Summary
Vi beskriver en enkel metod för isolering av tvättade blodplättar från humant blod följt av agonist-framkallad blodplättsaggregation mätningar genom turbidimetri. Som ett exempel vi tillämpa denna metod för att studera aggregeringen svaret hos humana blodplättar till kollagen efter en förinkubation med Pannexin1 kanalhämmare Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetri är en laboratorieteknik, som appliceras för att mäta aggregation av blodplättar suspenderade i antingen plasma (blodplättsrik plasma, PRP) eller i buffert (tvättade trombocyter), genom användning av en eller en kombination av agonister. Användningen av tvättade blodplättar separerade från sin plasma miljö och i frånvaro av antikoagulanter gör för att studera inneboende egenskaper trombocyter. Bland det stora panel av agonister, arakidonsyra (AA), adenosin di-fosfat (ADP), trombin och kollagen är den mest använda. Aggregationen svar kvantifieras genom mätning av den relativa optiska densiteten (OD) över tiden av blodplättssuspension under kontinuerlig omröring. Trombocyter i homogen suspension begränsa passagen av ljus efter tillsats av en agonist, inträffar blodplättsformförändring producerar en liten övergående ökning av OD. Efter denna första aktiveringssteg, blodplättsproppar bildar gradvis, vilket tillåter passagen av ljus genom suspensionen som en result av minskade OD. Aggregationsprocessen slutligen uttryckt i procent, jämfört med OD av blodplättsfattig plasma eller buffert. Rigorös kalibrering är därför viktigt i början av varje experiment. Som en allmän regel: kalibrering till 0% ställs in genom att mäta OD av en blodplättssuspension icke-stimulerade under mätning av OD av suspensionsmedium innehållande inga trombocyter representerar ett värde på 100%. Trombocytaggregation allmänhet visualiseras som en realtids-aggregering kurvan. Turbidimetri är en av de vanligaste laboratorietekniker för undersökning av blodplättfunktionen och anses vara den historiska guldstandard och används för att utveckla nya läkemedel för att hämma trombocytaggregation. Här beskriver vi detaljerade protokoll för en) beredning av humant tvättade blodplättar och 2) turbidimetrisk analys av kollagen-inducerad aggregation av humana tvättade blodplättar som förbehandlats med maten färgämnet Brilliant Blue FCF som var nyligen identified som en hämmare av Pannexin1 (Panx1) kanaler.
Introduction
Trombocyter är avgörande komponenter i blodet och deras huvudsakliga funktions tillsammans med koagulationsfaktorer-is för att stoppa blödning efter blodkärlsskada. Trombocyter är små (2-3 um) anuclear fragment härledda från megakaryocyter i benmärgen 1. Trombocyter cirkulera i icke-aktiverat tillstånd, under vilket de uppträder som linsformade strukturer. Vid avbrott i endotel, trombocyter samlas till platsen för blodkärlsskada att plugga hålet, en process som kallas primär hemostas. Initialt, blodplättar fäster vid sub-endoteliala molekyler, såsom kollagen och von Willebrand-faktor, som är exponerade som ett resultat av skadan-vidhäftningssteget 2. Sedan de ändra form och utsöndrar kemiska budbärare-aktiveringssteg. Slutligen de ansluter till varandra genom att överbrygga receptorer-aggregering steg. Primär hemostas följs av en sekundär process som involverar aktivering av koagulationskaskaden med fibrinavsättning, som stabiliserars det initiala tromben 2.
Akuta ischemiska händelser såsom hjärtinfarkt 3 beror ofta på tromber som bildar grund av fysiska avbrott (brott) av ett aterosklerotiskt plack. Nuvarande trombocythämmande läkemedel är hörnstenen i behandlingen av denna folksjukdom men deras kliniska nyttan är begränsad av en ökad risk för blödning. De mest förskrivna läkemedlen i kardiovaskulära patienter, aspirin och anti-P2Y12 föreningar, rikta tromboxan A2 och de ADP banorna 4, respektive, vilka är de huvudsakliga vägar som leder till blodplättsaktivering. Det är dock fortfarande nödvändigt innovativ forskning mot nya mål som optimalt skulle balansera antitrombotiska effekter och hemorragisk risk.
Från 1960-talet 5 till idag, har turbidimetrisk aggregometri spelat en avgörande roll inom forskning, öka vår kunskap om trombocytreaktivitet och jagn övervakning av styrkan av antitrombotiska reagens i människor. Turbidimetri applicerades initialt till PRP extraherades från blodprover. Indeed, bloduppsamling utfördes i rör innehållande citrat möjliggör snabb och stor produktion av PRP utan att ha någon effekt på blodplätts integritet och funktion. Emellertid, den kortsiktiga stabilitet (ca 3 h) hos PRP och de återstående plasmatiska enzymer, såsom trombin, och kalciumkoncentrationen låg förknippas med potentiellt artefactual aggregering profiler av stora olägenheter för användningen av PRP. Ett viktigt steg framåt har varit utvecklingen av en metod för isolering av blodplättar med ytterligare centrifugering och tvätt steg 6. Kort sagt, är PRP isolerades från helblod uppsamlades på syra-citrat-dextros (ACD) och blodplättar isolerades efter seriell centrifugeringssteg innan de återsuspenderades i en iso-osmotisk fosfatbuffert (Tyrodes buffert) innehållande glukos, humant serumalbumin och tvåvärd cations (Ca2 + och Mg2 +). För att undvika förändringar i trombocytreaktivitet pH av Tyrodes buffert noggrant hålls på 7,35-7,4. Dessutom är oönskad aktivering av trombocyter förhindras genom tillsats av prostacyklin (PGI 2) innan några centrifugeringssteg. Slutligen tillsats av apyras förhindrar tvättade blodplättar från att bli resistent mot verkan av ATP / ADP. Den resulterande blodplättssuspension saknar koagulerande faktorer och stabiliteten av blodplättar ökar med åtminstone två-faldigt jämfört med PRP-lösningar. Dessutom det faktum att blodplättar är inaktiva men intakta optioner reproducerbarheten av turbidimetriska mätningar och ger förmågan att studera verkan av agonister eller antagonister av blodplättsaggregation på ett optimalt sätt.
Användning av denna metod har vi visat i en färsk studie att inhibera bildningen av Panx1 kanaler av en genetisk strategi (knock-out-möss) eller minska Panx1 kanalaktivitet genom farmakologisknärmar reducerad kollageninducerad trombocytaggregation 7. Panx1 bildar ATP-frisättning kanaler, som ubiquitously uttrycks i många celltyper inkluderande humana trombocyter 7, 8. I själva verket, vi visat genom turbidimetri på human tvättade blodplättar som en 7 min förinkubation med en panel av mera eller mindre specifika kemiska blockerare (probenecid, meflokin och 10 Panx1 peptider) före tillsats av olika agonister, inhiberade specifikt kollageninducerad trombocytaggregation medan blodplättar svar på AA och ADP inte påverkades. Vi visat att ATP-frisättning genom Panx1 kanaler specifikt interfererar i GPVI signalväg som leder till kollagen-inducerad aggregation. Interestingly, multipla FDA-godkända föreningar med tillämpningar inom andra sjukdomar (probenecid, meflokin) påverka aktiviteten hos Panx1 kanaler i trombocyter. Å ena sidan, öppnar detta nya terapeutiska perspektiv att väljaively modifiera blodplätts reaktivitet. Å andra sidan, bör man överväga eventuella bieffekter av dessa föreningar. I detta sammanhang, den säkra livsmedel färgämnet Brilliant Blue FCF används i multipla karameller och energidrycker har beskrivits som en selektiv hämmare av Panx1 9. Vi beskriver här ett protokoll för isoleringen av humana tvättade blodplättar och turbidimetriska mätningar av trombocytaggregation anpassad att undersöka effekten av den Brilliant Blue FCF färgämne som en antagonist av trombocytaggregation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fem obesläktade friska försökspersoner rekryterades för blodprovstagning för trombocyter isolering och aggregering tester. Skriftligt informerat samtycke erhölls och protokollet godkändes av Central etikkommitté Genève universitetssjukhus. Alla volontärer certifierade att vara frisk och har inte tagit några blodplätts störande droger under minst 10 dagar före experimenten.
1. Buffert Förberedelse för humant blod Insamling och Washed Platelet Isolering
- Bered en 100 ml vattenlösning av syra-citrat-dextros (ACD) genom upplösning av 1,4 g citronsyramonohydrat (C 6 H 8 O 7 • H2O, 66,6 mM), 2,5 g trinatriumcitrat-dihydrat (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H2O, 85 mM) och 2 g vattenfri D (+) - glukos. PH-värdet hos lösningen är ca 4,5.
- Bered stamlösningar för Tyrodes buffert enligt följande
- Bereda stamlösning 1 genom upplösning av 80 g NaCl, 2 g KCl, 10 g NaHCO 3 och 0,58 g NaH 2 PO 4 * H2O i 500 ml destillerat H 2 O. De respektive slutkoncentrationer är 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM och 8,4 mM. Hålla lösningen vid 4 ° C.
- Bereda stamlösning 2 genom att lösa 10,15 g MgCl2 * 6 H2O (100 mM) i 500 ml destillerat H2O Håll lösningen vid 4 ° C.
- Bereda stamlösning 3 genom upplösning av 10,95 g (100 mM) CaCl 2 * 6 H2O i 500 ml destillerat H2O Håll lösningen vid 4 ° C.
- Förbereda Tyrodes buffert genom att späda 2,5 ml av stamlösning 1 i en slutlig volym av 50 ml med destillerat H2O Detta motsvarar slutliga koncentrationer av 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCOs 3 och 0,42 mM NaH 2 PO 4 * H 2 O. Justera pH till 7,35 och sterilisera genom filtrering med 0,22-um filters.
- Förbereda Tyrodes albumin 0,35% buffert (TA-buffert 7) genom att späda 5 ml stamlösning 1, 1 ml stamlösning 2, 2 ml stamlösning 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml 200 g / L humant serumalbumin och 0,1 g vattenfri D (+) - glukos i en slutlig volym av 100 ml destillerat H2O
- Justera pH till 7,35 med 1 N HCl och ställa in osmolariteten till 295 mOsm / L genom att tillsätta destillerat H2O (10% av total volym). Slutkoncentrationer i denna lösning är: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCOa 3, 0,38 mM NaH 2 PO 4 * H2O, 0,91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1,82 mM CaCb 2 * 6 H2O . Håll TA-buffert vid 37 ° C under hela experimentet.
2. Blod Collection
- Samla 45-50 ml venöst blod, från antekubitalvenen med användning av en 19 G nål och ingen eller låg tryckförband, i 50 ml rör conTaining ACD antikoagulantia (1 volym ACD för 6 volymer blod). Kassera den första 1-2 ml blod för att undvika närvaro av trombin och vävnadsfaktor.
- Efter uppsamling, blanda blodet med ACD genom att försiktigt vända röret. Inkubera provet under 10 min vid 37 ° C.
3. Framställning av humant Tvättade blodplättar
- Förvärm-centrifug till 37 ° C. Alla centrifuge stegen nedan utförs vid denna temperatur.
- Sända det uppsamlade blodet i 15 ml rör (5 ml per rör) och centrifugera vid 250 xg under 13 minuter för att erhålla PRP.
Denna centrifugeringssteg resulterar i produktionen av tre skikt i provet:: OBS 1) Det övre skiktet, som består av plasma, blodplättar, och en liten fraktion av vita blodkroppar. 2) Det mellanliggande skiktet, en del rik på vita blodkroppar. 3) Det undre skiktet, som i huvudsak är sammansatt av röda blodkroppar. - Samla PRP genom att pipettera den övre layer försiktigt i ett nytt 15 ml rör för att maximalt förhindra kontaminering med röda och vita blodkroppar, och inkubera i 10 min vid 37 ° C.
- Centrifugera PRP vid 2200 xg under 12 min (för 5 ml PRP).
OBS: Denna centrifugeringssteget ska utföras med låg broms eller utan broms. - Avlägsna supernatanten (blodplättsfattig plasma), och försiktigt återsuspendera pelleten med 10 ml TA-buffert innehållande 2 | il / ml heparin (5000 U / ml) och 2,5 pl / ml av 25 | iM PGI 2 med användning av en plast Pasteurpipett. Inkubera i 10 min vid 37 ° C.
- Lägga 2,5 pl / ml av 25 | iM PGI 2 och centrifugera i 8 min vid 1900 xg (med lågt broms eller utan broms).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 5 ml TA-buffert innehållande 2,5 pl / ml av 25 | iM PGI 2 med användning av en plast Pasteur-pipett. Inkubera i 10 min vid 37 ° C.
- Under inkubationsperioden, pipettera 150 mikroliter av blodplättssuspension itill ett 1,5 ml rör och räkna blodplättar, med användning av en automatiserad cellräknare (som detekterar storleken på blodceller genom att mäta förändringar i likströmsmotstånd).
- Efter 10 min inkubation, tillsätt 2,5 | il / ml 25 ^ M PGI 2 till blodplättssuspensionen och centrifugera omedelbart vid 1900 xg under 8 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten till en koncentration av 250.000 trombocyter / | al med en adekvat volym av TA-buffert (dvs om cellantalet är 500 tusen per pl, återsuspendera i 10 ml TA-buffert) innehållande 32 | il / ml apyras vid 0,01 U / ml (slutlig koncentration 0,32 U / ml).
OBS: Hög koncentration av apyras används för att undvika desensibilisering av P2X1-receptorer inducerade av spontan utsöndring av ATP 10, 11 i frånvaro av agonister. Detta är viktigt eftersom kollagen inducerade responser induceras av snabb parakrin / autokrin aktivering av P2X1 genom ATP släppt frabout aktiverade blodplättar. Om blodplätts signalväg inte kritiskt kräver bevarande av P2X1-funktion, använder 0,02 U / ml apyras. Flera studier (översikt i Mahaut-Smith et al. 10) visade att 0,02 U / ml apyras undviker ADP-receptorn P2Y1 desensibilisering med försumbara P2X1 svar. - Inkubera cellsuspensionen under minst 30 min vid 37 ° C innan utför aggregometric mätningar. Beredningen är stabil i 5 till 8 timmar.
4. aggregometri
- Framställa fibrinogen (56 mg / ml) i Tyrodes buffert.
- Pipettera 260 mikroliter av blodplättssuspension i glas kyvetter (Figur 1A; vänster kyvett) innehållande 10 mikroliter av fibrinogen (56 mg / ml) och en magnetisk omrörarstav, sedan inkubera suspensionen till 2 - 3 min vid 37 ° C i inkubations brunnar närvarande i aggregometer (Figur 1B och 1C).
- Pre-inkubera med Panx1inhibitor Brilliant Blue FCF genom tillsats 10 | il av en 2,8 mM eller 28 mM stamlösning (slutkoncentration 100 | iM och 1 mM, respektive) för 7 min vid 37 ° C.
- Kalibrera aggregometer till en assumptive 100% aggregering värde genom att mäta OD av en kyvett innehållande 10 mikroliter fibrinogen (56 mg / ml), 10 | il Brilliant Blue FCF (2,8 mM eller 28 mM) och TA-buffert utan trombocyter.
- Placera kuvetten i en aggregering väl under automatisk omrörning och tryck på motsvarande knapp på tangentbordet hos datorn kopplad till aggregometer (dvs. tryck F1 om aggregering väl en används).
OBS: Detta experiment som beskrivs nedan inkluderar Brilliant Blue FCF. Den förening som används för kalibrering måste justeras till försöksbetingelserna.
- Placera kuvetten i en aggregering väl under automatisk omrörning och tryck på motsvarande knapp på tangentbordet hos datorn kopplad till aggregometer (dvs. tryck F1 om aggregering väl en används).
- Kalibrera aggregometer till en assumptive 0% aggregering värde genom användning av samma blodplätts prov som kommer att användas för experimentet enligt automatiska stirring.
- Placera kyvetten i aggregering väl och tryck på motsvarande knapp på tangentbordet på datorn kopplad till aggregometer. Vänta ca 20-30 s innan du fortsätter. Denna fördröjning tjänar till att säkerställa att ingen aggregation händer innan du lägger till agonister.
OBS: Som någon skillnad i blodplätts antal kan ha en effekt på den uppmätta OD, behöver kalibreringssteget 0% att upprepas för varje enskild mätning.
- Placera kyvetten i aggregering väl och tryck på motsvarande knapp på tangentbordet på datorn kopplad till aggregometer. Vänta ca 20-30 s innan du fortsätter. Denna fördröjning tjänar till att säkerställa att ingen aggregation händer innan du lägger till agonister.
- Lägga 20 mikroliter av önskad agonist, såsom 15 mikrogram / ml kollagen (1 ug / ml slutlig) eller 1,125 mM arakidonsyra (75 pM slutlig) i kyvetten. starta omedelbart inspelningen under kontinuerlig automatisk omrörning genom att trycka på motsvarande knapp på tangentbordet hos datorn kopplad till aggregometer.
OBS: Tillägget av agonisten inducerar trombocytaktivering. Blodplättsaggregat kan tydligt urskiljas i glas kyvetten vid slutet av experimentet (Figur 1A; right kyvett). - Inspelningen stoppas automatiskt efter 6 min. Vid denna punkt, spara data genom att klicka på ikonen spara på datorn.
OBS: Beräkningen av hastigheten för aggregering utförs av datorn, som uttrycker slutresultatet av aggregationen processen som ett procenttal. - Analysera data.
- För ytterligare omfattande information om protokoll för framställning av tvättade trombocyter suspensioner och turbidimetrisk mätning av trombocytaggregation, se andra papper författade av experter på området 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den aggregometer programvara producerar automatiskt aggregering kurvor och ger värdena för maximal aggregation i procent. Värdena kan kopieras till en dataanalysmjukvara för att utföra statistisk analys och visualisera maximal aggregering värden i form av stapeldiagram. Eventuellt kan varje enskild punkt i aggregering kurvorna exporteras successivt in i ett kalkylprogram och sedan till statistisk mjukvara (t.ex. GraphPad) för att visualisera kurvorna. Vissa forskare använder den maximala lutningen på aggregering kurvan för att beräkna hastigheten och området under kurvan för att bedöma trombocyter aktivitet. Den fördröjning och formförändringen kan också visualiseras grafiskt.
Ett typiskt exempel på en aggregering kurva av tvättade humana trombocyter enligt kontrollförhållanden (H 2 O) visas i Figur 2A. Tillsättning av engonist (kollagen), inducerade (efter en kort fördröjning) en fördjupning i aggregation kurvan som orsakas av formförändringen av blodplättarna. Därefter andelen aggregering gradvis under tiden tills ett maximalt värde nås vid ca 3-4 min. En liten minskning av andelen aggregering observerades mot slutet av den 6 min inspelning, vilket reflekterar en del disaggregering. Såsom illustreras i figur 2A-B, tvättades förinkubera mänskliga blodplättar med Panx1 kanalhämmare Brilliant Blue FCF, vid en koncentration av 1 mM, långsammare eller helt avskaffade den initiala blodplättsformförändring och blockerade kollagen-inducerad aggregation av tvättade blodplättar som erhållits från 5 olika obesläktade friska försökspersoner. När blodplättar där förinkuberade med en lägre koncentration (100 pM) av Brilliant Blue FCF, var den inhiberande effekten av färgämnet på kollagenframkallad svar och formförändring inte observeras längre (se Figur 2A för ett exempel). Quantifblue av de trombocytaggregationshämmande responser inducerade av 1 mikrogram / ml kollagen visade att 1 mM Brilliant Blue FCF signifikant minskade maximal aggregation responser jämfört med kontrollbetingelser såväl som till en lägre koncentration (100 pM) av Panx1 inhibitor (figur 2C). Hämning av trombocytaggregationen var specifik för kollagen-inducerade responser och inte på grund av oönskade biverkningar av Brilliant Blue FCF (på cellviabilitet, till exempel) som samma koncentration av färgämnet (1 mM) påverkade inte aggregering svaret som induceras av annan agonist, dvs. 75 pM AA, såsom visas i figur 2D. Dessa resultat bekräftar den specifika rollen av Panx1 kanaler i kollagenframkallad aggregation svar hos humana blodplättar som vi och andra tidigare har visat med andra farmakologiska hämmare av Panx1 såsom probenecid, meflokin, och de specifika 10 Panx1 peptiderna 7, 8.
Figur 1: aggregometri. (A) Representativa bild av glas kyvetter (innehållande en omrörningsmagnet) som används för aggregometri. Kyvetten till vänster visar vilande blodplättar medan kyvetten till höger illustrerar blodplättsaggregat efter kollagen-inducerad aktivering. (B) Representativa bild av en 8-brunnars aggregometer för turbidimetriska mätningar. Brunnarna används (asterisk) för att inkubera blodplätt suspensioner som är närvarande i en glaskuvett vid 37 ° C, och de som används för mätningarna (vit pil) indikeras i C. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: en hög koncentration av Brilliant Blue FCF Blocks Platelet aktivering som svar på kollagen. (A) Representativa spår av kollagen-inducerad aggregation av humana tvättade blodplättar erhållna från samma friska frivilliga (V1) under kontrollbetingelser (H 2 O; mörkblå) eller efter 7 min förinkubation med Panx1 inhibitorn Brilliant Blue FCF vid ett mM ( ljusblå) eller vid 100 | iM (mellanliggande blå färg). Aggregering spår registrerades under 6 min. (B) Representativa spår av kollagen-inducerad aggregation av humana tvättade blodplättar erhållna från 4 friska frivilliga (V2-V5) efter 7 min förinkubation med Panx1 inhibitorn Brilliant Blue FCF (1 mM). (C) Kvantifiering av maximal aggregation svaren av humana tvättade blodplättar under kontrollbetingelser (vit stapel) eller efter 7 min förinkubation med Brilliant Blue FCF på 100 pM (grå stapel) eller vid ett mM (svart stapel). N = 5. **** P0; 0,0001; ANOVA följt av Bonferroni post-test för multipel jämförelse; Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM. (D) Representativa spår av AA-inducerad aggregation av humana tvättade blodplättar erhållna från 5 friska frivilliga (V1-V5) efter 7 min förinkubation med Panx1 inhibitorn Brilliant Blue FCF (1 mM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett stort intresse för att hitta nya läkemedel som kan modulera blodplättarnas funktion för att förhindra trombos utan att öka risken för blödningar. För detta ändamål in vitro laboratorietester som tillförlitligt och reproducerbart kan övervaka aggregering svar i humana trombocyter är absolut nödvändiga. Turbidimetrisk aggregometri är en enkel teknik för att utföra. Men vissa försiktighetsåtgärder måste hållas i åtanke. Mätningarna måste utföras under kontinuerlig omröring som aggregering processen är till stor del beroende på omröring. Det är också viktigt att hålla blodplättarna vid en fysiologisk temperatur av 37 ° C för att undvika varje typ av för tidig aktivering. Föraktivering av trombocyter kan också förekomma under insamling blod och tvättade trombocyter förberedelser, vilket leder till spontan aggregation. Således noggranna åtgärder bör vidtas under hela förfarandet för förberedelse av blodplättar.
Turbidimetri bygger on mätningen av OD av blodplättssuspensionen. Detta gör tekniken olämplig för aggregering mätning i helblod på grund av närvaron av röda blodkroppar. Sålunda kan turbidimetri endast utföras på PRP eller tvättade blodplätt isolerade från PRP. Även lätt att hantera och ganska billig, har turbidimetri erkänts som okänslig för närvaron av mikroaggregat 14, 15. När mikroaggregat förväntas vara av kritisk betydelse, är impedans aggregometri, som mäter variationen i elektriskt motstånd när blodplättar vidhäftar till en elektrod nedsänkt i en citratbehandlat helblodprov, bättre lämpad 16. Trombocytaggregation Processen är också till stor del beroende av trombocytantal i blodplättssuspension 17; flödescytometri används hos patienter som lider av trombocytopeni 18, från vilken det maximala antalet blodplättar somkan erhållas är otillräcklig för turbidimetri. Emellertid är den allmänna fördelen med turbidimetri att den tillåter en detaljerad analys av blodplätts reaktivitet, såsom formförändring och disaggregation, som inte kan bedömas i helblodprover.
Det är viktigt att inse att naturlig variation i trombocytaggregation människa existerar beror på skillnader i ålder, kön och livsstil samt hälsostatus ämnet vars trombocytfunktionen utmanas 19, 20, 21. En sådan naturlig variation kan vara i storleksordningen 10-20% i turbidimetriska resultat, därför försiktighet bör iakttas, när de utför och tolkar dessa experiment att få blodplättar från tillräckligt många orelaterade friska frivilliga för att möjliggöra tillförlitlig statistik. Denna begränsning är emellertid uppvägs av det faktum att turbidimetriska mätningar är mycket reproducerbara, åtminstone när aggregeringprocedurer är väl standardiserade över laboratorier. Standardiseringsarbetet har gjorts av International Society of Thrombosis and Haemostasis 22. Av denna anledning är turbidimetri fortfarande den vanligast förekommande testet för mätning av trombocytaggregation i både kliniska och grundläggande tekniska laboratorier och förblir en teknik för val för att studera effekten av läkemedel på svar trombocyter.
I föreliggande studie har vi visat, med hjälp av turbidimetri att mäta svar i humana tvättade blodplättar, att ett vanligt förekommande livsmedelsfärg Brilliant Blue FCF påverkar trombocytaggregation. Eleganta elektrofysiologiska studier har avslöjat en specifik blockad av Panx1 kanalerna genom detta färgämne 9, 23. Indeed, höga koncentrationer (1 mM) av denna färgämne visade hämmande effekter på både kollageninducerad formförändringen och maximal aggregering men 10-faldigt lägre koncentrationer (100 pM)av färgämnet påverkade inte trombocytaggregationssvar. Enligt Vetenskapliga yttrande om omvärdering av Brilliant Blue FCF (E133) som livsmedelstillsats, utgiven av Europeiska livsmedelsmyndigheten 24, är den maximala tillåtna koncentrationen av Brilliant Blue FCF (molekylvikt = 792,84 g / mol) 500 mg / kg livsmedel. För H 2 O, skulle detta motsvara 0,63 mM, som är en 1,59-faldigt lägre koncentration än den inhiberande kollageninducerad trombocytaggregation i våra experiment. Om man antar att endast en liten del av färgen kommer att absorberas i tarmen efter oralt intag, och att färgen slutligen kommer att spädas i 5-L mängd blod av en vuxen person, troligen har det dagliga intaget av denna blå livsmedelsfärg att i stor utsträckning överskrider de normala nivåerna innan några biverkningar på trombocytaggregation kan förväntas. Möjliga biverkningar av den högsta koncentrationen av färgämnet i våra experiment på plätt viabilitet, till exempel, varuteslutas genom närvaron av fasta aggregering svar till en annan agonist (AA). Dessa opåverkade AA svar bekräftade också att inhibitoriska effekterna av Brilliant Blue FCF verkar specifikt involverar kollagen signalväg. Detta är i linje med vår tidigare studie 7 uppgifter om viss plats för ATP utsläpp genom Panx1 kanaler i kollageninducerad trombocytaggregation svar.
Genom att anpassa protokollet av tvättad isolering trombocyter denna studie beskriver vi en enkel och okomplicerad metod för att isolera blodplättar från humant blod. Efter flera tvättsteg utförs väsentligen genom centrifugering, är blodplättar återsuspenderades i ett medium som respekterar exakta fysiologiska tillstånd, inklusive pH, arbetstemperatur och koncentration av divalenta joner men försäkrar frånvaro av plasmaproteiner. Detta är en fördel med denna teknik jämfört med alternativa metoder, såsom gelfiltrering, i vilken elimineringen av plasma COMPONent förekommer inte 25.
Alla stegen i tvättförfarandet är av avgörande betydelse för att erhålla reproducerbara resultat vid användning av tvättade trombocyter. En uppsjö av läkemedel kan påverka trombocytreaktivitet, därför är det viktigt att friska frivilliga ombeds att inte ta någon medicin under minst 10 dagar före blodinsamling. Dessutom nödvändiggör bloduppsamling som betalade uppmärksamhet för att undvika venen trauma eller för långsam flöde eftersom detta kan orsaka generering av trombin och efterföljande trombocytaktivering 22. I samma riktning, kan potentiella blodplättsaktivering under centrifugering och tvättsteg undvikas genom upprepad användning av PGI 2. På grund av dess mycket låga stabilitet bör PGI 2 läggas till varje tvättsteg omedelbart före varje centrifugering. Resuspension av trombocyter i TA-buffert (vid ett fysiologiskt pH) innehållande apyras säkerställer att svaren plätts förblirintakt. Närvaron av apyras i blodplättssuspensionen är väsentlig för att tillåta nedbrytning av ATP och ADP för att bevara blodplättar från en desensibilisering av deras purinerga receptorer. Som Panx1 signaleringsvägen involverar P2X1-receptoraktivering i humana blodplättar vid kollagen-receptoraktivering, vi lagt till en relativt hög koncentration av apyras (0,32 U / ml) för att blodplättssuspensionen för att undvika P2X1 desensibilisering 7. Att undvika densensitization av andra purinerga receptorer i blodplättar, skulle lägre koncentrationer av apyras vara tillräcklig 10.
Även om förfarandet av seriella centrifuge och tvättsteg är arbetsintensiva och kräver mer tid, de tvättade trombocyterna erhölls med användning av detta protokoll erbjuder fördelen med högre stabilitet vid 37 ° C (5-8 h) i jämförelse med blodplättar som användes direkt från PRP (1 -3 h). Dock bör valet att använda PRP eller tvättade trombocyter Causer noga och bör innehålla överväganden som mängden blod för försöket att agonisten användas liksom den fråga som kommer att tas upp. Till exempel, såsom bindning av fibrinogen till aktiverade α2β3 integriner är den huvudsakliga mekanismen som medierar trombocytaggregation, frånvaro av fibrinogen i tvättade blodplättar kan påverka reaktionen; i synnerhet, när svaga agonister (såsom ADP) används 13. Detta problem är mindre kritisk när en kraftfull agonist används, såsom trombin eller kollagen, som är i sig själva kan inducera frisättningen av fibrinogen från a-granula. Fortfarande, vi rutinmässigt lägga exogent fibrinogen till den tvättade blodplättssuspensionen människa för att öka amplituden för den aggregering svaret inducerat av kollagen.
Sammanfattningsvis med mänsklig tvättade blodplättar och turbidimetri, fann vi att maten färgämnet Brilliant Blue FCF, genom dess hämmande effekt på Panx1 representeraren potentiell hämmare av trombocytfunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av anslag från den schweiziska National Science Foundation (310030_162579 / 1 till Brenda Renata Kwak och 320030_144150 till Pierre Fontana) samt av ett bidrag från den schweiziska Heart Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E.
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
