, 2 g KCI, 10 g NaHCO3 en 0,58 g NaH 2PO 4 * H2O in 500 ml gedestilleerd H2O De respectievelijke eindconcentraties zijn 2,73 M, 53,6 mmol, 238 mM en 8,4 mM. Bewaar de oplossing bij 4 ° C.
- Bereid voorraadoplossing 2 door het oplossen van 10,15 g MgCl2 * 6 H2O (100 mmol) in 500 ml gedestilleerd H2O Bewaar oplossing bij 4 ° C.
- Bereid voorraadoplossing 3 door het oplossen van 10,95 g (100 mmol) CaCl2 * 6 H2O in 500 ml gedestilleerd H2O Bewaar oplossing bij 4 ° C.
- Bereid Tyrode-buffer door verdunning van 2,5 ml voorraadoplossing 1 in een eindvolume van 50 ml met gedestilleerd H2O Dit correspondeert met eindconcentraties van 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mmol NaHCO3 en 0,42 mM NaH 2PO 4 * H2O een pH 7,35 en steriliseer filtering met 0,22 um filters.
- Bereid Tyrode-albumine 0,35% buffer (TA buffer 7) door het verdunnen 5 ml voorraadoplossing 1, 1 ml voorraadoplossing 2, 2 ml voorraadoplossing 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml 200 g / l humaan serumalbumine en 0,1 g watervrij D (+) - glucose in een eindvolume van 100 ml gedestilleerd H2O
- Breng de pH op 7,35 met 1 N HCl ingesteld en de osmolariteit tot 295 mOsm / l door toevoeging van gedestilleerd H2 O (10% van het totale volume). Eindconcentraties in deze oplossing zijn: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCI, 10,82 mmol NaHCO3, 0,38 mM NaH 2PO 4 * H2O, 0,91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1,82 mM CaCl2 * 6 H2O . Houd TA buffer bij 37 ° C gedurende het gehele experiment.
2. Bloedafname
- Verzamel 45-50 ml veneus bloed uit de antecubitale ader met behulp van een 19 G naald en geen of lage tourniquet, in 50 ml buizen conTaining ACD anticoagulant (1 volume ACD 6 volumina bloed). Gooi de eerste 1-2 ml bloed op de aanwezigheid van thrombine en weefselfactor voorkomen.
- Na het verzamelen, meng het bloed met de ACD door voorzichtig omkeren van de buis. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
3. Bereiding van menselijke Gewassen bloedplaatjes
- Verwarm de centrifuge tot 37 ° C. Alle centrifugatiestappen hieronder worden uitgevoerd bij deze temperatuur.
- Verzending van de verzamelde bloed in buizen van 15 ml (5 ml per buis) en gecentrifugeerd bij 250 xg gedurende 13 min PRP verkrijgen.
Opmerking: Deze centrifugatiestap resulteert in de productie van drie lagen in de steekproef: 1) De bovenlaag, bestaande uit plasma, bloedplaatjes, en een klein deel van de witte bloedcellen. 2) De tussenlaag een deel rijk aan witte bloedcellen. 3) De onderste laag, die in hoofdzaak bestaat uit rode bloedcellen. - Verzamel de PRP door pipetteren de bovenste layer voorzichtig in een nieuwe buis van 15 ml tot maximaal verontreiniging te voorkomen met rode en witte bloedcellen, en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Centrifugeer de PRP bij 2200 xg gedurende 12 min (5 ml PRP).
Opmerking: Deze centrifugatiestap worden uitgevoerd met lage rem of zonder rem. - Verwijder het supernatant (bloedplaatjes-arm plasma) en voorzichtig resuspendeer de pellet met 10 ml TA buffer met 2 pl / ml heparine (5000 U / ml) en 2,5 pl / ml 25 uM PGI2 met een plastic Pasteur pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 1900 xg (met lage rem of zonder rem).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 5 ml TA buffer die 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 met een plastic Pasteur pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Gedurende de incubatieperiode Pipetteer 150 ul van de suspensie in bloedplaatjeseen 1,5 ml buis en tel plaatjes, onder toepassing van een geautomatiseerde celteller (die detecteert de grootte van bloedcellen door het meten van de veranderingen in de gelijkstroom weerstand).
- Na 10 min incubatie, voeg 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 de bloedplaatjessuspensie en onmiddellijk gecentrifugeerd bij 1900 xg gedurende 8 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet tot een concentratie van 250.000 bloedplaatjes / ul met een adequaat volume van TA buffer (dat wil zeggen als het celgetal 500.000 per uL, resuspendeer in 10 ml TA buffer) met 32 ul / ml apyrase 0.01 U / mL (uiteindelijke concentratie 0,32 U / ml).
OPMERKING: Hoge concentratie van apyrase wordt gebruikt voor de desensibilisatie van P2X1 receptoren geïnduceerd door spontane afscheiding van ATP 10, 11 bij afwezigheid van agonisten te voorkomen. Dit is belangrijk omdat collageen geïnduceerde responsen geïnduceerd door snelle paracriene / autocriene activering van P2X1 door ATP vrijgegeven frOM geactiveerde bloedplaatjes. Indien de plaatjes signaleringsroute behoud van P2X1 functie niet kritisch vereist, gebruikt 0,02 U / ml apyrase. Verschillende studies (besproken in Mahaut-Smith et al. 10) toonde dat 0,02 U / ml apyrase vermijdt ADP receptor P2Y1 desensitisatie met verwaarloosbare P2X1 reacties. - Incubeer de celsuspensie gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C alvorens de aggregometric metingen. Het preparaat is stabiel gedurende 5-8 uur.
4. aggregometrie
- Bereid fibrinogeen (56 mg / ml) in Tyrode's buffer.
- Pipet 260 pi bloedplaatjes suspensie in glazen cuvetten (figuur 1A; links cuvet) bevattende 10 pl van fibrinogeen (56 mg / ml) en een magnetische roerstaaf, daarna incubeer de suspensie gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C in incubatie onderhavige putjes in de aggregometer (figuur 1B en 1C).
- Pre-incubeer met de Panx1remmer Brilliant Blue FCF door toevoeging van 10 pi van een 2,8 mM of 28 mM voorraadoplossing (eindconcentratie 100 pM en 1 mM, respectievelijk) gedurende 7 minuten bij 37 ° C.
- Kalibreer de aggregometer een assumptive 100% aggregatiewaarde door meten van de OD van een cuvette die 10 pi fibrinogeen (56 mg / ml), 10 pl Brilliant Blue FCF (2,8 mM of 28 mM) en TA buffer zonder bloedplaatjes.
- Plaats de cuvette in een combinatie goed onder automatisch roeren en op de betreffende toets op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer (dwz druk op F1 als aggregatie put 1 wordt gebruikt).
LET OP: Deze hieronder beschreven experiment omvat Brilliant Blue FCF. De verbinding voor kalibratie moet worden aangepast aan de experimentele conditie.
- Plaats de cuvette in een combinatie goed onder automatisch roeren en op de betreffende toets op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer (dwz druk op F1 als aggregatie put 1 wordt gebruikt).
- Kalibreer de aggregometer een assumptive 0% aggregatiewaarde door hetzelfde monster bloedplaatjes die wordt gebruikt voor het experiment onder automatische Stirring.
- Plaats de cuvette in de aggregatie goed en druk op de bijbehorende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer. Wacht ongeveer 20-30 s voordat u verder gaat. Deze vertraging dient om ervoor te zorgen dat er geen aggregatie gebeurt voordat u de agonisten.
OPMERKING: Aangezien verschillen in aantal plaatjes van invloed op de gemeten OD kan hebben, 0% ijkingsstap moet worden herhaald voor iedere afzonderlijke meting.
- Plaats de cuvette in de aggregatie goed en druk op de bijbehorende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer. Wacht ongeveer 20-30 s voordat u verder gaat. Deze vertraging dient om ervoor te zorgen dat er geen aggregatie gebeurt voordat u de agonisten.
- Voeg 20 ul van gewenste agonist, bijvoorbeeld 15 ug / ml collageen (1 ug / ml eind) en 1,125 mM arachidonzuur (75 pM uiteindelijk) in de cuvette. Onmiddellijk start de opname onder voortdurend roeren automatisch door op de betreffende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer.
LET OP: De toevoeging van de agonist induceert activering van bloedplaatjes. Bloedplaatjes aggregaten kan duidelijk worden onderscheiden in het glas cuvet aan het einde van het experiment (figuur 1A; right cuvet). - De opname stopt automatisch na 6 min. Op dit punt, de gegevens opslaan door te klikken op het icoon te redden van de computer.
Opmerking: De berekening van de snelheid van aggregatie wordt uitgevoerd door de computer, die de eindresultaten van het aggregatie proces als een percentage uitdrukt. - Analyseer de gegevens.
- Voor meer uitgebreide informatie over protocollen voor de bereiding van gewassen bloedplaatjes suspensies en turbidimetrische bepaling van bloedplaatjesaggregatie, verwijzen naar andere documenten geschreven door deskundigen op het gebied 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De aggregometer software produceert automatisch de aggregatie rondingen en geeft de waarden voor maximale aggregatie in percentage. De waarden kunnen met het oog op statistische analyses uit te voeren en te visualiseren maximale aggregatie waarden in de vorm van staafdiagrammen worden gekopieerd naar een data-analyse software. Eventueel kan elk individueel punt van de aggregatie krommen achtereenvolgens worden uitgevoerd in een spreadsheet software en statistische software (GraphPad bijvoorbeeld) om de krommen te visualiseren. Sommige onderzoekers gebruik maken van de maximale helling van de aggregatie curve van de snelheid en het gebied onder de curve te berekenen bloedplaatjes-activiteit te beoordelen. De vertragingstijd en vormverandering kan ook grafisch worden gevisualiseerd.
Een typisch voorbeeld van een combinatie curve van gewassen menselijke bloedplaatjes onder controle condities (H2O) wordt getoond in figuur 2A. Toevoeging van eengonist (collageen), geïnduceerd (na een korte vertraging) een verdieping in de aggregatie kromme als gevolg van de vormverandering van de bloedplaatjes. Dan is het percentage aggregatie geleidelijk toegenomen in de tijd, totdat een maximale waarde werd bereikt op ongeveer 3-4 min. Een lichte daling van het percentage aggregatie werd waargenomen aan het einde van de 6 min opname, die enige disaggregatie reflecteert. Zoals geïllustreerd in figuur 2A-B-incuberen menselijke gewassen bloedplaatjes met Panx1 kanaal remmer Brilliant Blue FCF, in een concentratie van 1 mM, vertraagd of volledig afgeschaft initiële bloedplaatjes vormverandering en geblokkeerd door collageen geïnduceerde aggregatie van gewassen plaatjes verkregen uit 5 verschillende niet-verwante gezonde vrijwilligers. Trombocyten waarbij voorgeïncubeerd met een lagere concentratie (100 uM) van Brilliant Blue FCF, het remmende effect van de kleurstof op de collageen geïnduceerde responsen en vormverandering niet meer waargenomen (zie figuur 2A voor een voorbeeld). Quantificatie van de bloedplaatjesaggregatie geïnduceerd door 1 ug / ml collageen bleek dat 1 mM Brilliant Blue FCF aanzienlijk verminderd maximale aggregatie responsen in vergelijking met controleomstandigheden en een lagere concentratie (100 uM) van Panx1 remmer (figuur 2C). Remming van bloedplaatjesaggregatie specifiek voor collageen-geïnduceerde responsen en niet als gevolg van ongewenste neveneffecten van Brilliant Blue FCF (op cellevensvatbaarheid, bijvoorbeeld) en dezelfde concentratie van de kleurstof (1 mM) beïnvloedde de aggregatie geïnduceerd door andere agonist, dat wil zeggen 75 uM AA, zoals weergegeven in figuur 2D. Deze resultaten bevestigen de specifieke rol van Panx1 kanalen in door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke bloedplaatjes responsen die wij en anderen hebben eerder aangetoond met andere farmacologische remmers van Panx1 zoals probenecide, mefloquine, en specifieke 10 Panx1 peptiden 7, 8.
Figuur 1: aggregometrie. (A) representatief beeld van glazen cuvetten (met een roerorgaan magneet) voor aggregometrie. De cuvette links toont rustende bloedplaatjes tijdens de cuvet rechts toont bloedplaatjes na collageen geïnduceerde activering. (B) representatief beeld van een 8-well aggregometer voor turbidimetrische metingen. De putjes gebruikt (asterisk) bloedplaatjes suspensies aanwezig in een glazen cuvet incuberen bij 37 ° C en die voor de metingen (witte pijl) zijn in C aangegeven Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien.
Figuur 2: een hoge concentratie van Brilliant Blue FCF Blokken activatie van bloedplaatjes in reactie op collageen. (A) Representatieve sporen van door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke gewassen bloedplaatjes verkregen uit dezelfde gezonde vrijwilligers (V1) onder controleomstandigheden (H2O; donkerblauw) of na 7 minuten voorincubatie met Panx1 remmer Brilliant Blue FCF 1 mM ( lichtblauw) of bij 100 uM (tussenproduct blauw). Aggregatie sporen werden geconstateerd gedurende 6 min. (B) Representatieve sporen van door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke gewassen bloedplaatjes verkregen uit 4 gezonde vrijwilligers (V2-V5) na 7 minuten voorincubatie met Panx1 remmer Brilliant Blue FCF (1 mM). (C) Kwantificering van de maximale aggregatie responsen van menselijke gewassen bloedplaatjes onder controle condities (witte balk) of na 7 minuten voorincubatie met Brilliant Blue FCF bij 100 uM (grijze staaf) of 1 mM (zwarte balk). N = 5. **** P0 0,0001; ANOVA gevolgd door Bonferroni post-test voor meervoudige vergelijking; De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (D) Representatieve sporen van AA-geïnduceerde aggregatie van menselijke gewassen bloedplaatjes verkregen van 5 gezonde vrijwilligers (V1-V5) na 7 minuten voorincubatie met Panx1 remmer Brilliant Blue FCF (1 mM). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is veel belangstelling voor het vinden van nieuwe geneesmiddelen in staat tot het moduleren van de functie van bloedplaatjes om trombose te voorkomen, zonder het verhogen van het risico van bloeden. Hiertoe kunnen in vitro laboratoriumtests die betrouwbaar en reproduceerbaar kunnen controleren aggregatie reacties bij menselijke bloedplaatjes absoluut noodzakelijk. Turbidimetrische aggregometrie is een eenvoudige techniek uit te voeren. Echter, moet een aantal voorzorgsmaatregelen in acht te worden gehouden. De metingen moeten worden uitgevoerd onder voortdurend roeren de aggregatie is grotendeels afhankelijk roeren. Het is ook belangrijk om de plaatjes bij een fysiologische temperatuur van 37 ° C om elk type voortijdige activering voorkomen houden. Voorafgaande activering van bloedplaatjes kan ook tijdens bloedafname en gewassen bloedplaatjes voorbereiding, wat leidt tot spontane aggregatie. Zo voorzichtig maatregelen moeten worden genomen tijdens de volledige procedure van bloedplaatjes voorbereiding.
Turbidimetrie is gebaseerd on de meting van de OD van de bloedplaatjessuspensie. Dit maakt de techniek niet geschikt voor aggregatie meting in volbloed als gevolg van de aanwezigheid van rode bloedcellen. Aldus kan turbidimetrie worden uitgevoerd alleen of PRP gewassen bloedplaatjes geïsoleerd uit PRP. Hoewel gemakkelijk te behandelen en vrij goedkoop is turbidimetrie erkend als ongevoelig voor de aanwezigheid van microaggregaten 14, 15. Wanneer microaggregaten verwachting van cruciaal belang zijn impedantie aggregometrie, die de variatie in elektrische weerstand meet wanneer bloedplaatjes hechten aan een elektrode ondergedompeld in een gecitreerd bloedmonster, geschikter 16. De bloedplaatjesaggregatie werkwijze is ook sterk afhankelijk bloedplaatjestelling in de plaatjessuspensie 17; flowcytometrie wordt gebruikt bij patiënten die lijden aan thrombocytopenie 18, van wie het maximum aantal bloedplaatjes datkan worden verkregen onvoldoende turbidimetrie. De algemene voordelen van troebelheid is dat het mogelijk een gedetailleerde analyse van plaatjesreactiviteit, zoals vormverandering en uiteenvallen, die niet in onbehandelde bloedmonsters kunnen worden beoordeeld.
Het is belangrijk te beseffen dat natuurlijke variatie in humane bloedplaatjes aggregatie bestaat als gevolg van verschillen in leeftijd, geslacht en levensstijl, evenals de gezondheidstoestand van de patiënt, waarvan de functie van de bloedplaatjes wordt betwist 19, 20, 21. Dergelijke natuurlijke variatie kan zijn in de orde van 10-20% in de turbidimetrische resultaten, dus zorg moeten worden genomen bij het uitvoeren en interpreteren van deze experimenten, bij het verkrijgen van bloedplaatjes uit een voldoende aantal niet-verwante gezonde vrijwilligers om betrouwbare statistieken mogelijk te maken. Deze beperking wordt echter gecompenseerd door het feit dat turbidimetrische metingen zeer reproduceerbare, tenminste als aggregatieprocedures zijn goed gestandaardiseerd laboratoria. Normalisatie-inspanningen zijn gedaan door de International Society op trombose en hemostase 22. Om deze reden, turbidimetrie is nog steeds de meest voorkomende test voor het meten van aggregatie van bloedplaatjes in zowel klinische en fundamentele wetenschap laboratoria en blijft een techniek van de keuze voor het bestuderen van het effect van geneesmiddelen op bloedplaatjes reacties.
In de huidige studie hebben we aangetoond, met behulp van turbidimetrie om de reacties in de menselijke gewassen bloedplaatjes te meten, dat een veelgebruikte levensmiddelen kleurstof Brilliant Blue FCF invloed op de aggregatie van bloedplaatjes. Elegant elektrofysiologisch onderzoek werd een specifieke blokkade van Panx1 kanalen onthuld door deze kleurstof 9, 23. Inderdaad, hoge concentraties (1 mM) van deze kleurstof vertoonden remmende effecten op zowel collageen veroorzaakte vormverandering en maximale aggregatie maar 10-voudig lagere concentraties (100 uM)van de kleurstof had geen invloed op de aggregatie van bloedplaatjes reactie. Overeenkomstig het wetenschappelijke advies over de herevaluatie van Brilliant Blue FCF (E133) als voedseladditief, gepubliceerd door de Europese Voedselautoriteit 24, de maximaal toelaatbare concentratie van Brilliant Blue FCF (molecuulgewicht = 792,84 g / mol) is 500 mg / kg voedsel. Voor H2O, zou dit overeenkomen met 0,63 mM, wat een 1,59-voudig lagere concentratie dan de remming door collageen geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie in onze experimenten. Aannemende dat slechts een klein deel van de kleurstof wordt geabsorbeerd in de darm na orale inname, en dat de kleurstof uiteindelijk wordt verdund in 5-L volume bloed van een volwassene, de dagelijkse inname van deze blauwe voedselkleurstof is waarschijnlijk naar de normale niveaus ruimschoots overschrijden voordat er neveneffecten op de trombocytenaggregatie kan worden verwacht. Mogelijke bijwerkingen van de hoogste concentratie van de kleurstof in onze experimenten op bloedplaatjes levensvatbaarheid, bijvoorbeeld, warenuitgesloten door de aanwezigheid van vaste aggregatie respons op een agonist (AA). Deze onaangetast AA reacties bevestigden ook dat de remmende effecten van Brilliant Blue FCF lijken te specifiek betrekking hebben op de collageen-signaleringsroute. Dit is in lijn met onze eerdere studie 7 waarin de specifieke plaats voor ATP afvoer via Panx1 kanalen in de collageen-geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie reactie.
Door aanpassing van het protocol van gewassen bloedplaatjes isolatie deze studie beschrijven we een eenvoudige en ongecompliceerde werkwijze voor het isoleren bloedplaatjes uit menselijk bloed. Na verscheidene wasstappen hoofdzaak uitgevoerd door centrifugatie worden bloedplaatjes geresuspendeerd in een medium dat precieze fysiologische omstandigheden zoals pH, temperatuur en is de concentratie van tweewaardige ionen respecteert maar verzekert de afwezigheid van plasma-eiwitten. Dit is een voordeel van deze techniek boven alternatieve werkwijzen zoals gelfiltratie, waarbij verwijdering van plasma compoents niet optreedt 25.
Alle stappen van het wassen van cruciaal belang zijn om reproduceerbare resultaten te verkrijgen bij het gebruik van gewassen bloedplaatjes. Een overvloed aan drugs kunnen bloedplaatjes reactiviteit beïnvloeden, dus is het essentieel dat de gezonde vrijwilligers worden gevraagd om geen medicatie te nemen voor ten minste 10 dagen voorafgaand aan de bloedafname. Daarnaast bloedafname noodzakelijk dat er aandacht wordt besteed aan de ader trauma of te langzaam stroom te vermijden omdat dit de generatie van trombine en de daaropvolgende activering van bloedplaatjes 22 kan veroorzaken. In dezelfde zin kunnen mogelijke activering van bloedplaatjes tijdens centrifugatie en wasstappen worden vermeden door het herhaald gebruik van PGI2. Vanwege de zeer lage stabiliteit moet PGI2 elke wasstap vlak voor elke centrifugering wordt toegevoegd. De resuspensie van bloedplaatjes in TA buffer (bij fysiologische pH) met apyrase zorgt bloedplaatjes reacties blijvenintact. De aanwezigheid van apyrase in de bloedplaatjessuspensie is essentieel voor de afbraak van ATP en ADP toelaten om bloedplaatjes behoeden een desensibilisatie van de purinerge receptoren. De Panx1 signaleringsroute omvat P2X1 receptor activatie in humane bloedplaatjes op collageen receptoractivering, voegden we een betrekkelijk hoge concentratie van apyrase (0,32 U / ml) aan de suspensie van bloedplaatjes om P2X1 desensibilisatie 7 voorkomen. Om densensitization andere purinerge receptoren in bloedplaatjes te voorkomen, zou lagere concentraties apyrase voldoende 10 te zijn.
Hoewel de werkwijze van seriële centrifugeren en wassen stappen zijn arbeidsintensief en vereisen meer tijd werd vastgesteld, gewassen plaatjes met dit protocol bieden het voordeel van een hogere stabiliteit bij 37 ° C (5-8 uur) vergeleken met plaatjes direct gebruikt van PRP (1 -3 h). Echter, de keuze van het gebruik PRP of gewassen plaatjes worden cautiously en omvat onder andere overwegingen zoals de hoeveelheid bloed beschikbaar voor het experiment, de agonist eveneens worden gebruikt als de vraag die wordt behandeld. Bijvoorbeeld als binding van fibrinogeen aan geactiveerde α2β3 integrine is het belangrijkste mechanisme medieert bloedplaatjesaggregatie, zonder fibrinogeen gewassen bloedplaatjes kan de reactie beïnvloeden; in het bijzonder bij zwakke agonisten (bijvoorbeeld ADP) gebruikt 13. Dit probleem is minder kritisch wanneer een krachtige agonist wordt gebruikt, zoals trombine en collageen, die in staat zijn de afgifte van fibrinogeen uit α-granules induceren op zichzelf. Toch hebben we routinematig voegen exogeen fibrinogeen aan het gewassen menselijke bloedplaatjes suspensie teneinde de amplitude van de aggregatie geïnduceerd door collageen verhogen.
Tot slot, door het gebruik van menselijke gewassen bloedplaatjes en troebelheid, we vonden dat het voedsel kleurstof Brilliant Blue FCF, door zijn remmende effecten op Panx1, vertegenwoordigteen mogelijke remmer van de plaatjesfunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (310030_162579 / 1 tot Brenda Renata Kwak en 320030_144150 Pierre Fontana), alsmede door een subsidie van de Zwitserse Hartstichting.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E.
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
